馬婷婷，畢森盛，曹磊，印志琪，段可然，王政祿，鄭虹

目的 高質(zhì)量的肝臟組織樣本對(duì)肝臟疾病的研究至關(guān)重要，冷缺血時(shí)間（CIT）是影響組織樣本質(zhì)量的關(guān)鍵因素，探討冷缺血時(shí)間與不同疾病類型肝組織樣本質(zhì)量的相關(guān)性，為獲得高質(zhì)量肝組織樣本提供標(biāo)準(zhǔn)。

方法 選取天津市第一中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的肝癌（HCC）和膽道閉鎖（BA）患者各 30 例，手術(shù)切除肝組織后，室溫放置 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 6 h 后，分別從基因水平、蛋白水平及形態(tài)學(xué)水平對(duì)組織質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，提取總 RNA 及基因組 DNA，分別檢測(cè)濃度、純度及完整性（RIN/DIN 值），熒光定量 PCR 檢測(cè)組織樣本冷缺血 0、6 h 后 ALB 基因表達(dá)水平；免疫組化方法檢測(cè)組織樣本冷缺血 0、6 h 后 HepPar1、CK19、CD34、Vimentin 蛋白表達(dá)情況，Western blot 檢測(cè)組織樣本冷缺血 0、6 h 后ALB 蛋白表達(dá)水平；HE 染色觀察組織樣本冷缺血 0、6 h后組織及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

結(jié)果 DNA 產(chǎn)量、RNA 純度和 RNA RIN 隨時(shí)間變化，時(shí)間效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間效應(yīng)不顯著，表明肝癌和膽道閉鎖組間沒有差異。DNA 產(chǎn)量和 RNA RIN 的交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明時(shí)間的影響隨著組別不同而有所不同。與冷缺血 0 h 相比，肝癌、膽道閉鎖組織樣本冷缺血 6 h 后ALB 基因表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；免疫組化方法檢測(cè)組織樣本冷缺血 0、6 h 后 HepPar1、CK19、CD34、Vimentin 蛋白表達(dá)情況均無變化，Western blot檢測(cè)顯示組織樣本冷缺血 0、6 h 后 ALB 蛋白表達(dá)水平無顯著變化；石蠟切片 HE 染色顯示樣本冷缺血 0、6 h 后組織及細(xì)胞形態(tài)學(xué)無變化。

結(jié)論 冷缺血時(shí)間對(duì)肝組織樣本中核酸質(zhì)量具有顯著影響，縮短冷缺血時(shí)間可獲得高質(zhì)量肝組織樣本。

人體組織樣本是臨床診斷和科學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的生物樣本資源之一，選擇科學(xué)的采集和保存方法，可確保組織樣本的質(zhì)量?；蛩?、蛋白水平及組織形態(tài)學(xué)是醫(yī)學(xué)研究、個(gè)性化和靶向治療中的重要研究?jī)?nèi)容[1-2]。近年來，世界上建立了越來越多的疾病組織樣本庫(kù)[3-6]。樣本質(zhì)量是樣本庫(kù)的核心，做好質(zhì)量控制與管理可以盡量減少樣本質(zhì)量的變化，保持樣本原有性質(zhì)。目前分析前因素或變量對(duì)樣本質(zhì)量影響較大，在分析組織樣本中的蛋白質(zhì)、RNA 和 DNA 等不穩(wěn)定大分子時(shí)，冷缺血時(shí)間被普遍認(rèn)為是重要分析前變量。大量研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)中斷血流后不穩(wěn)定分子活性逐漸喪失[7]，研究表明，缺血時(shí)間優(yōu)先影響肝細(xì)胞，隨著冷缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞膜損壞，產(chǎn)生大量的代謝物，且肝內(nèi)代謝物的增加與缺血時(shí)間相關(guān)[8]。冷缺血時(shí)間一直被認(rèn)為是決定組織質(zhì)量的關(guān)鍵因素[9]，研究表明，延長(zhǎng)冷缺血時(shí)間可影響多種組織樣本中的RNA 的質(zhì)量，且不同器官組織樣本中 RNA 的質(zhì)量也存在差異[10-16]。因此，在肝組織內(nèi)確立標(biāo)準(zhǔn)化的缺血時(shí)間，以確保采集、處理及儲(chǔ)存中分子成分與質(zhì)量的穩(wěn)定對(duì)于樣本質(zhì)量控制有著重要意義。肝臟疾病的研究已成為當(dāng)今器質(zhì)性疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[17-19]。研究表明，不同疾病類型肝組織樣本質(zhì)量也不完全相同[20-22]。組織樣本質(zhì)量受手術(shù)方式、儲(chǔ)存溫度、缺血時(shí)間等外在條件的影響，疾病本身的臨床特征或病理特征也可能會(huì)影響樣本質(zhì)量[10]。

本研究選取肝癌和膽道閉鎖兩種類型的肝病組織樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，探究冷缺血時(shí)間與不同疾病類型肝組織 DNA、RNA、蛋白質(zhì)及形態(tài)學(xué)之間的關(guān)系，尋找不同疾病類型肝組織樣本核酸、蛋白及形態(tài)學(xué)最適缺血時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（LightCycler480 II）、全自動(dòng)免疫組化染色儀（Benchmark XT）和 DAB試劑盒均為瑞士 Roche 公司產(chǎn)品；正置顯微鏡（DM750）為德國(guó) Leica 公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon-4800）為上海天能生命科學(xué)有限公司產(chǎn)品；Airstream? A2 型二級(jí)生物安全柜（AC2-4S1）為新加坡 Esco 公司產(chǎn)品；HHS-21-6 型電熱恒溫水浴鍋為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為德國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；TP-24 組織快速破碎儀為杰靈儀器制備（天津）有限公司產(chǎn)品；GL-1900 干式恒溫器為海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；ND5000 超微量紫外可見光分光光度計(jì)為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；4200 TapeStation 生物分析儀、RNA ScreenTape、RNA ScreenTape Sample Buffer、Genomic DNA ScreenTape、Genomic DNA Sample Buffer 均為美國(guó) Agilent 公司產(chǎn)品；RNAlater 為美國(guó) Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑盒（DP431）、DNA 提取試劑盒（DP304）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

RIPA 裂解物緩沖液（AQ521）為北京擎科生物科技股份有限公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑 Cocktail（HY-K0010）為美國(guó) MedChemexpress 生物科技公司產(chǎn)品；BCA 蛋白定量試劑盒（BD0028）為美國(guó) Bioworld 公司產(chǎn)品；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF 膜，ISEQ00010）為美國(guó) Millipore 公司產(chǎn)品；ALB 抗體（A1363，1:1000）、GAPDH 抗體（A19056，1:1000）、二抗Goat anti-IgG-HRP（AS003/AS014，1:10000）為武漢愛博泰克 ABclonal 生物科技有限公司產(chǎn)品；CK19 抗體、Vimentin 抗體、CD34 抗體、HepPar1抗體為美國(guó) Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本采集 選取在天津市第一中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的肝癌、膽道閉鎖患者各 30 例。所有患者或家屬均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。手術(shù)切除肝組織后收集患者樣本，放入生物安全柜內(nèi)，用無菌無酶的剪刀將樣本平均分開（約 10 mg），分別放入無菌無酶的凍存管中，室溫放置 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 6 h 后加入 RNAlater，放入 4 ℃ 過夜或加入福爾馬林室溫固定，棄去 RNAlater，儲(chǔ)存于 -80 ℃ 冰箱。

1.2.2 核酸提取及檢測(cè) 基因組 DNA 及總RNA 提取選擇試劑盒提取法，提取步驟按說明書操作。生物分析儀檢測(cè)核酸濃度及完整性，根據(jù)濃度計(jì)算出產(chǎn)量。分光光度計(jì)測(cè)定核酸純度，讀取吸光度比值。Real-time PCR 檢測(cè)組織樣本中 ALB基因的表達(dá)水平，引物序列如下，ALB 基因正向引物：5' GAGACCAGAGGTTGATGTGATG 3'；ALB 基因反向引物 5' AGTTCCGGGGCATAAAA GTAAG 3'；GAPDH 基因正向引物 5' GGAGCGA GATCCCTCCAAAAT 3'；GAPDH 基因反向引物5' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 3'，引物由天津舍為斯生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。取 1 μg 總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA備用，取 1 μl cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，42 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 蛋白提取及檢測(cè) 將 RIPA 裂解物緩沖液和蛋白酶抑制劑 Cocktail 混合（100:1）加入組織樣品中進(jìn)行總蛋白提取，4 ℃ 搖床孵育 10 min，12 000 r/min 離心 15 min，收取蛋白立即使用。采用 BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，具體操作按說明書進(jìn)行。

Western blot 檢測(cè)組織樣本中 ALB 蛋白表達(dá)水平，配置 SDS-PAGE 膠，蛋白上樣量為每孔20 μg，轉(zhuǎn)移到 0.22 μm 孔的 PVDF 膜。5% 脫脂奶粉進(jìn)行封閉 1 h；ALB 抗體、GAPDH 抗體 4 ℃搖床孵育過夜；二抗 Goat anti-IgG-HRP 室溫下?lián)u床孵育 1 h；使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，圖片分析采用 Image J 軟件。

免疫組化染色：按照羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀說明書設(shè)置染色程序，將石蠟切片進(jìn)行自動(dòng)免疫組化染色。選用下列一抗：CK19、Vimentin、CD34、HepPar1，孵育 30 min，最后使用 ultraView 通用DAB 試劑盒進(jìn)行顯色。

結(jié)果判讀：由病理醫(yī)生進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分內(nèi)容包括染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性率，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：淺黃色為 1 分、棕黃色為 2 分、棕褐色為 3 分。染色陽(yáng)性率的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：＜ 5% 記 0 分，5% ～25% 記 1 分，26% ～ 55% 記 2 分，56% ～ 85% 記3 分，＞ 85% 記 4 分。兩者得分相加，1 ～ 2 分為弱陽(yáng)性，3 ～ 4 分為中陽(yáng)性，5 ～ 7 分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.2.4 形態(tài)學(xué)檢查 HE 染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫二甲苯。蘇木素染液染色 10 min，1% 鹽酸乙醇分色，自來水藍(lán)化 5 min。伊紅染液染細(xì)胞質(zhì)5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于高倍光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)、分布及細(xì)胞核的病理改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)用于確定數(shù)據(jù)的分布。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差值表示，并在各組之間進(jìn)行獨(dú)立的t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量由中值和四分位間距表示，并在這些組之間進(jìn)行 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。使用符合正態(tài)分布和方差均勻性的項(xiàng)目進(jìn)行方差重復(fù)測(cè)量分析（ANOVA）。如果數(shù)據(jù)符合 Mauchly 的球形假設(shè)檢驗(yàn)，則使用雙因素方差分析；如果數(shù)據(jù)不滿足Mauchly 的球形假設(shè)，則使用 Greenhouse Geisser方法來校正數(shù)據(jù)。在重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果中，如果時(shí)間和組之間沒有交互作用，則直接使用主效應(yīng)檢驗(yàn)來評(píng)估組的效果；如果時(shí)間和群體之間存在交互作用，則應(yīng)分析個(gè)體效應(yīng)，即通過單因素重復(fù)方差測(cè)量來分析群體內(nèi)效應(yīng)。使用 Pearson 相關(guān)分析各組之間的相關(guān)性；使用 Bonferroni 方法校正測(cè)試水平 α = 0.05，然后分兩對(duì)進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 冷缺血時(shí)間對(duì) DNA/RNA 質(zhì)量的影響

為了確定冷缺血時(shí)間對(duì)不同疾病類型肝組織質(zhì)量的影響，收集了肝癌患者（n = 30）和膽道閉鎖患者（n = 30）的肝組織，并在冷缺血后 0、0.25、0.5、1、2、3、5 和 6 h 提取了 DNA 和 RNA。采用重復(fù)測(cè)量方差分析比較不同時(shí)間 DNA 產(chǎn)量、DNA 純度、DNA DIN、RNA 產(chǎn)量、RNA 純度、RNA RIN 的差異。結(jié)果顯示，DNA 產(chǎn)量、RNA 純度和 RNA RIN 隨時(shí)間變化，時(shí)間效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1 和圖 2）。組間效應(yīng)不顯著，表明肝癌和膽道閉鎖組間沒有差異。DNA 產(chǎn)量和 RNA RIN的交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明時(shí)間的影響隨著組別不同而有所不同（表 1 ～ 2）。肝癌、膽道閉鎖組織樣本分別在冷缺血 5、3 h 后 RNA RIN 值下降至 7 以下（圖 2C），生物分析儀模擬電泳圖顯示組織樣本冷缺血時(shí)間延長(zhǎng)至 6 h 后，28 S 條帶亮度明顯低于 18 S，說明 RNA 已經(jīng)發(fā)生了不同程度的降解，而某些實(shí)驗(yàn)如高通量測(cè)序等對(duì) RNA 質(zhì)量要求較高，往往要求 RNA RIN 值大于 7（圖 2E）[23]。白蛋白由肝細(xì)胞合成，占血漿總蛋白的 50% ～60%，具有維持血漿膠體滲透壓和免疫調(diào)節(jié)的功能。本研究進(jìn)行了熒光定量 PCR 來評(píng)估不同疾病類型中 ALB 的 mRNA 水平。與冷缺血 0 h 相比，冷缺血 6 h 后 HCC 和 BA 組織中 ALB 基因的表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）（圖 2D）。

圖2 冷缺血時(shí)間對(duì)不同疾病類型肝組織 RNA 質(zhì)量的影響[A：RNA 產(chǎn)量；B：RNA 純度；C：RNA RIN 值；D：ALB 基因表達(dá)量，*P ＜ 0.05；E：生物分析儀模擬電泳圖（肝癌）；F：生物分析儀模擬電泳圖（膽道閉鎖）]Figure 2 Effect of CIT on RNA quality of liver tissue in different disease types [A: RNA yields; B: RNA purity; C: RNA RIN; D:ALB gene expression, *P ＜ 0.05; E: Simulated electrophoretogram of bioanalyzer (HCC); F: Simulated electrophoretogram of bioanalyzer (BA)]

表1 Mauchly 球形檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of Mauchly′s test of sphericity

表2 重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果Table 2 The repetitive measure ANOVA analysis results

圖3 冷缺血時(shí)間對(duì)肝組織蛋白質(zhì)量的影響Figure 3 The effect of CIT on liver tissue protein quality

2.2 冷缺血時(shí)間對(duì)不同疾病類型肝組織蛋白質(zhì)質(zhì)量的影響

肝癌、膽道閉鎖組織內(nèi) HepPar1、CD34、Vimentin 陽(yáng)性表達(dá)，肝癌組織中 CK19 陰性表達(dá)、膽道閉鎖組織中 CK19 陽(yáng)性表達(dá)，與冷缺血 0 h相比，無論是肝癌還是膽道閉鎖組織樣本冷缺血6 h 后 HepPar1、CD34、Vimentin、CK19 蛋白表達(dá)均無差異（P＞ 0.05）（圖 3、表 3）。與冷缺血0 h 相比，冷缺血 6 h 后肝癌、膽道閉鎖組織樣本ALB 蛋白表達(dá)水平無顯著變化，而在冷缺血 0 h時(shí)，肝癌 ALB 蛋白表達(dá)量低于膽道閉鎖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（圖 4）。

表3 不同冷缺血時(shí)間下肝組織蛋白質(zhì)量分析Table 3 Analysis of liver tissue protein quality under different CIT

圖5 冷缺血時(shí)間對(duì)不同疾病類型肝組織形態(tài)學(xué)特征的影響Figure 5 The effect of CIT on the morphological characteristics of liver tissue in different disease types

2.3 冷缺血時(shí)間對(duì)不同疾病類型肝組織形態(tài)學(xué)的影響

肝癌、膽道閉鎖組織樣本冷缺血 0 h 和 6 h后，HE 染色檢測(cè)組織細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，與冷缺血 0 h 相比，冷缺血 6 h 后，肝癌組織樣本細(xì)胞核形態(tài)、核漿比例及排列形式均無變化，膽道閉鎖組織樣本細(xì)胞形態(tài)和纖維化程度均無變化（圖 5）。

3 討論

組織樣本是生物醫(yī)學(xué)、臨床和轉(zhuǎn)化研究的寶貴資源。疾病組織中的分子質(zhì)量或組學(xué)分析的結(jié)果在很大程度上取決于組織的收集、處理和儲(chǔ)存條件。因此，擁有高質(zhì)量的樣本對(duì)于生物樣本庫(kù)的建設(shè)至關(guān)重要。本研究旨在分析冷缺血時(shí)間對(duì)肝癌和膽道閉鎖兩種不同良惡性程度的組織樣本質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)不同疾病類型的肝臟樣本對(duì)冷缺血時(shí)間的耐受程度存在一定的差異。以往研究也表明不同疾病類型肝臟組織樣本質(zhì)量存在差異且冷缺血時(shí)間是組織樣本 RNA 完整性的關(guān)鍵因素[10,20-21,24]，因此，本研究認(rèn)為不同的致病因素和疾病類型可能會(huì)對(duì)組織質(zhì)量產(chǎn)生不同的影響。

肝臟是機(jī)體中一個(gè)重要的實(shí)質(zhì)性代謝器官，含有豐富的酶類系統(tǒng)。肝癌是位列第五最常見和第三最致命全球癌癥[25]，因此其死亡率也居高不下，且其具有代謝活躍以及腫瘤微環(huán)境等特殊的代謝特點(diǎn)，為此研究肝癌疾病的發(fā)生與發(fā)展至關(guān)重要。膽道閉鎖是發(fā)生于嬰幼兒時(shí)期的一種少見膽道疾病，往往伴有不同程度的膽汁淤積及纖維化，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此，闡明其發(fā)病機(jī)制、尋找其發(fā)病演進(jìn)的生物標(biāo)記物，從而進(jìn)行早期診斷及控制膽道閉鎖的進(jìn)展至關(guān)重要。而高質(zhì)量的樣本可以最大限度保證實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性，因肝癌和膽道閉鎖組織樣本在疾病的良惡性程度、伴隨癥狀及代謝特點(diǎn)等方面都存在差異，為此本研究認(rèn)為，具有不同疾病類型的肝臟組織很有研究?jī)r(jià)值，為不同疾病類型的肝組織樣本尋找更合適的冷缺血時(shí)間。本研究選取肝癌和膽道閉鎖肝切或肝移植患者組織樣本，由于肝移植的組織樣本會(huì)經(jīng)歷肝臟全切、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)取材等復(fù)雜的手術(shù)及處理過程，很難保障短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入液氮保存，因此，移植樣本更應(yīng)該關(guān)注樣本冷缺血時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌和膽道閉鎖組織樣本可耐受的最長(zhǎng)冷缺血時(shí)間分別為 5 h和 3 h，且 RNA 的穩(wěn)定性與肝臟組織疾病類型具有一定的相關(guān)性。這可能由肝臟疾病的臨床特征或病理特征決定。我們將在后期研究中進(jìn)一步探究其發(fā)生機(jī)制。

目前，組織 RNA 的 RIN 值是評(píng)估組織質(zhì)量的最佳方法。Caixeiro 等[26]進(jìn)行了一項(xiàng)系統(tǒng)調(diào)查，結(jié)果顯示 RNA RIN 值對(duì)評(píng)價(jià)組織質(zhì)量尤為重要。在 Barretos 樣本庫(kù)中同樣使用 RNA 的 RIN 值來評(píng)估長(zhǎng)期低溫保存樣本的質(zhì)量[1]。本研究分別從DNA、RNA、蛋白質(zhì)及形態(tài)等方面對(duì)組織質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)組織經(jīng)過冷缺血時(shí)間處理后只有 RNA的質(zhì)量發(fā)生改變，RNA 由于其自身結(jié)構(gòu)及核酸酶的存在使得 RNA 極不穩(wěn)定，正是由于 RNA 的極不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，使其成為評(píng)估組織質(zhì)量的關(guān)鍵因素[27]。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織樣本的初始 RNA RIN值要低于膽道閉鎖，且隨著冷缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，肝癌組織樣本 RNA RIN 值比較穩(wěn)定，直到冷缺血5 h 時(shí) RIN 值才發(fā)生明顯變化，而膽道閉鎖組織樣本 RIN 值隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢下降，直到冷缺血3 h 后陡然下降，存在這種現(xiàn)象可能是由于冷缺血時(shí)間可影響肝癌細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物的變化，而且腫瘤組織具有血供豐富、多克隆性以及微環(huán)境存在的特點(diǎn)，其代謝更加快速?gòu)?fù)雜，某些代謝產(chǎn)物的減少或者增加可能出現(xiàn)更適合 RNA 存在的環(huán)境，使RNA 更加穩(wěn)定[13]。RNA 的質(zhì)量直接決定下游分子表達(dá)變化，研究表明，對(duì)于具有一定程度 RNA 降解的樣本，熒光定量 PCR 也可用于獲得目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)，從而提高稀有樣本的利用率。而另一些研究表明，RNA 完整性的微小差異可以影響基因表達(dá)，胎盤樣本冷缺血 90 min 后，樣本不能用于基因表達(dá)分析[28-31]。本研究選取肝臟中表達(dá)豐度較高的 ALB 進(jìn)行基因水平檢測(cè)，在 ALB 基因成熟 mRNA 的翻譯區(qū)選取 114 bp 進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)冷缺血 6 h 后，肝癌、膽道閉鎖組織樣本 ALB 基因表達(dá)水平均下降，可能因?yàn)?RNA RIN 值的變化可以影響后續(xù)基因的表達(dá)水平[32]，而 RIN 值的大小與基因片段長(zhǎng)度之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步探究。

DNA、蛋白質(zhì)及形態(tài)學(xué)也可用于組織樣本質(zhì)量的檢測(cè)且檢測(cè)方法多種多樣[33-34]，為了保障實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們選取 4200 生物分析儀、免疫組化、Western blot 及 HE 對(duì)組織質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。在以往研究中，DNA、蛋白質(zhì)及形態(tài)學(xué)評(píng)估生物樣本的質(zhì)量往往不敏感，可能是因?yàn)?DNA、蛋白質(zhì)及形態(tài)學(xué)比 RNA 更穩(wěn)定[31,35]。以往研究發(fā)現(xiàn)，從胰腺組織樣本中分離高質(zhì)量的分子非常困難，因?yàn)槠浣M織內(nèi)部含有大量的蛋白酶、DNA 酶和 RNA 酶，這些酶的存在使離體組織立即啟動(dòng)自溶，從而破壞組織樣本質(zhì)量[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)組織樣本冷缺血 6 h后，肝癌和膽道閉鎖組織樣本 DIN 值、蛋白質(zhì)及形態(tài)學(xué)均未發(fā)生變化，相比于胰腺組織來說，肝臟組織具有更加穩(wěn)定的微環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖組織中 ALB 蛋白表達(dá)水平高于肝癌組織樣本，ALB 蛋白由肝細(xì)胞分泌產(chǎn)生，而肝細(xì)胞的生理狀態(tài)受冷熱缺血時(shí)間、疾病類型、年齡、性別及藥物等因素的影響，導(dǎo)致 ALB 蛋白在不同疾病中的表達(dá)差異[38]，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

冷缺血時(shí)間對(duì)肝組織樣本中核酸質(zhì)量具有顯著影響，肝癌和膽道閉鎖組織分別在冷缺血 5 h 和3 h 可獲得高質(zhì)量的 RNA，縮短冷缺血時(shí)間可獲得高質(zhì)量肝組織樣本，冷缺血時(shí)間與組織中蛋白水平及形態(tài)學(xué)水平均無相關(guān)性。