張 倩，劉 芳，張芮苑，鄧鴻丹，楊璐萍，任 虹

成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.或凹葉厚樸M.officinalisRehd. et Wils.var.bilobaRehd. et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有下氣除滿、燥濕消痰之功[1]。厚樸主要含有木脂素、苷類、生物堿、揮發(fā)油等成分[2]，研究表明厚樸揮發(fā)油中石竹烯[3]、檸檬烯[4]、萜品烯-4-醇[5]等成分與抗?jié)冃越Y(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）緊密相關(guān)，課題組前期研究證明厚樸揮發(fā)油對葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的UC 小鼠具有治療作用[6]。

然而厚樸揮發(fā)油具有易揮發(fā)、穩(wěn)定性差、無明確結(jié)腸靶向作用等特點，在口服遞送中易受肝臟首過效應(yīng)及腸道黏膜的代謝而降低其療效[7]，因此如何改善厚樸揮發(fā)油穩(wěn)定性和將其有效遞送到炎癥腸道部位，成為厚樸揮發(fā)油治療UC 需解決的關(guān)鍵問題。納米乳凝膠兼具納米乳和凝膠的雙重優(yōu)點，納米乳能夠顯著改善藥物的溶解度，提高藥物穩(wěn)定性，凝膠則能提高納米乳的黏附性，增強藥物在結(jié)腸中的滯留，實現(xiàn)持續(xù)藥物釋放的作用[8]。因此，本實驗制備了厚樸揮發(fā)油納米乳（MagnoliaeOfficinalis Cortexvolatile oil nanoemulsion，MN）和厚樸揮發(fā)油納米乳凝膠（MagnoliaeOfficinalisCortexvolatile oil nanogel，MNG），并對其理化性質(zhì)進行表征，同時考察了MNG 在小鼠消化道內(nèi)的靶向釋藥行為，驗證了其對UC 小鼠模型的治療效果，以期為厚樸揮發(fā)油新劑型和抗UC 新藥的開發(fā)提供候選方案。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CPA225D 型電子天平，美國奧豪斯儀器有限公司；Spectra MAX Plus384 型酶標儀，美谷分子儀器有限公司；KZ-III-F 型高速低溫組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；UPH-Ⅱ-10T 型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司；BA410 型顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；IVIS Spectrum 型小動物三維光學(xué)活體成像儀，珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司；JEM-1400plus 型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；Axio Imagerm2 EVO10 型光電聯(lián)用成像系統(tǒng)，上海準權(quán)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 藥材與試劑

厚樸干皮收采于四川省都江堰市虹口鄉(xiāng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高級實驗師連艷老師鑒定為木蘭科厚樸屬植物厚樸M.officinalisRehd. et Wils.的干燥干皮；柳氮磺胺吡啶腸溶片，批號09220207，購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號20230512E19）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（批號20230512E11）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號20230505E03），均購自上海茁彩生物科技有限公司；Servicebio?ZO-1抗體，批號L14OC15，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Meilunbio?葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS），批號M0508D，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；聚山梨酯80，批號2018022801，購自成都市科龍化工試劑廠；Zenbio?Claudin-1 抗體，批號M11AP01，購自蘇州四正柏生物科技有限公司；無水乙醇（批號2023022401）、海藻酸鈉（批號2021123001）、丙三醇（批號2021110201）、聚乙二醇-400（批號 2022092901）、醋酸乙酯（批號2022033101）、正丁醇（批號2019120301），均購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚-40（EL-40，批號109896007100）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（CO-40，批號109607008240），均購自山東優(yōu)素華工科技有限公司；細胞膜近紅外熒光探針（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide，DiR），批號D4006，購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；透明質(zhì)酸鈉，批號S12034，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 動物

7～9 周齡雄性ICR 小鼠84 只，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0010，于成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進行實驗。所有動物實驗遵循成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸揮發(fā)油的制備

將厚樸按照前期研究[9]進行發(fā)汗處理，隨后將發(fā)汗厚樸打粉，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，大火煮沸后微火加熱至無揮發(fā)油產(chǎn)生為止，收集揮發(fā)油，密封后保存于4 ℃冰箱。

2.2 標準曲線的建立

以正己烷為空白參照[10]，于200～400 nm 進行紫外掃描，測定得到厚樸揮發(fā)油正己烷溶液于361 nm 處存在最大吸收，故選擇361 nm 作為厚樸揮發(fā)油紫外檢測波長。將厚樸揮發(fā)油溶液稀釋至標準系列質(zhì)量濃度（48.24、24.12、12.06、6.03、3.02、1.51 mg/mL），以正己烷為空白，在厚樸揮發(fā)油最大吸收波長361 nm 處測定標準溶液的吸光度（A）值，以A值為縱坐標、厚樸揮發(fā)油質(zhì)量濃度為橫坐標（C）繪制厚樸揮發(fā)油標準曲線，得回歸方程為A＝0.055 4C-0.013 1，R2＝0.999 1，結(jié)果表明厚樸揮發(fā)油在1.51～48.24 mg/mL 線性關(guān)系良好。

2.3 MN 的制備

2.3.1 厚樸揮發(fā)油在不同助乳化劑中溶解度的測定由于厚樸揮發(fā)油的溶解性較差，故以厚樸揮發(fā)油在不同輔料中的溶解度為前提篩選助乳化劑，比較溶解度的大小。取各輔料0.50 g 于2 mL 離心管中，分別加入過量厚樸揮發(fā)油，渦旋混勻5 min 后超聲4 h 助溶，靜置過夜后，5 000 r/min 離心10 min，取上清液用正己烷稀釋至適當質(zhì)量濃度，在361 nm 處測定厚樸揮發(fā)油在各輔料中的平衡溶解度[11]。結(jié)果見表1，無水乙醇對揮發(fā)油的溶解能力較強，故選用無水乙醇做助乳化劑。

2.3.2 乳化劑的篩選 以無水乙醇為助乳化劑，厚樸揮發(fā)油為油相，乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比（Km）為3∶1，分別以聚山梨酯80、CO-40、EL-40 為乳化劑，制備MN，繪制偽三元相圖。結(jié)果如圖1 所示，與聚山梨酯80 和CO-40 形成的乳區(qū)面積相比，EL-40 作為乳化劑時所形成的MN 區(qū)域面積更大，因此，選擇EL-40 作為乳化劑進行以下實驗。

圖1 乳化劑 (CO-40、EL-40、聚山梨酯80) 篩選的偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram for selection of emulsifier (CO-40, EL-40, polysorbate 80)

2.3.3 偽三元相圖的繪制及Km值的確定 根據(jù)“2.3.2”項乳化劑的試驗結(jié)果，將乳化劑EL-40 和助乳化劑無水乙醇按照Km分別為2∶1、3∶1、4∶1混合，再將該混合物（Smix）與厚樸揮發(fā)油以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的質(zhì)量比配制成混合溶液，在磁力攪拌下加超純水滴定，觀察各溶液的顏色、乳光和澄明度，判斷臨界點，記錄體系由渾濁變澄清時的加水量，計算臨界點時各組分的比例。用OriginPro 8.5 軟件繪制偽三元相圖，圖中各臨界點連線下方的區(qū)域即為MN 區(qū)域，比較該區(qū)域面積大小，確定乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比。結(jié)果如圖2 所示，Km值為3∶1 時，該體系形成的MN 面積最大，故確定EL-40 與無水乙醇的比例為3∶1。

圖2 Km 值篩選的偽三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram for selection of Km

2.3.4 MN 的制備 按照最優(yōu)Km值制備Smix，分別以Smix與油相比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的質(zhì)量比配制成混合溶液，使其總質(zhì)量為1 g，于磁力攪拌下加超純水滴定，觀察不同比例的油相形成的MN 放置7 d 后乳液的形態(tài)，選取形成的乳液最穩(wěn)定、不出現(xiàn)分層的MN，記錄各組分的比例。結(jié)果見表2，Smix與厚樸揮發(fā)油的比例為8∶2 時，形成的乳液更加穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)分層、絮凝或粒徑增大的情況，最終確定MN的最佳處方為EL-40-無水乙醇-厚樸揮發(fā)油的質(zhì)量比為6∶2∶2。

表2 Smix 與油相比例篩選結(jié)果Table 2 Ratio screening result of Smix and oil

2.4 MN 的質(zhì)量評價

2.4.1 宏觀和微觀形態(tài)觀察 采用透射電子顯微鏡對MN 的微觀形態(tài)進行表征，取適量制備好的MN，用去離子水適當稀釋，滴在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，滴加質(zhì)量分數(shù)為1%的磷鎢酸溶液進行負染2 min，用濾紙吸取多余的溶液，自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察納米乳液的形態(tài)。結(jié)果如圖3 所示，MN經(jīng)透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納米乳外觀澄清、透明、微泛藍光，符合納米乳的制劑特征。

圖3 納米乳的宏觀和微觀形態(tài)Fig.3 Macroscopic and microscopic morphology of nanoemulsion

2.4.2 粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）和ζ 電位 按優(yōu)化后處方制備MN 3 批，取0.1 mL MN 并稀釋100 倍，在室溫下使用納米粒度儀測量納米乳液的平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）以及ζ 電位。結(jié)果如圖4、5 所示，MN平均粒徑為（61.56±1.67）nm，PDI 為0.16±0.37，ζ 電位為（-21.37±0.45）mV，呈正態(tài)分布。

圖4 MN 的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of MN

圖5 MN 的ζ 電位分布Fig.5 ζ potential distribution of MN

2.4.3 pH 值及黏度 按最優(yōu)處方平行制備3 批MN，使用pH 計和旋轉(zhuǎn)黏度計于室溫條件下測定其pH 值，各平行3 次。測量結(jié)果表明，最優(yōu)處方MN的pH 值為6.07±0.07，黏度為（54.49±0.99）mPa·s。

2.4.4 包封率的測定 參照文獻方法[12]，測定了MN 中游離油和總油的含量，并根據(jù)以下方程計算納米乳的包封率。將2 mL MN 加入5 mL 正己烷中，振蕩1 min，靜置分層后取上層有機相，在361 nm 處測定其A值，所得值為游離油含量；取4 mL MN 在400 W 超聲破碎10 min，使其破乳，加入10 mL 正己烷后振蕩1 min，靜置分層，取上層有機相在361 nm 處測定其A值[13]，所得值為總油含量。將游離油含量和總油含量代入標準曲線，用公式計算得到MN 的包封率為（85.25±0.50）%。

包封率＝(總油量-游離油量)/總油量

2.5 MNG 的制備

2.5.1 成膠時間的測定 采用傾斜法測定成膠時間，海藻酸鈉和透明質(zhì)酸溶液接觸后開始計時，然后傾斜西林瓶，觀察溶液的流動情況，待傾斜西林瓶時體系不再流動則停止計時，該時間即為成膠時間。

2.5.2 空白水凝膠基質(zhì)的選擇 以成膠時間為評價指標，優(yōu)化水凝膠的處方比例。取透明質(zhì)酸溶解在蒸餾水中，形成質(zhì)量濃度為10、20、30 mg/mL 的均勻溶液；海藻酸鈉溶解在蒸餾水中，形成質(zhì)量濃度為10、20、30、40 mg/mL 的均勻溶液。

將等體積的海藻酸鈉和透明質(zhì)酸溶液混合均勻，并直至成膠。形成的空白水凝膠基質(zhì)根據(jù)組成基質(zhì)的初溶液質(zhì)量濃度進行命名（例如20 mg/mL 的海藻酸鈉溶液和30 mg/mL 的透明質(zhì)酸溶液形成的空白基質(zhì)命名為S2H3），優(yōu)選最優(yōu)成膠比。各組水凝膠混合1 min 時的成膠狀態(tài)見圖6，可以發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉和透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度均對水凝膠的成膠狀態(tài)有顯著影響，隨著二者質(zhì)量濃度的增大，1 min 時水凝膠越來越穩(wěn)定。

當海藻酸鈉質(zhì)量濃度和透明質(zhì)酸質(zhì)量濃度均為10 mg/mL 時，無法形成穩(wěn)定的水凝膠。當海藻酸鈉質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，隨著透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度由20 mg/mL 增大到40 mg/mL，成膠時間由301.67 s 縮短至216.17 s，水凝膠趨于穩(wěn)定。當海藻酸鈉質(zhì)量濃度為30 mg/mL 時，隨著透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度由10 mg/mL 增大至40 mg/mL，成膠時間進一步由172.34 s 縮短至26.91 s，水凝膠趨于穩(wěn)定且在透明質(zhì)酸質(zhì)量濃度為40 mg/mL 時達到最佳水凝膠狀態(tài)。

2.5.3 載藥納米乳水凝膠的制備 取最優(yōu)比透明質(zhì)酸和海藻酸鈉粉末用MN 溶解，并繼續(xù)攪拌15 min，即得MNG。

2.6 MNG 的質(zhì)量評價

2.6.1 微觀形態(tài)特征 將凍干后的樣品進行噴金處理，通過光電聯(lián)用成像系統(tǒng)觀察其表面形態(tài)、支架結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖7 所示，水凝膠的孔隙與孔隙之間相互貫通，結(jié)構(gòu)整齊，形成的三維網(wǎng)格孔洞結(jié)構(gòu)均勻分布。

圖7 掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron image

2.6.2 pH 值及黏度測定 按最優(yōu)處方平行制備3 批MNG，應(yīng)用pH 計和旋轉(zhuǎn)黏度計于室溫條件下測定其pH 值，各平行3 次。測量結(jié)果表明，MNG 的pH值為6.07±0.07，黏度為（54 392.33±809.52）mPa·s。

2.6.3 體外模擬藥物釋放度測定 參考《中國藥典》2020 年版中的方法[14]配制人工模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）、人工模擬小腸液（simulated intestinal fluid，SIF）和人工模擬結(jié)腸液（simulated colonic fluid，SCF）來模擬人體消化。分別取MN和MNG 各1.0 g 置于透析袋中，放入SGF 中2 h，取出水洗后接著放入SIF 中消化4 h，最后放入SCF中42 h。前6 h 每隔0.5 h 取樣，后42 h 每隔1 h 取樣[15]，整個過程中溶液放置在37 ℃恒溫水浴鍋中并以100 r/min 振蕩，每次吸取5 mL 模擬液測定1次厚樸揮發(fā)油的含量，同時補足對應(yīng)的新鮮模擬液5 mL。使用正己烷萃取厚樸揮發(fā)油并根據(jù)A值計算出厚樸揮發(fā)油的含量，計算釋放率（R），R的計算公式如下。

R＝Rt/Mi

Rt為厚樸揮發(fā)油在t時刻的累積釋放量，Mi為最開始加入的厚樸揮發(fā)油的原始質(zhì)量

結(jié)果從圖8 中可得MN 和MNG 的最終累積釋放率分別為（89.83±0.50）%和（61.68±1.15）%，其結(jié)果表明，這2 種制劑最終釋放度有顯著性差異，MN 在SGF 消化過程中釋放較為明顯，累積釋放率為（34.32±0.89）%，MNG 在SGF 中釋放減少，累積釋放率為（19.37±1.39）%（0～2 h），其結(jié)果表明，這2 種制劑在0～2 h 釋放度有顯著性差異；MN 在SIF 消化過程中釋放率為（53.48±0.13）%，MNG 在SIF 中釋放較少，釋放率為（32.85±0.89）%（2～6 h），其結(jié)果表明，這2 種制劑在2～6 h 釋放度有顯著性差異；MN 在SCF 消化過程中釋放明顯，消化至24 h 釋放率為（89.05±0.20）%，而MNG在SCF 消化過程中呈緩慢逐漸釋放趨勢，至24 h 釋放率為（50.16±0.80）%，其結(jié)果表明，這2 種制劑在24 h 釋放度有顯著性差異。結(jié)果顯示，MN 在口服遞藥中易在胃和小腸中釋放，使其遞送至結(jié)腸部位時含量降低，而MNG 在胃和小腸內(nèi)相對穩(wěn)定，可以減少揮發(fā)油受胃和小腸侵蝕，達到結(jié)腸靶向的作用。

圖8 體外緩釋累積釋放曲線Fig.8 Cumulative release curve of sustained release in vitro

2.6.4 小鼠活體生物分布評價 24 只ICR 小鼠通過在7 d 內(nèi)自由飲用3% DSS 來誘導(dǎo)UC 小鼠模型，而后將其隨機分為MN 組、MNG 組、Free-DiR 組，每組8 只。制備含有相同質(zhì)量濃度DiR 的各組制劑，使用酶標儀檢測其DiR 熒光含量，分別以DiR 0.5 mg/kg 的劑量給小鼠ig，小鼠分別在ig 給藥后4 個不同時間點（3、6、12、24 h），使用活體成像系統(tǒng)對小鼠進行成像，并在24 h 處死剩余全部小鼠，從體內(nèi)分離結(jié)腸后立即檢測熒光。

結(jié)果如圖9 所示，給藥3 h 或6 h 后，各組熒光差異非常小。在12 h 時，MNG 組的結(jié)腸部位熒光強度最強，其次是MN 組和Free-DiR 組，這種狀態(tài)一直持續(xù)到24 h 結(jié)束，且在24 h 解剖小鼠后結(jié)腸中凝膠組的熒光強度依然很強，如圖10 所示。然而，MN 組和Free-DiR 組的熒光值趨勢非常相似，可能由于沒有凝膠外層保護的情況下而過早降解，繼而不能再體內(nèi)凸顯納米乳凝膠的靶向作用。因此，小鼠全身熒光變化的結(jié)果突出了納米乳凝膠可以在口服遞送中保護揮發(fā)油減少胃和小腸侵蝕的優(yōu)勢。

圖9 活體生物分布圖Fig.9 Living organisms distribution maps

圖10 熒光結(jié)腸分布圖Fig.10 Fluorescent colon distribution maps

2.7 MNG 對UC 的治療作用

2.7.1 分組與造模 60 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，稱定質(zhì)量并標號，隨機分為空白組（10 只）以及造模組（50 只）?？瞻捉M給予自由飲用蒸餾水，造模組自由飲用配制的3% DSS 水溶液，飲用3 d，隔天更換新鮮DSS 溶液。在第3 天造模結(jié)束后，根據(jù)疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分對模型進行評價，DAI 評分＞1 分為造模成功[16]。50 只小鼠均造模成功，再將其隨機分為模型組、柳氮磺吡啶組、空白揮發(fā)油組、MN 組、MNG 組，每組10只，繼續(xù)給予3% DSS 水溶液自由飲用4 d。

2.7.2 藥物處理 依據(jù)《中國藥典》2020 年版[14]，規(guī)定厚樸飲片用量為3～10 g，以成人體質(zhì)量70 kg 用藥劑量為10 g 計，參照《中藥藥理研究方法學(xué)》[17]，結(jié)合厚樸揮發(fā)油得率（約為0.25%），根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，按照厚樸揮發(fā)油最高給藥劑量為26 mg/kg，使制得的MN、MNG 中發(fā)汗厚樸揮發(fā)油的含藥量為26 mg/kg，從造模第3 天開始，分別給予小鼠ig，柳氮磺吡啶組ig 給予柳氮磺吡啶混懸液（200 mg/kg），空白組和模型組ig 給予等體積的蒸餾水，所有小鼠ig 體積均為10 mL/kg，每天1 次，連續(xù)給藥7 d，每天早晨觀察小鼠一般情況，記錄DAI 評分。

2.7.3 標本制備與采集 第9 天完成給藥，第10 天脫頸處死小鼠，再將小鼠的結(jié)腸從腹腔中完整取出，測量結(jié)腸長度拍照后取出腸內(nèi)容物，稱取結(jié)腸質(zhì)量，注意不要將結(jié)腸弄破，將其分為兩端段，一段用冰PBS 漂洗后用錫箔紙包裹，凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于Elisa 實驗；另一段置于4%多聚甲醛溶液中固定，常溫放置，用于結(jié)腸組織HE 染色和免疫熒光實驗。

2.7.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，各組間比較采用單因素方差分析比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7.5 小鼠的糞便性狀、便血情況及DAI 評分的影響 自實驗第1 天起，每天于相同時間段內(nèi)，觀察記錄小鼠的體質(zhì)量、腹瀉、便血、活動狀態(tài)和死亡情況。結(jié)腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)評分標準見表3。

表3 DSS 小鼠DAI 評分標準Table 3 DAI scoring standard of DSS mice

DAI＝(體質(zhì)量丟失評分＋腹瀉評分＋便血評分)/3

結(jié)果如圖11 顯示，在第10 天治療結(jié)束時，空白組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，大便正常，肛門無出血。與空白組相比，模型組小鼠DAI 評分明顯升高（P＜0.001），精神萎靡，食欲減退，毛發(fā)暗淡，出現(xiàn)腹瀉、血便。與模型組相比，柳氮磺吡啶組的小鼠DAI 評分顯著降低（P＜0.001），MNG組的小鼠DAI 評分明顯降低（P＜0.01），小鼠精神狀態(tài)良好，食欲有增加，毛發(fā)更有光澤，腹瀉及血便情況好轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，相比于空白揮發(fā)油及MN組，MNG 具有更好的治療效果，藥效更佳。

圖11 DAI 評分的影響 (±s, n = 10)Fig.11 Effect on DAI score (±s, n = 10)

2.7.6 對小鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸單位長度質(zhì)量和脾臟系數(shù)的影響 末次給藥后處死小鼠，取小鼠結(jié)腸和脾臟。直尺測量結(jié)腸自然長度，并拍照。濾紙吸干結(jié)腸及脾臟外表面血液，稱量并記錄小鼠結(jié)腸及脾臟質(zhì)量。

脾臟系數(shù)＝小鼠脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量

結(jié)腸單位長度質(zhì)量＝結(jié)腸質(zhì)量/結(jié)腸長度

結(jié)果如圖12 和表4 顯示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.001），脾臟系數(shù)和單位長度結(jié)腸質(zhì)量顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組及MNG 組的小鼠結(jié)腸長度顯著增加（P＜0.01、0.001）；MNG 組及柳氮磺吡啶組脾臟系數(shù)顯著降低（P＜0.001），MN 組及空白揮發(fā)油組脾臟系數(shù)明顯降低（P＜0.05、0.01）；柳氮磺吡啶及MNG組單位結(jié)腸質(zhì)量系數(shù)顯著降低（P＜0.01、0.001）。結(jié)果表明，相比于空白揮發(fā)油及MN 組，MNG 組具有更好的治療效果，藥效更佳。

圖12 對結(jié)腸長度的影響Fig.12 Effect on colon length

表4 對結(jié)腸長度、結(jié)腸單位長度質(zhì)量和脾臟指數(shù)的影響(±s, n = 10)Table 4 Effect on colon length, colon unit length weight and spleen index (±s, n = 10)

表4 對結(jié)腸長度、結(jié)腸單位長度質(zhì)量和脾臟指數(shù)的影響(±s, n = 10)Table 4 Effect on colon length, colon unit length weight and spleen index (±s, n = 10)

與空白組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01***P＜0.001；表5 同。###P ＜ 0.001 vs blank group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group; same as table 5.

組別 脾臟系數(shù) 結(jié)腸長度/cm 結(jié)腸單位長度質(zhì)量/(μg·cm-1)空白 3.02±0.67 8.33±0.44 26.65±5.78模型 7.04±0.70### 5.69±1.00### 43.12±2.10###空白揮發(fā)油 5.76±1.05* 6.22±0.90 38.71±2.10 MN 5.49±0.83** 6.32±0.90 38.13±4.38 MNG 3.98±0.98*** 6.95±0.38** 33.06±5.44**陽性 3.85±0.55*** 7.45±0.91*** 30.90±4.91***

2.7.7 HE 染色觀察小鼠結(jié)腸黏膜病理變化 取多聚甲醛固定的結(jié)腸組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋和組織切片后，HE 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)、黏膜、杯狀細胞、絨毛排列和炎性細胞浸潤等形態(tài)表現(xiàn)并拍照。結(jié)果如圖13 顯示，空白組小鼠腸道組織細胞飽滿且排列整齊，黏膜完整，杯狀細胞明顯，腺體排列規(guī)則，隱窩結(jié)構(gòu)清晰可見。與空白組相比，模型組小鼠腸道組織細胞出現(xiàn)上皮細胞破損且排列紊亂，腸道黏膜受損，腺體排列紊亂，隱窩有不同程度的損壞，存在有大量的炎性細胞浸潤現(xiàn)象。與模型組相比，各給藥組小鼠的結(jié)腸黏膜受損情況有所改善，炎性細胞浸潤減少，腺體排列規(guī)則，杯狀細胞明顯增多，隱窩結(jié)構(gòu)恢復(fù)，且MNG組恢復(fù)情況優(yōu)于空白揮發(fā)油及MN 組。

圖13 對小鼠結(jié)腸組織病理的影響 (HE 染色)Fig.13 Effect on colon histopathology of mice (HE staining)

2.7.8 對小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響取各組小鼠結(jié)腸組織，稱定質(zhì)量，加適量PBS，勻漿，離心，收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測IL-6、IL-10、TNF-α 水平。結(jié)果表5 顯示，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.001），IL-10 的水平顯著降低（P＜0.001）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組及MNG 組小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P＜0.001），IL-10 水平明顯升高（P＜0.05、0.01）；MN 組TNF-α、IL-6 水平明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，MNG 可有效抑制促炎因子分泌、增強抗炎因子的分泌來抑制腸道炎癥。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 含量(±s, n = 10)Table 5 Contents of TNF-α, IL-6 and IL-10 in colon tissue of mice in each group (±s, n = 10)

表5 各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 含量(±s, n = 10)Table 5 Contents of TNF-α, IL-6 and IL-10 in colon tissue of mice in each group (±s, n = 10)

組別 IL-6/(pg·mL-1) IL-10/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1)空白 19.84±1.76 67.89±6.85 87.44±8.04模型 30.71±3.40### 44.85±10.09### 127.59±20.14###空白揮發(fā)油 28.90±4.00 52.01±5.25 113.65±13.50 MN 26.05±2.30** 53.76±9.87 103.07±9.73**MNG 22.86±2.04*** 57.64±8.13* 100.07±10.68***陽性 22.37±2.05*** 59.67±8.71** 100.98±10.68***

2.7.9 免疫熒光法觀察小鼠結(jié)腸組織中claudin-1 和ZO-1 蛋白的表達 取結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟至水；檸檬酸鹽緩沖液80 ℃修復(fù)抗原20 min，PBS 沖洗5 min×3；滴加山羊血清室溫封閉20 min，PBS 沖洗5 min×3；滴加一抗claudin-1 和ZO-1，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS 沖洗5 min×3，滴加對應(yīng)二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗5 min×3；滴加DAPI室溫孵育10 min，PBS 沖洗5 min×3 后，使用抗熒光衰減封片劑進行封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

結(jié)果如圖14 顯示，空白組小鼠結(jié)腸組織中claudin-1 和ZO-1 蛋白在結(jié)腸黏膜呈連續(xù)性高表達，充滿整個視野，模型組小鼠組織中claudin-1 和ZO-1 蛋白在結(jié)腸黏膜的表達呈間斷性，熒光強度明顯下降；與模型組相比，空白揮發(fā)油組和MN 組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白claudin-1 和ZO-1 表達范圍增加，但熒光強度較弱，MNG 組和陽性組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白claudin-1 和ZO-1 在結(jié)腸熒光強度明顯增加，熒光較強。結(jié)果表明，MNG 可以提高claudin-1、ZO-1 緊密連接蛋白的表達改善結(jié)腸黏膜屏障損傷。

圖14 各組中claudin-1 和ZO-1 蛋白表達Fig.14 Expression of claudin-1 and ZO-1 proteins in each group

3 討論

厚樸主要化學(xué)成分包括生物堿類、木脂素類、揮發(fā)油等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明厚樸揮發(fā)油具有明顯的抗炎[18]、抗氧化[19]、抗菌[20]等生物活性，具有廣闊的應(yīng)用前景。但厚樸揮發(fā)油理化性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、氧氣、高溫會發(fā)生活性成分的降解、揮發(fā)現(xiàn)象，這與其所含主要活性成分倍半萜、萜烯及含氧衍生物[21]等有關(guān)。與此同時，口服遞送厚樸揮發(fā)油受胃腸道pH 值、首過效應(yīng)及在腸道代謝的影響，會降低其療效，因此，如何提高厚樸揮發(fā)油穩(wěn)定性并將其有效遞送到炎癥部位，成為利用厚樸揮發(fā)油治療UC 亟待解決的關(guān)鍵問題。為改善揮發(fā)油理化性質(zhì)穩(wěn)定性差、易降解的問題，本實驗將揮發(fā)油制成納米乳，增加其穩(wěn)定性和溶解度，外層用海藻酸鈉和透明質(zhì)酸制備了一層水凝膠，調(diào)控藥物在結(jié)腸釋放。透明質(zhì)酸[22]是一種表面帶負電荷的理想的結(jié)腸靶向藥物遞送材料，它可以通過靜電吸附粘附在炎癥粘膜上，提高納米乳的黏附性，增強藥物在結(jié)腸中的滯留；同時，海藻酸鈉[23]是一種對酸敏感的天然多糖材料，可以將更多的藥物遞送到結(jié)腸部位，大大提高藥物的生物利用度，實現(xiàn)局部、持續(xù)的藥物釋放作用。

在體外模擬胃腸道pH 值環(huán)境的藥物釋放結(jié)果表明，外層水凝膠的包裹能有效減少在胃和小腸的藥物突釋，并在結(jié)腸下持續(xù)釋放藥物。小動物活體成像實驗證明了MNG 具有結(jié)腸靶向的趨勢，提示外層水凝膠可以保護藥物過早釋放，并達到藥物緩釋作用。藥效學(xué)等結(jié)果表明，MNG 能調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，提高claudin-1、ZO-1 緊密連接蛋白的表達改善結(jié)腸黏膜屏障損傷。

綜上，本實驗制備的MNG 不僅制備簡單、工藝成熟，解決厚樸揮發(fā)油易揮發(fā)、穩(wěn)定性差的制劑難題的同時，可以增強了藥物在胃腸道穩(wěn)定性，實現(xiàn)結(jié)腸靶向釋放，其緩釋作用可使藥物延長治療結(jié)腸黏膜炎癥的時間，因而賦予MNG 具有緩釋與靶向的雙重功能，為厚樸揮發(fā)油綜合開發(fā)利用和抗UC 新藥的開發(fā)提供解決候選方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突