范藝周，駱思羽，朱浩偉，薛 珍，艾連中，熊智強

上海理工大學健康科學與工程學院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是一種革蘭氏陽性菌，也是一種公認的食品安全菌株，被廣泛應(yīng)用于酸奶和奶酪等傳統(tǒng)乳制品的生產(chǎn)過程中[1-2]。為適應(yīng)乳制品發(fā)酵過程中的酸性環(huán)境，感知細胞外的信號并用信使分子來傳遞信號，對嗜熱鏈球菌的生存尤為重要。第二信使分子c-di-AMP 廣泛存在于細菌、古生菌尤其是厚壁菌門中，與脂肪酸代謝、鉀離子穩(wěn)態(tài)、滲透壓調(diào)節(jié)、細胞毒力以及生物膜形成等多種生理功能密切相關(guān)[3-8]。為闡明c-di-AMP 在嗜熱鏈球菌中的調(diào)控機制，研究c-di-AMP合成酶的結(jié)構(gòu)與功能非常有必要。細菌c-di-AMP合成酶DAC 包含一個高度保守的DAC/DisA_N 結(jié)構(gòu)域，可催化ATP 或ADP 合成c-di-AMP。DAC 蛋白活性與保守的DGA（Asp-Gly-Ala）和RHR（Arg-His-Arg）基序密切相關(guān)[9-12]。DAC 催化c-di-AMP 合成需要輔因子二價金屬離子，用DAC 三級結(jié)構(gòu)可以預(yù)測可能的輔因子和關(guān)鍵結(jié)合位點[13]。

本實驗室在實驗前期在傳統(tǒng)乳制品中篩選出了一株高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌菌株S-3，并對其進行了全基因組測序[14]。結(jié)合HMMER 預(yù)測和NCBI數(shù)據(jù)庫比對在嗜熱鏈球菌S-3 基因組中預(yù)測出的c-di-AMP 合成酶（命名為StDAC），對其跨膜區(qū)和二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并通過SWISS-MODEL 和Modeller 進行三級結(jié)構(gòu)模擬，為后續(xù)探究StDAC 的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將StDAC 氨基酸序列提交至蛋白質(zhì)序列網(wǎng)絡(luò)分析在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_server.html），選擇其中9 個有代表性的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法：SOPM，HNN，MLRC，DPM，DSC，GOR Ⅰ，GOR Ⅲ，PHD，Predator 對StDAC 二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測[15-16]。其中HNN，MLRC，DSC，GORⅢ，PHD，Predator 為三態(tài)定義法，“h”代表α-螺旋、“e”代表β-折疊、“c”代表無規(guī)則卷曲；SOPM，DPM 和GORⅠ為四態(tài)定義法，“h”代表α-螺旋、“e”代表β-折疊、“c”代表無規(guī)則卷曲、“t”代表β-轉(zhuǎn)角。為統(tǒng)一標準采用三態(tài)定義法對二級結(jié)構(gòu)進行比較分析。

1.2 SWISS-MODEL 單模板建模

將StDAC 氨基酸序列提交至SWISS-MODEL蛋白分子建模服務(wù)器（https://swissmodel.expasy.org/）進行單模板建模，返回GMQE 值小于1 且接近1、QMENA 值接近0、氨基酸同源性大于30%模板的pdb 格式。建立的模型通過Discovery studio 可視化即可模擬StDAC 三級結(jié)構(gòu)[17]。建模模板來自于美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的Structure 數(shù)據(jù)庫。

1.3 Modeller 多模板建模

將StDAC 氨基酸序列提交至Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id =index）和HHpred（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred）在線數(shù)據(jù)庫，搜索與StDAC 具有同源性的模板。將氨基酸同源性與軟件評分較高的單模板依次通過腳本salign.py，align2d_mult.py 和model_mult.py 進行多模板建模，返回的pdb 文件通過Discovery studio可視化即可模擬StDAC 三級結(jié)構(gòu)。

1.4 模型評估

將預(yù)測的模型提交至SAVES 在線服務(wù)器（https://saves.mbi.ucla.edu/）， 根據(jù)提示分別對Verify-3D，Errat 和PROCHECK 中Ramachandran 圖對模型的3D 結(jié)構(gòu)、晶體學和生理化學參數(shù)進行評估。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 c-di-AMP 合成酶預(yù)測

利用HMMER 預(yù)測和NCBI 數(shù)據(jù)庫比對在嗜熱鏈球菌S-3 全基因組中發(fā)現(xiàn)的一個編碼DisA_N 結(jié)構(gòu)域的c-di-AMP 合成酶基因（orf0696），將其編碼的蛋白命名為StDAC。StDAC 分別與已報道的枯草芽孢桿菌c-di-AMP 合成酶CdaA 和DisA 擁有47%和33%的氨基酸序列相似性[10,18]。用PROTTER在線分析軟件對StDAC 跨膜區(qū)進行預(yù)測，結(jié)果顯示StDAC 的第7～52 個氨基酸為跨膜區(qū)，第1～6 個氨基酸和第53～235 個氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)?？缒^(qū)預(yù)測結(jié)果為StDAC 異源表達提供了借鑒，可通過切除第7～52 個氨基酸提高可溶性蛋白含量。如圖1 所示。

圖1 PROTTER 預(yù)測StDAC 跨膜區(qū)

2.2 StDAC 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法通?；诮y(tǒng)計經(jīng)驗算法（MLRC、DPM、GOR Ⅰ、GOR Ⅲ）、物理化學算法（SOPM、DSC、Predator）和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（HNN、PHD），這些方法預(yù)測的α-helix 的準確性高于90%[19-20]。綜合9 種預(yù)測方法得到的StDAC 二級結(jié)構(gòu)有42.98%（共101 個氨基酸）為α-螺旋，15.32%（共36 個氨基酸）為β-折疊，38.30%（共90 個氨基酸）（圖2）為無規(guī)則卷曲。用物理化學算法DSC 和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法PHD 預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)更接近綜合預(yù)測結(jié)果。如表1所示。

表1 StDAC 不同算法二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖2 StDAC 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 StDAC 三級結(jié)構(gòu)建模

SWISS-MODEL 在線服務(wù)器選擇用氨基酸同源性最高和覆蓋率最廣的模板6hvm 對StDAC 進行單模板建模（圖3A）。由于模板6hvm 的晶體結(jié)構(gòu)沒有跨膜區(qū)，因此SWISS-MODEL 要對含DisA_N 結(jié)構(gòu)域的StDAC 從第70～228 個氨基酸序列（共158 個氨基酸）進行三維建模。利用Modeller 進行多模板建模，用NCBI、Phyre2 和HHpred 在線數(shù)據(jù)庫搜索StDAC 建模模板，以氨基酸同源性高、軟件評分高和氨基酸覆蓋率廣為標準，以6gyw、6huw 和d2fb5a1為模板對StDAC 進行多模板建模，如圖3B 所示。用SWISS-MODEL 和Modeller 兩種方法建立的三級結(jié)構(gòu)都包含5 個α-螺旋區(qū)域和7 個β-折疊區(qū)域，但Modeller 建立的三級結(jié)構(gòu)包括跨膜區(qū)域。

圖3 StDAC 的SWISS-MODEL 和Modeller 建模A：SWISS-MODEL；B：Modeller

2.4 StDAC 三級結(jié)構(gòu)評估

Ramachandran 圖為最常見三級結(jié)構(gòu)評估方法，圖中的紅色區(qū)域為“最適區(qū)域”，黃色區(qū)域為“允許區(qū)域”，其他區(qū)域的紅點均為構(gòu)象不合理的氨基酸，合理的三級結(jié)構(gòu)須有90%以上的氨基酸落在紅色區(qū)域[21]。用SWISSMODEL 建立的StDAC 三級結(jié)構(gòu)有92.0%的氨基酸落在最適區(qū)域，8.0%的氨基酸落在允許區(qū)域。用Modeller 建立的三級結(jié)構(gòu)有92.4%的氨基酸落在最適區(qū)域，7.6%的氨基酸落在允許區(qū)域。因此， 兩種方法建立的三級結(jié)構(gòu)在Ramachandran 圖評估中都不存在氨基酸構(gòu)象不合理的情況。如圖4 所示。

圖4 StDAC 三級結(jié)構(gòu)Ramachandran 圖A：SWISS-MODEL；B：Modeller

Errat 通過統(tǒng)計和分析0.35 nm 半徑內(nèi)，不同類型原子之間非鍵相互作用的數(shù)據(jù)，是通過晶體學方法評估蛋白質(zhì)模型，軟件評分大于85%的模型才具有可靠性，圖中的黃線和紅線越多表示三級結(jié)構(gòu)的可靠性越差[22]。由SWISSMODEL 建立的StDAC 三級結(jié)構(gòu)Errat 的評分為98.98%，模型通過評估。而Modeller 建立的三級結(jié)構(gòu)Errat 的評分為78.28%，其中跨膜區(qū)和第180～230 個氨基酸處出現(xiàn)了較多的黃線和紅線，構(gòu)象不合理導致模型評分低，如圖5所示。

圖5 StDAC 三級結(jié)構(gòu)Errat 評分A：SWISS-MODEL；B：Modeller

Verify-3D 是基于統(tǒng)計分析結(jié)果來評估蛋白三維結(jié)構(gòu)與氨基酸序列的相容性的，合理的三級結(jié)構(gòu)通常有80%以上氨基酸的相容性評分高于0.2[23]。由SWISSMODEL建立的StDACVerify-3D評分為84.06%，通過評估。而Modeller 建立的StDAC 三級結(jié)構(gòu)Verify-3D 的評分為54.04%，沒有通過評估，與Errat的評估結(jié)果相同，跨膜區(qū)和第180～230 個氨基酸結(jié)構(gòu)不合理導致整體結(jié)構(gòu)評分較低，如圖6 所示。

圖6 StDAC 三級結(jié)構(gòu)Verify-3D 分析A：SWISS-MODEL；B：Modeller

通過Verify-3D、Errat 和PROCHECK 中的Ramachandran圖對建立的StDAC 三級結(jié)構(gòu)進行評估，評估結(jié)果表明由SWISS-MODEL 建立的StDAC三級結(jié)構(gòu)通過了Ramachandran、Errat 和Verify-3D的評估，蛋白結(jié)構(gòu)較為合理；由Modeller 建立的全長StDAC 三級結(jié)構(gòu)僅通過了Ramachandran 評估，三級結(jié)構(gòu)評分低。因此，可通過SWISS-MODEL 模擬的三級結(jié)構(gòu)對StDAC 的結(jié)構(gòu)與功能進行研究。

3 結(jié)論

基于嗜熱鏈球菌S-3 全基因組測序結(jié)果，結(jié)合HMMER 預(yù)測和NCBI 數(shù)據(jù)庫比對篩選出c-di-AMP 合成酶StDAC。利用統(tǒng)計經(jīng)驗算法、物理化學算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法共9 種方法預(yù)測StDAC 的二級結(jié)構(gòu)42.98%為α-螺旋、15.32%為β-折疊、38.30%為無規(guī)則卷曲。分別通過SWISS-MODEL 和Modeller 模擬StDAC 三級結(jié)構(gòu)，其中SWISSMODEL 單模板建模的StDAC 三級結(jié)構(gòu)在PROCHECK、Verify-3D 和Errat 三個分析軟件中評分最高，為研究c-di-AMP 合成酶StDAC 的結(jié)構(gòu)與功能提供了可靠的模型，并為進一步闡明嗜熱鏈球菌中c-di-AMP 的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。