楊增強(qiáng) 郝飛虎 原天祎 周治衡 崔泳

激素性股骨頭壞死（steroid-induced necrosis of femoral head, SINFH）是因為長期使用糖皮質(zhì)激素及其衍生藥物導(dǎo)致的嚴(yán)重骨科疾病。SINFH的主要病理學(xué)特點是骨細(xì)胞和骨髓的慢性持續(xù)性壞死，最終導(dǎo)致股骨頭的破壞坍塌[1-3]。雖然藥物治療及核心減壓對SINFH 有一定的效果[4]，但早期的干預(yù)也只能減輕激素的副作用[5]。因此，尋找SINFH的發(fā)病機(jī)制和早期治療的有效方法在骨科領(lǐng)域至關(guān)重要。

既往研究表明，SINFH 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的成骨能力和成脂能力失衡有關(guān)[6]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向受骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）、Wnt 和Notch 等信號通路，Runx2、C/EBP 和PPARγ 等轉(zhuǎn)錄因子，非編碼RNA，激素及線粒體等眾多因素的調(diào)控，任何環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致病理狀態(tài)的發(fā)生[7]。

非編碼RNA（noncoding RNA, ncRNAs）是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子RNA，可以調(diào)控基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[8-9]，在SINFH 中發(fā)揮著重要作用[10-11]。CTNNB1 基因可以編碼蛋白質(zhì)β-連環(huán)蛋白（β-Catenin），參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，以及調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收之間的平衡[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p和CTNNB1的表達(dá)失衡與SINFH 有關(guān)[13]。同時，miR-124 對人類BMSC的生物學(xué)功能有一定的影響[14]。然而，miR-124-3p、CTNNB1在SINFH中的作用和分子機(jī)制仍不清楚。本研究主要探討SINFH 中miR-124-3p 對BMSCs 的調(diào)控作用及其與CTNNB1 的相關(guān)性，明確miR-124-3p 對BMSCs 的調(diào)控作用，為SINFH的診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）；超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司）；低溫冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；Real-time檢測儀（美國Thermo Fisher公司）；研究級倒置顯微鏡（中國廣州市明美科技有限公司）；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（中國武漢普諾賽生命科技有限公司）；F12K培養(yǎng)基、FBS（美國Hyclone 公司）；miR-124-3P NC、miR-124-3P mimic、 miR-124-3p inhibitor、 CTNNB1-3'UTR-WT、CTNNB1-3'UTR-MUT 載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；DMEM、血清、胰酶（美國Gibco 公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）；Trizol 試劑、Lipofectamine? 3 000（美國Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）；抗CTNNB1 抗體（美國Abcam公司）。

1.2 一般資料

1.2.1 病例選擇

選擇在2020 年9 月到2022 年5 月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者，術(shù)中擴(kuò)髓時收集骨髓組織。期間收集SINFH 患者病例20 例隨機(jī)選擇15 例作為實驗組，收集股骨頸骨折（無SINFH）患者病例28例隨機(jī)選擇15例作為對照組。SINFH診斷定義為平均每日使用類固醇激素劑量16.6 mg 或最高每日劑量80 mg，至少1年[15]，由磁共振圖像確認(rèn)。有慢性疾病、癌癥或飲酒的患者被排除在外。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（XYDWFYLS-2019-06），所有方法均按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行，患者已知曉此研究并取得同意。

1.2.2 BMSCs來源

細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，其中含有10%胎牛血清細(xì)胞（fetal bovine serum, FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素。用甲潑尼龍（輝瑞，美國）處理細(xì)胞建立SINFH細(xì)胞模型，濃度為4 mg/106個細(xì)胞，每8 h 1次，共處理5次。培養(yǎng)在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，用于后續(xù)實驗。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p以及CTNNB1表達(dá)

收集實驗組和對照組擴(kuò)髓時的骨髓組織，采用Trizol法提取總RNA，純化，逆轉(zhuǎn)錄獲取互補(bǔ)cDNA。反應(yīng)體系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，95℃退火5 s，72℃延伸30 s。各引物及其序列如表1 所示。以U6 為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p及CTNNB1表達(dá)量。

表1 反應(yīng)體系中各引物及其序列

1.3.2 Western Blot檢測CTNNB1蛋白的表達(dá)水平

用冰凍的含蛋白酶抑制劑的放射性免疫沉淀試驗（RIPA）裂解緩沖液從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。用10%SDS-PAGE 分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用脫脂干牛奶阻斷后，用特異性一抗孵育膜。然后用酶標(biāo)二抗孵育膜。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參蛋白，測定CTNNB1蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

分別用無血清培養(yǎng)基稀釋miR-124-3p mimic、miR-124-3p mimic NC、miR-124-3p inhibitor（DNA含量為3 μg），根據(jù)Lipofectamine? 3 000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染。依次分為BMSC 組、BMSC+miR124-3p+NC 組、BMSC+miR124-3p+inhibitor 組、BMSC+miR124-3p+mimics 組。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞。

1.3.4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-124-3p和CTNNB1的表達(dá)

取上述細(xì)胞接種于24孔板，各組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，提取RNA 進(jìn)行q-RTPCR 檢測，其反應(yīng)體系、引物、條件同前。PCR擴(kuò)增后，實時熒光定量PCR儀自動分析結(jié)果，采用2-△△CT法計算miR-124-3p 和CTNNB 的相對表達(dá)量。Western Blot操作同前。

1.3.5 分化能力評估

取轉(zhuǎn)染分組后細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，使其匯合度為70% ～ 80%。分為兩組，分別棄去原培養(yǎng)基，一組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)（osteoblasts induction, OI）分化，添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（內(nèi)含50 mM 抗壞血酸、100 nM 地塞米松、10 mM β‐磷酸甘油和15%胎牛血清），另一組進(jìn)行成脂誘導(dǎo)（adipogenic induction, AI）分化，添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（內(nèi)含10 μg/mL 胰島素，1 μM 地塞米松，0.5 mM IBMX 和0.1 mM吲哚美辛）。2 d換液一次，15 d后分別進(jìn)行茜素紅染色和油紅O染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 miR-124-3p與CTNNB1的靶向驗證

利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase 預(yù)測miR-124-3p 與CTNNB1的結(jié)合位點。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，使其匯合度為70% ～ 80%。按照試劑盒說明書步驟提取質(zhì)粒，然后將miR-124-3p mimics和提取的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)BMSCs。具體組別為CTNNB1-3'UTR-WT+NC、CTNNB1-3'UTR-WT+hsa-miR-124-3p mimic、CTNNB1-3'UTR-MUT+hsa-miR-124-3p mimic，48 h后，依據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）使用說明檢測海腎熒光素酶（RL）和螢火蟲熒光素酶（FL）的強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗，兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者BMSCs 中miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p及CTNNB1表達(dá)

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，實驗組BMSCs中miR-124-3p的表達(dá)量低于對照組，miR-125a-3p 和CTNNB1 的表達(dá)量高于對照組（P＜0.001），miR-322-5p的表達(dá)量未見明顯差異，見圖1。

圖1 qRT-PCR實驗結(jié)果：A. miR-124-3p表達(dá)水平；B. miR-322-5p表達(dá)水平；C. miR-125a-3p表達(dá)水平；D. CTNNB1表達(dá)水平

2.2 Western Blot檢測CTNNB1蛋白的表達(dá)水平

Western Blot結(jié)果顯示，實驗組CTNNB1蛋白表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖2。

圖2 CTNNB1 蛋白Western Blot 檢測結(jié)果：A. CTNNB1 蛋白電泳條帶；B. CTNNB1相對表達(dá)水平

2.3 轉(zhuǎn)染后各組miR-124-3p和CTNNB1表達(dá)比較

轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimics組miR-124-3p表達(dá)量高于BMSC組和BMSC+miR124-3p+NC 組（P＜0.001），而CTNNB1表達(dá)量低于BMSC組和BMSC+miR124-3p+NC組（P＜0.001）；轉(zhuǎn)染miR-124-3p inhibitor 組miR-124-3p 表達(dá)量低于BMSC組和BMSC+miR124-3p+NC 組（P＜0.001），CTNNB1表達(dá)量高于BMSC 組和BMSC+miR124-3p+NC 組（P＜0.001），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組miR-124-3p 和CTNNB1 表達(dá)量：A. 轉(zhuǎn)染后miR-124-3p的表水平；B. 轉(zhuǎn)染后CTNNB1的表達(dá)水平

2.4 轉(zhuǎn)染后CTNNB1蛋白的表達(dá)水平

Western Blot 結(jié)果顯示，BMSC 組和轉(zhuǎn)染miR-124-3p+NC組CTNNB1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有差異。轉(zhuǎn)染miR-124-3p+inhibitor 組和BMSC 組相比，CTNNB1 蛋白表達(dá)水平較高（P＜0.001）。轉(zhuǎn)染miR-124-3pmimics 組和BMSC 組相比，CTNNB1蛋白表達(dá)水平較低（P＜0.001）。結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后CTNNB1 蛋白Western Blot 檢測結(jié)果：A. CTNNB1 蛋白電泳條帶；B. 各組CTNNB1表達(dá)水平

2.5 分化能力評估

2.5.1 成骨分化結(jié)果

BMSCs成骨誘導(dǎo)15 d后進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示各組有紅色鈣結(jié)節(jié)形成，提示成功誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，結(jié)果見圖5。

圖5 成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果：A. BMSCs+OI組；B. BMSCs+OI+NC組；C. BMSCs+OI+miR-124-3p+mimic組；D. BMSCs+OI+inhibitor組

2.5.2 成脂誘導(dǎo)結(jié)果

BMSCs 成脂誘導(dǎo)15 d 后進(jìn)行油紅O 染色，結(jié)果顯示，各組有脂滴形成，提示成功誘導(dǎo)BMSCs 向脂肪細(xì)胞分化，結(jié)果見圖6。

圖6 成脂誘導(dǎo)結(jié)果：A. BMSCs+AI 組；B. BMSCs+AI+NC 組；C. BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 組；D. BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor組

2.5.3 成骨和成脂誘導(dǎo)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

在對成骨誘導(dǎo)實驗結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與BMSCs+OI組和BMSCs+OI+NC 組相比，BMSCs+OI+miR-124-3p mimic組染色區(qū)域擴(kuò)大（P＜0.01）；BMSCs+OI+miR-124-3p inhibitor 組染色區(qū)域減?。≒＜0.01），這提示BMSCs+OI+miR-124-3p mimic組鈣沉積多于其他組，過表達(dá)miR-124-3p可以促進(jìn)BMSCs 的成骨分化；抑制miR-124-3p 表達(dá)則結(jié)果相反，結(jié)果見圖7。

圖7 染色區(qū)域相對面積：A. 成骨誘導(dǎo)茜素紅染色區(qū)域相對面積； B. 成脂誘導(dǎo)油紅O染色區(qū)域相對面積

在對成脂誘導(dǎo)實驗結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與BMSCs+AI 組和BMSCs+AI+NC 相比， BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 組染色區(qū)域減少（P＜0.01），BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor 組染色區(qū)域擴(kuò)大（P＜0.01），這提示BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor 組脂滴形成增多，而BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 組脂滴形成較少，過表達(dá)miR-124-3p 可抑制BMSCs 的成脂分化；抑制miR-124-3p 表達(dá)則結(jié)果相反，結(jié)果見圖7。

2.6 miR-124-3p與CTNNB1的靶向驗證結(jié)果

Starbase 數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)，CTNNB1-3'UTR 含有miR-124-3p的結(jié)合位點。實驗結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimic 的野生型CTNNB1 熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性下降（P＜0.01）。而CTNNB1-MUT 組與對照組熒光素酶活性相比，兩者活性相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明CTNNB1-WT 與miR-124-3p 存在靶向關(guān)系，結(jié)果見圖8。

圖8 CTNNB1 與miR-124-3p 的結(jié)合位點和雙熒光素酶實驗結(jié)果：A. CTNNB1與miR-124-3p的結(jié)合位點；B. 雙熒光素酶實驗結(jié)果

3 討論

激素性股骨頭壞死（SINFH）是激素的副作用導(dǎo)致的髖關(guān)節(jié)退行性病變。截至目前，其潛在的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，這限制了人們對激素性股骨頭壞死的診斷和治療，雖然早期可以通過髓內(nèi)減壓和移植骨瓣等手段緩解病情[16-17]，但遠(yuǎn)期的效果并不理想，給醫(yī)生和患者帶了很大困擾。

MiRNA作為一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著重要作用[18]。大量的研究表明，miRNAs 參與調(diào)控脂質(zhì)和骨代謝[19-20]，從而影響SINFH 的發(fā)生發(fā)展過程。在本研究中，筆者證實miR-124-3p和miR-125a-3p在實驗組和對照組中差異表達(dá)，且實驗組miR-124-3p 表達(dá)量低于對照組，miR-125a-3p 表達(dá)量高于對照組。miR-124-3p作為一種基因調(diào)控因子，對細(xì)胞的增殖、凋亡和分化起著很重要的作用，miR-124-3p可以與STAT3結(jié)合抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。同時miR-124-3p可以調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和凋亡[22-24]，過表達(dá)miR-124-3p 可以增強(qiáng)細(xì)胞活性，減緩細(xì)胞凋亡。有學(xué)者在對綿羊基質(zhì)血管組分（stromal vascular fraction, SVF）分化研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-124-3p 可以減弱SVF 成脂作用，抑制miR-124-3p 表達(dá)則結(jié)果相反[25]。這與本研究結(jié)果吻合，本研究中過表達(dá)miR-124-3p促進(jìn)了BMSCs 的成骨作用，減弱了BMSCs 的成脂作用。過量激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可造成骨標(biāo)志物Alpl、Bglap 和Runx2 的降低，但過表達(dá)miR-124-3p 可以逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生理活動，促進(jìn)Alpl、Bglap和Runx2等成骨標(biāo)志物的表達(dá)[26]。

CTNNB1編碼β-catenin蛋白，鈣粘蛋白黏附復(fù)合物的組成部分，調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞黏附和典型Wnt信號通路中的基因表達(dá)，典型的Wnt/β-catenin信號通路是祖細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)因子，是各種人類疾病發(fā)病機(jī)制的核心，包括那些影響骨骼發(fā)育和腫瘤進(jìn)展的疾病。在維持關(guān)鍵的生物穩(wěn)態(tài)方面受到高度調(diào)控。CTNNB1的異常積累與大多數(shù)癌癥有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制CTNNB1可抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)CTNNB1可以促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡[27]。CTNNB1 變異與兒童硬化性骨發(fā)育不良和腎上腺皮質(zhì)腺瘤[28]、痙攣性雙癱瘓和視覺缺陷的神經(jīng)發(fā)育障礙[29]以及子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和侵襲[30]緊密相關(guān)。大量研究證實，Wnt信號通路可以調(diào)節(jié)骨骼和骨量發(fā)育，激活Wnt/β-catenin 信號通路可以促進(jìn)BMSCs 的成骨分化[31-33]。β-catenin 是Wnt 信號通路的組成部分，并且是該信號通路的核心蛋白，其活性和含量對BMSCs的成骨分化具有重要作用[34]。本研究中雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，miR-124-3p與CTNNB1 有潛在的結(jié)合位點，提示miR-124-3p 可能在Wnt信號通路中發(fā)揮一定作用，然而miR-124-3p/CTNNB1發(fā)揮的功能、發(fā)揮功能的途徑及下游的靶基因仍需進(jìn)一步的研究。

在本研究中，筆者對激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死患者骨髓組織進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在SINFH患者體內(nèi)miR-124-3p的表達(dá)量下降，CTNNB1的表達(dá)量升高；進(jìn)一步實驗證實過表達(dá)miR-124-3p 可以促進(jìn)BMSCs 的成骨分化；同時miR-124-3p和CTNNB1有靶向結(jié)合關(guān)系。為激素性股骨頭壞死的研究提供了一個新思路，做出了一定的補(bǔ)充。

總而言之，本研究表明，miR-124-3p在SINFH患者中表達(dá)量下降，miR-124-3p 可以靶向結(jié)合CTNNB1，并且過表達(dá)miR-124-3p可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化。