董汛,周林,牛延菲,謝佳穎,陸雪萍,李小輝,楊增明

(1.云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111)

中藥材地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)的干燥根皮[1]。春初或秋后采挖根部,洗凈,剝?nèi)「?曬干。寧夏枸杞原產(chǎn)我國內(nèi)蒙古、山西北部、陜西北部、甘肅、寧夏等北部省區(qū),目前多栽培,以寧夏、甘肅等地栽培多、產(chǎn)量大。枸杞則廣泛分布于我國東北、河北、山西、陜西、甘肅南部以及西南、華中、華南和華東各省區(qū),多為野生[2]。地骨皮甘,寒。歸肺、肝、腎經(jīng)。具有涼血除蒸,清肺降火的功效。用于陰虛潮熱,骨蒸盜汗,肺熱咳嗽,咯血,衄血,內(nèi)熱消渴[1]。地骨皮藥材及飲片標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版(一部),以及《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第六冊(cè)[3]、《日本藥典》(JP 17)[4]等中藥材標(biāo)準(zhǔn)中?！吨袊幍洹芬?guī)定地骨皮飲片的炮制方法為“除去雜質(zhì)及殘余木心,洗凈,曬干或低溫干燥”。地骨皮藥材中地骨皮乙素的高效液相色譜測(cè)定和特征圖譜研究,已有相關(guān)報(bào)道[5-8],未見基于多指標(biāo)分析的藥材與飲片相關(guān)性研究報(bào)道。本文首次以地骨皮關(guān)鍵質(zhì)量屬性之地骨皮乙素含量、特征圖譜、浸出物、總灰分與酸不溶性灰分為指標(biāo),以多個(gè)代表性產(chǎn)地、多批代表性樣品為對(duì)象,對(duì)地骨皮藥材與飲片間的質(zhì)量相關(guān)性進(jìn)行了系統(tǒng)研究和分析,為相關(guān)中藥新藥的研究設(shè)計(jì)、藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理等提供參考。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司);Mettler Toledo XSE205電子天平、AB-204N電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);SX-2.5-12箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司);DHG-9037A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司);XY-500型洗藥機(jī)(南京遠(yuǎn)大干燥設(shè)備廠);CT-C-Ⅱ型熱風(fēng)循環(huán)烘箱(中國范群干燥設(shè)備有限公司)。

地骨皮藥材,采集自寧夏、甘肅,各產(chǎn)地代表性原植物標(biāo)本均經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館李嶸研究員鑒定為寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.),所有樣品依據(jù)法定標(biāo)準(zhǔn)[1]鑒定與檢驗(yàn),均符合規(guī)定,所有標(biāo)本和樣品保存于云南省藥物研究所。地骨皮乙素(批號(hào):20190524),自制,經(jīng)MS(Waters Xevo TQ-S,ESI、HRESI)、NMR(Bruker DRX-500,13C、1H、HSQC、COSY、HMBC、ROESY、HSQCTOCSY)、IR鑒定確證結(jié)構(gòu),經(jīng)標(biāo)定含量為90.68%[含量(%)=HPLC色譜純度-水分-熾灼殘?jiān)?溶劑殘留];地骨皮甲素(批號(hào):20190624),自制,經(jīng)MS、NMR鑒定結(jié)構(gòu),HPLC含量90.79%(面積歸一化法)。色譜純乙腈(Merck公司);三氟乙酸等其他試劑為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 地骨皮飲片炮制人工揀選,除去雜質(zhì)及殘余木心,篩去灰屑,洗藥機(jī)清洗(筒體轉(zhuǎn)速10 r·min-1,水壓0.4 MPa,沖洗時(shí)間60 s),熱風(fēng)循環(huán)烤箱50～60 ℃干燥,放涼,篩去灰屑,包裝。

2.2 地骨皮乙素含量測(cè)定方法地骨皮乙素是地骨皮的主要活性成分[9-11],專屬性強(qiáng)、含量較高[6,12],我們參照《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第六冊(cè))[3]地骨皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[6]方法,建立了地骨皮中地骨皮乙素含量測(cè)定方法。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱為Agilent ZORBAX C18SB-AQ Stable Bond Analytical(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%三氟乙酸水溶液(B),梯度洗脫程序:0～26 min,5%A→7% A;26～27 min,7% A→8% A;27～65 min,8% A→11% A;65～70 min,11% A→14% A;流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長280 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按地骨皮乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備取地骨皮乙素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇-1%冰醋酸溶液(1∶1)的混合溶液制成每1 mL含0.4 mg的溶液,搖勻,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備取本品粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液50 mL,稱定重量,加熱回流30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 地骨皮乙素含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性供試品溶液色譜圖(見圖1)中,供試品溶液目標(biāo)峰與對(duì)照品溶液色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、峰型一致;地骨皮乙素與相鄰峰(地骨皮甲素)分離度符合要求,地骨皮乙素色譜峰光譜純度良好(純度角度0.499,純度閾值0.801),該方法具有良好的專屬性。

圖1 22批地骨皮藥材及對(duì)應(yīng)飲片HPLC色譜圖(S1～S22)和對(duì)照特征圖譜(R)

2.3.2 精密度試驗(yàn)取地骨皮乙素對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣7次,記錄峰面積,結(jié)果7次峰面積的RSD為0.77%,表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察精密稱取地骨皮乙素對(duì)照品適量,加甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液制成濃度分別為4.116 0、1.646 4、0.823 2、0.411 6、0.247 0、0.164 6、0.082 3、0.041 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,記錄峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=4 452 013X+38 923,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,結(jié)果表明,地骨皮乙素在0.041 2～4.116 0 mg·mL-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取地骨皮藥材(批號(hào):2018110621)粉末,按已確定的方法(見“2.2.3”項(xiàng)下)進(jìn)行供試品溶液制備,依次于0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算地骨皮乙素含量,得到不同時(shí)間地骨皮乙素含量的RSD為1.11%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取地骨皮藥材(批號(hào):2018110621)粉末6份,每份約0.5 g,按“2.2”項(xiàng)下方法分別檢測(cè),結(jié)果6份樣品地骨皮乙素平均含量為4.73%,RSD為0.93%,表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)取地骨皮藥材(批號(hào):2018110621)粉末9份,每份約0.25 g,按“2.2”項(xiàng)下的方法,添加不同比例的地骨皮乙素對(duì)照品(1∶0.5、1∶1、1∶1.5),制成3 種濃度的供試品溶液各3份,分別檢測(cè),結(jié)果見表1?？偲骄厥章蕿?6.18%(92.97%～99.93%),RSD為2.85%,表明方法準(zhǔn)確度良好,符合相關(guān)要求。

表1 地骨皮乙素含量測(cè)定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特征圖譜照“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn),記錄色譜圖和各色譜峰的保留時(shí)間及峰面積。采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2.0版)》軟件對(duì)22批地骨皮藥材HPLC圖譜進(jìn)行分析,生成對(duì)照?qǐng)D譜,確定7個(gè)峰為共有特征峰。通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、DAD紫外光譜圖及峰純度檢查確定峰6為地骨皮乙素峰、峰7為地骨皮甲素峰。與地骨皮乙素對(duì)照品相應(yīng)的色譜峰(峰6)為S峰,計(jì)算上述穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)中其余6個(gè)特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,計(jì)算RSD,結(jié)果均小于3%,穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。

2.5 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定方法照《中國藥典》2020年版(四部)相關(guān)規(guī)定,分別進(jìn)行浸出物(通則2201,水溶性浸出物測(cè)定法 之熱浸法)、總灰分和酸不溶性灰分(通則2302)的測(cè)定。

2.6 樣品分析檢測(cè)對(duì)22批地骨皮藥材及對(duì)應(yīng)飲片分別進(jìn)行地骨皮乙素含量、特征圖譜、熱水浸出物、總灰分和酸不溶性灰分的分析測(cè)定,結(jié)果見表2,HPLC色譜圖及對(duì)照特征圖譜見圖1。特征圖譜與文獻(xiàn)[8-9]比較,藥材基原、供試品處理及供試品溶液制備(提取溶劑等)不同,色譜條件有差異,特征圖譜整體相似,各有不同。將記錄的各特征峰峰面積首先折算為單位質(zhì)量峰面積(相同供試品濃度下的峰面積),計(jì)算公式為:

表2 地骨皮藥材及對(duì)應(yīng)飲片檢測(cè)結(jié)果(%)

再用此結(jié)果計(jì)算平均峰面積及平均轉(zhuǎn)移率等,結(jié)果見表3。

表3 22批地骨皮藥材及對(duì)應(yīng)飲片特征圖譜特征峰峰面積統(tǒng)計(jì)分析

2.7 地骨皮藥材與飲片質(zhì)量相關(guān)性分析我們選擇以藥材、飲片檢測(cè)結(jié)果直接比較計(jì)算轉(zhuǎn)移率的方式進(jìn)行相關(guān)性研究,更合理的反映炮制前后地骨皮乙素、特征圖譜各特征峰、浸出物等內(nèi)在質(zhì)量的變化,凈制過程為物理過程,凈制去除的雜質(zhì)產(chǎn)生的重量損失,不宜引入相關(guān)性分析當(dāng)中。

22批次的檢測(cè)結(jié)果表明,炮制前后,浸出物平均轉(zhuǎn)移率為84.55%,RSD為9.01%,說明炮制工藝穩(wěn)定,清洗程度均一。

總灰分和酸不溶性灰分的轉(zhuǎn)移率較高,說明合格藥材的總灰分主要為生理灰分(內(nèi)在灰分),如薄壁細(xì)胞中草酸鈣砂晶等鈣鹽。產(chǎn)地加工未洗凈的殘留泥沙等,特別是嵌合在根皮凹陷部分或不同層理間的泥沙已經(jīng)很難再被清洗去除,如果再要清除它們,勢(shì)必造成浸出物等更大的損失。

地骨皮乙素平均轉(zhuǎn)移率僅有43.70%,且RSD較大,達(dá)48.39%。RSD較大可能與藥材、飲片取樣代表性有一定關(guān)系,也可能與藥材形狀大小等關(guān)系更大[7]。轉(zhuǎn)移率低可能是因?yàn)榈毓瞧ひ宜匾兹苡谒?。以峰面積計(jì)算,特征圖譜其余6個(gè)特征峰平均轉(zhuǎn)移率在43.32%～86.85%之間,RSD在31.94%～78.24%之間,部分峰的轉(zhuǎn)移率與地骨皮乙素(峰6)基本一致,其中,峰2、峰3、峰4轉(zhuǎn)移率較高,均超過了65%,峰4達(dá)87%,與浸出物轉(zhuǎn)移率基本一致,峰7(地骨皮甲素)的轉(zhuǎn)移率RSD較高,達(dá)78%。

3 討論

本文選擇地骨皮藥材和飲片的幾個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性指標(biāo),研究建立了HPLC檢測(cè)方法,或照藥典通則中的方法,對(duì)多個(gè)產(chǎn)地的炮制前后的多批藥材樣品和飲片樣品進(jìn)行檢測(cè),以檢測(cè)結(jié)果直接計(jì)算轉(zhuǎn)移率,直觀反映炮制前后各指標(biāo)的相關(guān)性,結(jié)果表明,浸出物平均轉(zhuǎn)移率為84.55%,以此為基礎(chǔ)進(jìn)行比較,總灰分和酸不溶性灰分的轉(zhuǎn)移率較高,達(dá)到96%以上,地骨皮乙素轉(zhuǎn)移率較低,僅為43.70%,6個(gè)特征峰轉(zhuǎn)移率有高有低。炮制前后地骨皮藥材和飲片幾個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)之間,轉(zhuǎn)移率嚴(yán)重不一致。在相關(guān)中藥的工藝質(zhì)量研究及生產(chǎn)質(zhì)量管理過程中,設(shè)計(jì)空間的確定、藥材與飲片質(zhì)量控制等,均應(yīng)充分考慮這種不一致性。

3.1 關(guān)于質(zhì)量相關(guān)性評(píng)價(jià)指標(biāo)地骨皮乙素是地骨皮藥材與飲片相關(guān)性的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。特征圖譜是目前常用的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),浸出物特別是水溶性浸出物傳統(tǒng)上就是中藥材及飲片整體質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo),也是清洗程度的衡量指標(biāo)?？偦曳?、酸不溶性灰分是地骨皮法定標(biāo)準(zhǔn)收載的質(zhì)量控制項(xiàng)目[1],且為地骨皮的主要風(fēng)險(xiǎn)項(xiàng)目[13]。以上指標(biāo)均為地骨皮關(guān)鍵質(zhì)量屬性指標(biāo),以它們作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià),能夠較全面地反映藥材與飲片間的相關(guān)性。

3.2 關(guān)于HPLC分析測(cè)定方法地骨皮乙素含量測(cè)定,經(jīng)提取方式選擇(超聲提取、回流提取)、提取溶劑選擇(50%甲醇、甲醇、甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液)、粉碎粒度選擇(過二號(hào)篩、三號(hào)篩、四號(hào)篩)、提取溶劑用量選擇(40、100、150 倍)、提取時(shí)間選擇(10、20、30、60 min)等試驗(yàn),擬定了供試品溶液制備方法;參考文獻(xiàn)[3,6]方法,試驗(yàn)確定了梯度洗脫條件和最佳色譜柱等色譜條件。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,擬定的測(cè)定方法用于地骨皮乙素含量測(cè)定和特征圖譜分析,分離度、精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、耐用性等良好,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3.3 關(guān)于飲片炮制和藥材與飲片質(zhì)量控制《中國藥典》2020年版[1]中,地骨皮藥材與飲片的總灰分和酸不溶性灰分的限度規(guī)定一致,均為不得過11.0%和3.0%。依據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道,地骨皮飲片的抽檢不合格率為26.4%,總灰分都是主要不合格項(xiàng)目。依據(jù)本文研究結(jié)果,合格藥材在炮制前后總灰分和酸不溶性灰分下降很少,清洗的作用極其有限,與此同時(shí),浸出物和地骨皮乙素等水溶性成分,特別是后者,則損失嚴(yán)重。因此,地骨皮飲片炮制,應(yīng)在加強(qiáng)采收及產(chǎn)地加工質(zhì)量控制,提高藥材質(zhì)量水平的基礎(chǔ)上,嚴(yán)格凈選質(zhì)量控制,盡量先行除去根皮表面的泥沙和灰屑;選擇適宜的洗藥設(shè)備和干燥設(shè)備,合理確定相關(guān)關(guān)鍵工藝參數(shù),在總灰分和酸不溶性灰分的去除,與浸出物和地骨皮乙素的保留之間,找到合理的平衡點(diǎn),確保地骨皮飲片的安全性和有效性。