曾卉 蒲騰達(dá) 蘇炳鳳 張程圓 樊俐俐

(海南省腫瘤醫(yī)院婦科,海南 海口 570312)

宮頸癌是女性臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,具有高發(fā)病率及高死亡率的特點(diǎn)[1]。導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的主要原因除了治療失敗外,就是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),而癌細(xì)胞的侵襲及遷移是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的核心步驟,因此探討細(xì)胞侵襲及遷移機(jī)制,抑制其發(fā)生、發(fā)展一直是臨床工作的重點(diǎn)及難點(diǎn)[2]。癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可使癌細(xì)胞失去上皮細(xì)胞典型形態(tài),并使細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生變化,從而為細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移提供有利條件,進(jìn)而使癌細(xì)胞易于定植、增殖,并具有自我更新、耐受放療及抗化療藥的能力,最終引起腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因此如何逆上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一[3]。目前臨床對(duì)于宮頸癌的治療主要采取放化療治療,而順鉑(DPP)是同步放化療的首選藥物,但隨著其不斷使用,DPP的耐藥性逐漸顯露,已經(jīng)成為化療失敗及預(yù)后不良的主要原因,因此闡明宮頸癌DPP耐藥機(jī)制就顯得尤為重要,這將有利于開(kāi)發(fā)新穎的治療策略,提高治療效果[4]。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步以及人類基因組計(jì)劃的順利完成,越來(lái)越多的研究證實(shí),非編碼RNA在包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥中發(fā)揮重要作用,如長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,Lnc RNA)可參與調(diào)控亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定等多種生物進(jìn)程,從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、遷移、耐藥等過(guò)程;微小RNA(mirco RNAs,miR)可起到轉(zhuǎn)錄因子、基因及蛋白水平的分子調(diào)控作用,從而影響細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程;此外,Lnc RNA還可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA靶向結(jié)合miR,從而調(diào)控其靶基因的表達(dá),進(jìn)而共同影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。SNHG3和miR-532是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與宮頸癌密切相關(guān)的非編碼RNA,其均在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7-8]。且starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示,SNHG3 和miR-532之間存在結(jié)合位點(diǎn),因此本文就SNHG3靶向miR-532逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移及DPP耐藥進(jìn)行研究探討,以期為臨床治療宮頸癌提供新的靶點(diǎn)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HUCEC正常宮頸上皮細(xì)胞(貨號(hào):XY1481,上海烜雅有限公司);HeLa宮頸癌細(xì)胞(貨號(hào):HT-X1651,深圳豪地華拓有限公司);AV3宮頸癌細(xì)胞(貨號(hào):CL-318h,武漢賽奧斯有限公司);MS751宮頸癌細(xì)胞(貨號(hào):MS751,上海賽百慷股份有限公司);WISH宮頸癌細(xì)胞(貨號(hào):SY4813,上海酶研有限公司);熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(型號(hào):CFX96,上海土森視覺(jué)有限公司);PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀(型號(hào):164-5051,美國(guó) Bio-Rad公司);紫外分光光度計(jì)(型號(hào):NP80,無(wú)錫萊弗思有限公司);實(shí)時(shí)Real-Time PCR 試劑盒(貨號(hào):7000,美國(guó) ABI 公司);Trizol試劑(貨號(hào):Invitrogen,上海文韌有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):RT3,上海海方有限公司);SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(貨號(hào):KGP113,江蘇凱基有限公司);質(zhì)粒大量提取試劑盒(貨號(hào):D1130,北京索萊寶有限公司);脂質(zhì)體2000(貨號(hào):AL7800-0.75 mL,上海吉至有限公司);E-cadherin抗體(貨號(hào):10204-T52,北京義翹神州有限公司);Vimentin抗體(貨號(hào):100254-T08,北京義翹神州有限公司);GAPDH抗體(貨號(hào):FNab03343,武漢菲恩生物科技有限公司);ECL檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):CDLG-4911,武漢純度生物科技有限公司);結(jié)晶紫(貨號(hào):G1061-500,北京索萊寶有限公司);CCK-8試劑(貨號(hào):SH-1558,北京凱詩(shī)源有限公司);二甲基亞砜(貨號(hào):D2650,上海睿安有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常宮頸上皮細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞,在5% CO2、 37 ℃的條件,置于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)箱培養(yǎng),培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁到達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)2～3代,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Real-time PCR法檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá) 嚴(yán)格按照實(shí)時(shí)Real-Time PCR試劑盒步驟檢測(cè)HUCEC正常宮頸上皮細(xì)胞和4種宮頸癌細(xì)胞系中的SNHG3及miR-532 mRNA表達(dá),分別取待檢測(cè)細(xì)胞,消化、離心后,將其以密度1×106/mL接種于6孔板中,PBS洗滌3次,于冰上加入1 mL裂解液,搖勻后,用Trizol 試劑提取總RNA,提取完成后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度,用電泳儀檢測(cè)其完整性,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄完成后將cDNA、熒光染料、引物合無(wú)酶水按照說(shuō)明書比例混合,然后利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,在95 ℃條件下預(yù)變性10 min,變性15 s,70 ℃延伸1 min,60 ℃退火60 s,此循環(huán)進(jìn)行40次,收集SNHG3及miR-532熒光信號(hào),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以同一樣本中的U6的Ct值作為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt計(jì)算其基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列,見(jiàn)表1。

表1 SNHG3及miR-532引物序列Table 1 Primer sequences of SNHG3 and miR-532

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 取HeLa細(xì)胞將其分為宮頸癌細(xì)胞(CC)組、宮頸癌細(xì)胞+SNHG3-NC(SN)組、宮頸癌細(xì)胞+SNHG3激動(dòng)劑(SM)組、宮頸癌細(xì)胞+SNHG3抑制劑(SI)組、宮頸癌細(xì)胞+miR-532-NC(MN)組、宮頸癌細(xì)胞+miR-532抑制劑(MI)組、宮頸癌細(xì)胞+miR-532激動(dòng)劑(MM)組、宮頸癌細(xì)胞+SNHG3抑制劑+miR-532激動(dòng)劑(IM)組。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度為40%～60%的細(xì)胞,消化、離心后接種于6孔板中,取不含血清的DMEM培養(yǎng)基,將按照質(zhì)粒大量提取試劑盒說(shuō)明書提取的相關(guān)分組目的基因質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體分別加入其中,冰上靜置5 min,再分別取等量目的基因加入脂質(zhì)體中配置成轉(zhuǎn)染液,室溫靜置5 min,將轉(zhuǎn)染液按分組依次加入孔板,每孔加0.3 mL,并加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基使總體積到達(dá)1 mL,輕輕混勻后置于孵箱,6 h后換全培養(yǎng)基,然后轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞,進(jìn)行消化、離心,棄掉上清液后重懸細(xì)胞,以密度為1×106個(gè)/mL接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,PBS洗滌3次,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,以8%分離膠,5%濃縮膠的條件進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離,電泳完成后,取浸泡在無(wú)水甲醇中激活的PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1.5 h,5%的脫脂奶粉封閉2 h,加入稀釋的E-cadherin、Vimentin一抗(1∶1000),4 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜后洗膜;加入辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的二抗(1∶5000),37 ℃輕搖室溫孵育 2 h;洗膜后,用ECL熒光試劑盒發(fā)光,Gene Sys 軟件自動(dòng)曝光后,計(jì)算與GAPDH比值求得E-cadherin、Vimentin蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.7 小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲及遷移 取各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,以無(wú)血清培養(yǎng)液將細(xì)胞饑餓12 h,進(jìn)行消化、離心,棄掉上清液后重懸細(xì)胞,調(diào)整密度為8×104個(gè)/mL,進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn),首先將每個(gè)小室水化并加入35 μL基質(zhì)膠進(jìn)行鋪膠,37 ℃孵育1 h,上層加入200 μL單細(xì)胞懸液,下層加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)48 h,PBS洗滌2次后,4%多聚甲醛15 min,PBS洗滌2次,向每孔加入0.1%的結(jié)晶紫染色15 min,棉簽拭去未穿透至對(duì)側(cè)的細(xì)胞,顯微鏡下拍照并計(jì)算細(xì)胞數(shù),調(diào)整密度為4×104個(gè)/mL,進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同,只是不做鋪膠處理。

1.8 CCK-8法檢測(cè)DPP耐藥 取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞進(jìn)行消化、離心,棄掉上清液后重懸細(xì)胞,以密度為5×103個(gè)/mL接種于96孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁后,向每孔加入5 μmol /L的DPP,同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照組、加入二甲基亞砜的溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)48 h時(shí),向每孔加入10 μL 8%的CCK-8,避光孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量每孔吸光度(A),根據(jù)[1-(加藥組A-空白組A)/(溶劑對(duì)照組A-空白組A)]×100%,計(jì)算DPP抑制率。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 利用點(diǎn)突變技術(shù)擴(kuò)增出含有Hind Ⅲ和 SpeⅠ酶切位點(diǎn)的miR-532突變位點(diǎn)3′ UTR后,分別將野生型和突變型miR-532 3′UTR插LipofectamineTM2000載體,然后取宮頸癌細(xì)胞將其接種于6孔板中,參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書將構(gòu)建好的miR-532 -3′-UTR-WT和miR-532 -3′-UTR-MUT質(zhì)粒分別與SNHG3-NC和SNHG3共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,嚴(yán)格按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)操作步驟檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 HUCEC和4種宮頸癌細(xì)胞系中SNHG3及miR-532 mRNA的表達(dá) 宮頸癌細(xì)胞系中的SNHG3 mRNA表達(dá)量顯著高于正常宮頸癌上皮細(xì)胞系HUCEC(P<0.05),miR-532 mRNA表達(dá)量顯著低于正常宮頸癌上皮細(xì)胞系HUCEC(P<0.05),其中HeLa的SNHG3、miR-532 mRNA值變化最大(P<0.05),因此選取其作為此次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,見(jiàn)圖1。

圖1 HUCEC和4種宮頸癌細(xì)胞系中SNHG3及miR-532 mRNA的表達(dá)Figure 1 mRNA expression of SNHG3 and miR-532 in HUCEC and four cervical cancer cell lines注:與HUCEC相比,①P<0.05;與HeLa相比,②P<0.05。

2.2 SNHG3對(duì)宮頸癌癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移、DPP耐藥的作用 CC組與SN組相比,細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量、DPP抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與SN組相比,SM組E-cadherin蛋白表達(dá)、DPP抑制率明顯降低,Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量明顯升高(均P<0.05);與SM組相比,SI組E-cadherin蛋白表達(dá)、DPP抑制率明顯升高,Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖 2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)電泳圖Figure 2 Electrophoretic diagram of E-cadherin and Vimentin protein expression in each group

圖3 各組細(xì)胞侵襲及遷移圖(結(jié)晶紫,200×)Figure 3 Cell invasion and migration in each group

表2 4組宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移、DPP耐藥結(jié)果比較Table 2 Comparison of the results of epithelial-mesenchymal transition, invasion, migration and DPP resistance of cervical cancer cells in the four groups

2.3 miR-532對(duì)宮頸癌癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移、DPP耐藥的作用 CC組與MN組相比,細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量、DPP抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與MN組相比,MI組E-cadherin蛋白表達(dá)、DPP抑制率明顯降低,Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量明顯升高(均P<0.05);與MI組相比,MM組E-cadherin蛋白表達(dá)、DPP抑制率明顯升高,Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖4、圖5。

圖4 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)電泳圖Figure 4 Electrophoretic diagram of E-cadherin and Vimentin protein expression in each group

圖5 各組細(xì)胞侵襲及遷移圖(結(jié)晶紫,200×)Figure 5 Cell invasion and migration in each group

表3 4組宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移及DPP耐藥結(jié)果比較Table 3 Comparison of epithelial mesenchymal transition, invasion, migration and DPP resistance of cervical cancer cells among the four groups

2.4 SNHG3聯(lián)合miR-532對(duì)宮頸癌癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移、DPP耐藥的作用 SI組與MM組相比,細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量、DPP抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與MM組相比,IM組E-cadherin蛋白表達(dá)、DPP抑制率明顯升高,Vimentin蛋白表達(dá)、侵襲及遷移數(shù)量明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表4、圖6、圖7。

圖6 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)電泳圖Figure 6 Electrophoretic diagram of E-cadherin and Vimentin protein expression in each group

圖7 各組細(xì)胞侵襲及遷移圖(結(jié)晶紫,200×)Figure 7 Cell invasion and migration in each group

表4 3組宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移、DPP耐藥結(jié)果比較Table 4 Comparison of epithelial mesenchymal transition, invasion, migration and DPP resistance of cervical cancer cells among the three groups

2.5 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)結(jié)果 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SNHG3后可顯著降低miR-532-3′-UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05),但對(duì)突變基因無(wú)顯著影響(P>0.05),且SNHG3與miR-532呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),見(jiàn)表5、圖8、圖9。

圖8 SNHG3與miR-532靶向結(jié)合位點(diǎn)圖Figure 8 Target binding sites of SNHG3 and miR-532

圖9 SNHG3與miR-532相關(guān)性圖Figure 9 Correlation between SNHG3 and miR-532

表5 雙熒光素酶報(bào)告Table 5 Dual luciferase report

3 討論

近年來(lái),隨著宮頸癌疫苗的出現(xiàn)及人們健康意識(shí)的提高,宮頸癌的發(fā)病也有所降低。但宮頸癌的死亡率仍然較高,是嚴(yán)重影響女性健康的一大殺手,因此,繼續(xù)深入研究宮頸癌發(fā)病及進(jìn)展分子機(jī)制,尋找新的生物治療靶點(diǎn)是目前臨床治療亟待解決的重大課題[9]。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌細(xì)胞系中的SNHG3 mRNA表達(dá)量顯著高于正常宮頸癌上皮細(xì)胞,miR-532 mRNA表達(dá)量顯著低于正常宮頸癌上皮細(xì)胞,這表明SNHG3、miR-532可能參與癌癥進(jìn)程。目前已被證實(shí),如LcnRNA、miRNA 等非編碼RNA在人類的生理乃至疾病和癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可通過(guò)多種途徑調(diào)控靶基因,從而對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等過(guò)程起重要調(diào)控作用,對(duì)機(jī)體各種生理及病理過(guò)程造成影響[10]。SNHG3是近年來(lái)研究最多的一種LcnRNAs,其可通過(guò)RNA剪接、tRNA處理、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、凋亡、粘附等方面的調(diào)控;miR-532則是miRNAs的一種,其可通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶基因信使RNA,來(lái)抑制靶基因翻譯或引起其降解,從而對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生命進(jìn)程起重要作用,最終影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。而對(duì)于SNHG3高表達(dá),miR-532低表達(dá),可能是由于宮頸癌中其基化區(qū)域出現(xiàn)異常,從而導(dǎo)致其上游靶基因轉(zhuǎn)錄異常,進(jìn)而導(dǎo)致SNHG3大量轉(zhuǎn)錄,miR-532過(guò)度降解,最終在機(jī)體內(nèi)SNHG3呈高表達(dá),miR-532呈低表達(dá)。Zhu等[13]表明,SNHG3在宮頸癌中表達(dá)顯著增加,且SNHG3表達(dá)上調(diào)與轉(zhuǎn)移相關(guān),這說(shuō)明SNHG3可以作為預(yù)后的生物標(biāo)志物和宮頸癌的治療靶點(diǎn),這與本文結(jié)果類似。

本文結(jié)果提示,抑制SNHG3可顯著抑制細(xì)胞侵襲及遷移,并改善上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和DPP耐藥,這說(shuō)明SNHG3可成為治療宮頸癌的有效靶點(diǎn)。宮頸癌癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致包括宮頸癌在內(nèi)的所有腫瘤患者死亡的主要原因,因此探尋其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制就顯得尤為重要[14]。而近年來(lái)研究[15-16]發(fā)現(xiàn),上皮源性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān),為了獲得運(yùn)動(dòng)和侵襲能力,腫瘤細(xì)胞必須發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,因?yàn)殚g質(zhì)轉(zhuǎn)化可使原發(fā)腫瘤發(fā)生許多表型的改變,從而有利于癌細(xì)胞離開(kāi)腫瘤原發(fā)部位,播散至遠(yuǎn)處組織、器官,最終形成新的腫瘤,E-cadherin 、Vimentin是間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵分子,E-cadherin下調(diào)或缺失、 Vimentin 表達(dá)增加被視為癌細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的最重要標(biāo)志,因此檢測(cè)其水平的變化可有效反映宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)情況。DPP是宮頸癌化學(xué)治療的重要藥物,不僅潛力最佳,應(yīng)用也最為廣泛,也正是因?yàn)檫@一特性,DPP耐藥成為了限制其臨床療效以及部分患者治療進(jìn)展的關(guān)鍵原因,因此如何改善宮頸癌DPP耐藥一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)之一[17]。而對(duì)于宮頸癌細(xì)胞,抑制SNHG3主要通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá),來(lái)改善腫瘤微環(huán)境,從而調(diào)控腫瘤間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白,抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,進(jìn)而抑制細(xì)胞侵襲及遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞間黏附性和極性等,最終有效改善DPP耐藥,提高治療效果。有發(fā)現(xiàn),下調(diào)SNHG3可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,其機(jī)制可能與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路有關(guān),這與本文結(jié)果類似[18]。

雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SNHG3后可顯著抑制miR-532-3′-UTR-WT的熒光素酶活性,但對(duì)突變基因無(wú)顯著影響,且SNHG3與miR-532呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),這說(shuō)明miR-532可能是SNHG3的靶基因。近年來(lái)研究[18]發(fā)現(xiàn),LncRNA可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 miRNAs,從而影響miRNAs的功能與活性,而miR與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與細(xì)胞惡性行為和化療耐藥之間的關(guān)系也早有研究證實(shí),這說(shuō)明LncRNA可通過(guò)靶向 miRNAs對(duì)癌細(xì)胞皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化造成影響,從而調(diào)控惡性行為及耐藥。故可推測(cè)SNHG3可抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移,并改善DPP耐藥,可能是通過(guò)吸附miR-532的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性 RNA,來(lái)參與表觀遺傳學(xué)調(diào)控,從而調(diào)節(jié)鄰近蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá),調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá),改善腫瘤微環(huán)境,進(jìn)而抑制癌細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制其獲得間質(zhì)細(xì)胞特征,最終達(dá)到抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移,并改善DPP耐藥的目的。鄭志遠(yuǎn)等[19]表明,SNHG3具有致癌作用,可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,這與本文結(jié)果類似。

本文為治療宮頸癌的科學(xué)研究提供了新的思路及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),有望成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。但本文實(shí)驗(yàn)仍存在一定不足,實(shí)驗(yàn)室尚未建立SNHG3慢病毒對(duì)大鼠的干預(yù),在今后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)進(jìn)一步添加SNHG3對(duì)宮頸癌的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

抑制SNHG3可有效逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制細(xì)胞侵襲及遷移,并提高DPP耐藥,其作用機(jī)制可能與靶向激活miR-532有關(guān)。