黃 瑩，孫 鑫，黃 晶，楊 曉，陳 曦

中國健康促進基金會抗衰老營養(yǎng)與健康研發(fā)中心，湖北 武漢 430100

腸道菌群是指寄居于消化道內(nèi)的各種微生物的總和，物種類多達1 000 種[1-2]。腸道菌群不僅是我們身體中最重要的微生物群落，同時作為“第二基因組”的腸道菌群，對人體代謝、免疫應(yīng)答和基因表達均有調(diào)節(jié)作用[3-6]。腸道菌群作為人體的天然屏障，在抑制有害菌生長繁殖方面發(fā)揮著重要的作用[7]。據(jù)報道，患腸道疾病的人群數(shù)量與日俱增，工業(yè)化快發(fā)達的歐洲地區(qū)，目前將近0.2%的人口都患有腸道疾病[8]，近年來隨著經(jīng)濟全球化的快速發(fā)展，各個國家和地區(qū)患腸道疾病的人數(shù)都在增加，呈現(xiàn)全球性上升趨勢[9-10]。臨床研究表明，腸道菌群失調(diào)是腸道疾病重要的激發(fā)因素之一，主要表現(xiàn)為有益菌群數(shù)量減少和有害菌群數(shù)量增多[11]。

益生菌是一類對宿主（動物和人）有益的細(xì)菌的統(tǒng)稱[12]。2019 年3 月國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定（征求意見稿）》明確表明，攝取數(shù)量足夠的益生菌對宿主健康有益。消費者健康意識的提高促進了益生菌消費市場的大幅度擴大，我國益生菌市場每年都在以15%的年復(fù)合增長率增長，預(yù)計今年將達到1 420 億元[13]。益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群[14]、提高免疫力[15]、潤腸通便[16]、維持腸道內(nèi)環(huán)境均衡[17]等方面發(fā)揮著重要的作用，同時其在抗氧化[18]、改善血脂異常[19]、緩解骨質(zhì)疏松[20]、護肝[21]方面的功能也有相關(guān)的研究報道。常見的益生菌種類有雙歧桿菌和乳桿菌。本實驗主要采用七種乳桿菌，即植物乳桿菌550、植物乳桿菌360、鼠李糖乳桿菌S24、植物乳桿菌543、副干酪乳桿菌S6、嗜酸乳桿菌11073、干酪乳桿菌10640，輔以益生元，組成復(fù)合益生菌粉，研究其對小鼠腸道菌群的改善作用，為研究益生菌在改善腸道菌群方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

復(fù)合益生菌粉原料：混合益生菌粉；輔料：魚膠原蛋白肽粉、維生素C、赤蘚糖醇、麥芽糊精、抗性糊精、巖藻多糖。復(fù)合益生菌粉由16.5%的原料和83.5%的輔料混合而成。復(fù)合益生菌粉的人體推薦量為2 g/d，按成人60 kg·bw 計為0.033 g/kg·bw。

混合益生菌粉由四川高福記生物科技有限公司提供。主要組成為：植物乳桿菌550、植物乳桿菌360、鼠李糖乳桿菌S24、植物乳桿菌543、副干酪乳桿菌S6、嗜酸乳桿菌11073、干酪乳桿菌10640。其他組成成分均為市售。

伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、BBL 瓊脂培養(yǎng)基、TSC 瓊脂培養(yǎng)基、TSC 瓊脂配套試劑（SR0290）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨、Lbs 瓊脂（北京路橋生物技術(shù)有限公司），氯化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BPC-250F 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、90 mm×15 mm 一次性培養(yǎng)皿（比克曼生物科技有限公司）、厭氧盒、厭氧袋和厭氧指示劑（日本三菱化學(xué)公司）、1 mL 移液槍（德國eppendorf 公司）。

1.3 實驗動物

雄性SPF 級Babl/c 小鼠，7 周齡（19～21 g），北京維通利華實驗技術(shù)有限公司湖北分公司提供（許可證號：SCXK(鄂）2022-0030）。環(huán)境溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。維持飼料購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司。

1.4 劑量選擇與受試樣品給予方式

復(fù)合益生菌粉低、中、高劑量組分別按人體推薦量的10 倍（0.333 g/kg·bw）、20 倍（0.667 g/kg·bw）、30 倍（1.000 g/kg·bw）給予，同時設(shè)置陰性對照組（給予同體積的純水）、原料組（0.165 g/kg·bw）和輔料組（0.835 g/kg·bw）。各劑量受試樣品的給予方式為經(jīng)口灌胃，灌胃量為0.1 mL/10 g·bw。

1.5 試驗方法

方法來源：《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養(yǎng)素補充劑（2020 年版）（征求意見稿）》的第十五條，有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能的檢驗方法。

1.5.1 實驗步驟

在給予受試樣品之前，無菌采取小鼠肛門內(nèi)糞便0.1 g，采用0.85%的氯化鈉溶液10 倍系列稀釋，選擇合適的稀釋度分別接種在各培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，從菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應(yīng)等方面入手，鑒定計數(shù)菌落，計算出每克濕便中的菌數(shù)，取對數(shù)后進行統(tǒng)計處理。

受試樣品給予時間14 d 后的24 h 內(nèi)和給予時間30 d 后的24 h 內(nèi)，用與實驗前相同的方式取直腸糞便，檢測腸道菌群，方法同上。

1.5.2 觀察指標(biāo)

體重、雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。各腸道菌群的培養(yǎng)條件如表1 所示。

表1 各個腸道菌群的培養(yǎng)條件

1.6 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定

可以對資料進行方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F(xiàn) 值＜0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間無顯著性差異；F 值≥0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)兩兩相比的方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，對轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與討論

2.1 受試樣品對小鼠體重的影響

試驗期間每周稱1 次體重，各期體重及體重增長情況如表2 所示。實驗期間，所有小鼠的精神狀態(tài)、活動、攝食、排泌等均未見明顯的異常狀況，且體重在持續(xù)增長。與空白對照組相比，實驗期間各實驗組小鼠體重均未見異常。結(jié)果表明復(fù)合益生菌粉、原料及輔料對小鼠的生長無不良影響。

表2 受試樣品對小鼠體重的影響表（，n=10）

表2 受試樣品對小鼠體重的影響表（，n=10）

組別干預(yù)期體重/g 0 d7 d14 d21 d30 d陰性對照組20.99±0.76 22.77±0.88 23.29±0.96 23.93±1.06 24.77±1.21復(fù)合益生菌粉低劑量組21.05±0.79 22.84±0.57 23.30±0.61 24.21±0.75 24.82±0.62復(fù)合益生菌粉中劑量組21.20±0.80 22.70±0.83 23.16±0.87 23.87±0.73 24.87±0.73復(fù)合益生菌粉高劑量組24.78±1.06原料組21.16±0.65 21.19±0.75 23.10±0.75 23.50±0.83 24.22±0.97 24.66±0.94輔料組21.02±0.68 23.00±0.85 23.65±0.92 23.90±1.00 22.77±0.59 23.46±0.79 24.21±0.99 25.13±1.22

2.2 受試樣品對小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 受試樣品對小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響

由圖1 可知，與陰性對照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后，腸桿菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的下降，且干預(yù)30 d 后復(fù)合益生菌粉各劑量組腸桿菌的數(shù)量與陰性對照組相比存在顯著性差異（P＜0.05）；各劑量干預(yù)30 d 前后腸桿菌的數(shù)量存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉高劑量組對腸桿菌的生長抑制作用最大，實驗發(fā)現(xiàn)干預(yù)30 d 后腸桿菌數(shù)量的下降率達到了73.00%，且復(fù)合益生菌粉高劑量組對腸桿菌生長的抑制效果大于原料組和輔料組。

圖1 受試樣品對小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響

2.2.2 受試樣品對小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響

由圖2 可知，與陰性對照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后，腸球菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的下降，且干預(yù)30 d 后各劑量組腸球菌的數(shù)量與陰性對照組相比存在顯著性差異（P＜0.05）；各劑量干預(yù)30 d 后腸球菌的數(shù)量與干預(yù)前存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉高劑量組對腸球菌的生長抑制作用最強，實驗發(fā)現(xiàn)在干預(yù)30 d 后腸桿菌數(shù)量的下降率達到了31.24%，且對腸球菌的抑制效果大于單獨的原料組和輔料組。

圖2 受試樣品對小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響

2.2.3 受試樣品對小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響

由圖3 可知，與陰性對照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后，產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的下降，且干預(yù)30 d 后各劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量與陰性對照組相比，均存在顯著性差異（P＜0.05）；各劑量干預(yù)30 d 后產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量與干預(yù)前相比存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉中劑量組對產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長抑制作用最大，實驗發(fā)現(xiàn)干預(yù)30 d 后腸桿菌數(shù)量的下降率達到了84.17%，且對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果大于單獨的原料組和輔料組。

圖3 受試樣品對小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響

2.2.4 受試樣品對小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響

由圖4 可知，與陰性對照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后乳桿菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的增長，但只有復(fù)合益生菌粉中劑量、高劑量組和原料組在干預(yù)30 d 后乳桿菌的增長量與陰性對照組存在顯著性差異（P＜0.05），低劑量組和輔料組無顯著性差異（P＞0.05）；與干預(yù)前相比，復(fù)合益生菌粉中、高劑量組以及原料組在干預(yù)30 d 后，乳桿菌的增長量與干預(yù)前相比都存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉中劑量組對乳桿菌增長的促進作用最大，增長率達63.77%，且對乳桿菌增長的促進效果大于單獨的原料組和輔料組。

圖4 受試樣品對小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響

2.2.5 受試樣品對小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

由圖5 可知，與陰性對照組相比，各劑量組在干預(yù)14 d 和30 d 后雙歧桿菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的增長，但是只有復(fù)合益生菌粉的中劑量和高劑量組在干預(yù)30 d 后乳桿菌的增長數(shù)量與陰性對照組存在顯著差異（P＜0.05）；與干預(yù)前相比，在復(fù)合益生菌粉中、高劑量組干預(yù)30 d 后，雙歧桿菌的增長數(shù)量與干預(yù)前相比存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉中劑量組對雙歧桿菌增長的促進作用最大，增長率達47.74%，且對雙歧桿菌的促增長效果大于單獨的原料組和輔料組。

圖5 受試樣品對小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

3 討論

比較實驗前后各菌種自身及組間雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的變化情況發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌粉在干預(yù)前后自身也發(fā)生了顯著性變化，且干預(yù)后與陰性對照組比較也存在顯著性差異，主要表現(xiàn)為小鼠糞便中雙歧桿菌和乳桿菌明顯增加，對乳桿菌的增殖作用更強了，腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌明顯減少，同時研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌粉對腸道菌群的改善效果優(yōu)于單獨的原料組和輔料組。

本研究采用含多種乳桿菌的原料與輔料組成復(fù)合益生菌粉，大量研究證明乳桿菌在改善腸道菌群方面成效顯著，例如Lahtinen 等[22]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌對老年人糞便中乳桿菌和艱難梭菌的數(shù)量有明顯的改善作用。張澤鵬等[23]研究植物乳桿菌對小鼠血脂及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)干預(yù)42 d 后，干預(yù)組小鼠糞便中大腸桿菌的數(shù)量均低于模型組（P＜0.05）；糞便雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量均高于模型組（P＜0.05）。劉偉賢等[24]給予小鼠灌胃副干酪乳桿菌K56 菌株，比較干預(yù)14 d 前后的菌株數(shù)量，發(fā)現(xiàn)各組小鼠糞便中的雙歧桿菌、乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著增加（P＜0.05），而腸桿菌和腸球菌則無顯著變化（P＞0.05）。陳雪等[25]研究植物乳桿菌對雄性小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)功能，研究結(jié)果表明，植物乳桿菌HCS03-001 的中、高劑量組可顯著提高小鼠小腸墨汁推進率（P＜0.05）；植物乳桿菌HCS03-001 高劑量可降低產(chǎn)氣莢膜梭菌（P＜0.05）、腸球菌（P＜0.05）、腸桿菌（P＞0.05）的活菌數(shù)，同時促進乳桿菌增殖（P＜0.05）。同時發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌粉對腸道菌群的改善效果優(yōu)于單獨的原料組和輔料組，因為輔料組中的一些益生元成分作為一種不被人體消化的食物成分，通過選擇性地刺激腸道內(nèi)的益生菌生長來對機體產(chǎn)生有益影響，改善機體的健康狀況[26]。

研究發(fā)現(xiàn)益生菌對腸道有害菌的抑制作用和對有益菌增長的促進作用主要體現(xiàn)為：（1）益生菌可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)大分子物質(zhì)、影響DNA 或RNA的活性、競爭病原菌中生長相關(guān)物質(zhì)的結(jié)合位點，阻止細(xì)胞生長分裂[27]、益生菌黏蛋白的黏附作用和定植以及一定濃度的毒素能夠在一定程度上對致病菌產(chǎn)生拮抗作用[28]；（2）益生菌可提高小鼠空腸絨隱比，改善其腸道吸收功能；可升高盲腸內(nèi)容物的總SCFAs 含量，增強腸道的屏障功能，使腸道菌群中的乳桿菌屬等有益菌相對增加，對有害菌產(chǎn)生一定的抑制作用，進而調(diào)節(jié)腸道菌群的分布生長情況，改善腸道內(nèi)環(huán)境[29]。雖然動物實驗證明益生菌具有改善小鼠腸道菌群的作用，但是涉及益生菌對人體腸道菌群改善作用機理的研究仍需要使用更復(fù)雜的模型去預(yù)測作用機制并開展更嚴(yán)格的臨床試驗去證實，本研究為后續(xù)益生菌制劑調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的探索提供了理論支持。