王涵穎 張心月 彭懷云 楊君燁 邱浩宇黃 玲 陶晨智 王 萍①

(1. 浙江海洋大學(xué)國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 浙江舟山 316022; 2. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 浙江舟山 316022)

目前, 我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖量逐年攀升, 養(yǎng)殖集約化日益嚴(yán)重, 導(dǎo)致養(yǎng)殖水體惡化、養(yǎng)殖動(dòng)物病害增加、養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)失衡, 極大的限制了水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康可持續(xù)發(fā)展(楊衛(wèi)等, 2018)?？股匾蚱浯偕L(zhǎng)且能預(yù)防、治療疾病而廣泛運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖, 但長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物易產(chǎn)生耐藥性、腸道微生物系統(tǒng)損傷、免疫力低下, 同時(shí)抗生素的殘留也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定影響(Chenetal, 2020)。傳統(tǒng)的抗生素療法已不能滿足綠色健康的養(yǎng)殖理念, 因此, 尋找綠色健康的添加劑勢(shì)在必行。

近年來(lái), 益生菌在水產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛, 使用方式也多種多樣, 比如添加到飼料或者養(yǎng)殖水體中。益生菌可調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的生態(tài)環(huán)境、提高抗病力的同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖水體起到改善作用(閆子豪等, 2022)。因其安全有效、環(huán)境友好等特點(diǎn)漸漸代替了副作用較多的抗生素。芽孢桿菌與其他益生菌的顯著區(qū)別在于其培養(yǎng)的最后階段會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成厚壁芽孢, 也稱內(nèi)生孢子, 具有耐高溫、高pH、高鹽、干燥和抗氧化等特點(diǎn), 可保護(hù)芽孢桿菌免受不良環(huán)境的影響(張宇柔等, 2022)。芽孢桿菌作為飼料添加劑具有以下益處(Srisapoomeetal, 2017; Shietal, 2020): 1) 促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)與消化; 2) 抑制魚(yú)體內(nèi)病原菌生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力; 3) 調(diào)節(jié)其腸道微生物區(qū)系; 4) 顯著改善代謝途徑。養(yǎng)殖水體或飼料中添加益生菌后對(duì)魚(yú)類的健康養(yǎng)殖具有重要的意義, 因此益生菌可作為綠色健康的添加劑之一, 為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供新的可持續(xù)解決方案。

斑馬魚(yú)(Daniorerio)是一種熱帶淡水魚(yú), 作為重要的模式脊椎動(dòng)物之一, 斑馬魚(yú)模型具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)(Qinetal, 2017; 王之怡等, 2020): 1) 斑馬魚(yú)早期體色較透明, 易于觀察微生物在體內(nèi)的定植情況;2) 與體外細(xì)胞培養(yǎng)模式相比, 斑馬魚(yú)有完整的生命特征與功能, 是真正意義上的模式生物; 3) 斑馬魚(yú)具有先天性免疫系統(tǒng), 并在4 周齡時(shí)能夠發(fā)展適應(yīng)性免疫; 4) 斑馬魚(yú)基因數(shù)據(jù)庫(kù)較為完善, 具有良好的研究基礎(chǔ)。近年來(lái), 斑馬魚(yú)也被廣泛應(yīng)用于益生菌在體功能的檢測(cè)。例如: 乳酸菌通過(guò)增強(qiáng)斑馬魚(yú)免疫應(yīng)答從而提高其抗病能力(Qinetal, 2017); 益生菌浸浴斑馬魚(yú)幼魚(yú)促進(jìn)其腸道蠕動(dòng), 改善其炎癥相關(guān)的黏膜損傷(Wangetal, 2020); 枯草芽孢桿菌浸浴斑馬魚(yú)后, 改變宿主腸道微生物群, 減少潛在致病菌的豐度(Castroet al, 2023)。因此, 本研究使用球形賴氨酸芽孢桿菌, 探討其對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、腸道菌群及代謝的影響, 為其在魚(yú)類養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 球形賴氨酸芽孢桿菌制劑的制備及添加方式

實(shí)驗(yàn)用芽孢桿菌制劑是由本實(shí)驗(yàn)室從大黃魚(yú)腸道分離獲得的球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)菌株。將保存在-80 °C 冰箱的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)后, 挑取單菌落放入Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基中, 經(jīng)37 °C、180 r/min 振蕩培養(yǎng)制得菌液。按照OD600值與細(xì)菌劑量的線性關(guān)系進(jìn)行培養(yǎng)(吳振超, 2020), 確定濃度的菌液通過(guò)直接加入養(yǎng)殖水體的方式, 使養(yǎng)殖缸內(nèi)終濃度分別達(dá)到105、107CFU/mL。菌液的添加量要與缸內(nèi)水體的容量進(jìn)行換算后加入。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)的養(yǎng)殖與管理

選取AB 品系斑馬魚(yú)中生長(zhǎng)狀況良好、規(guī)格均勻的雌雄魚(yú), 雌魚(yú)與雄魚(yú)按2∶1 交配產(chǎn)卵, 收取魚(yú)卵當(dāng)天記為第0 天。培養(yǎng)至24 d 時(shí), 挑取270 尾初體重為(0.019±0.003) g 的斑馬魚(yú), 隨機(jī)均分為3 組, ZF0 組(對(duì)照組, 基礎(chǔ)飼料)、ZF5 組(基礎(chǔ)飼料+105CFU/mL球形賴氨酸芽孢桿菌)與ZF7 組(基礎(chǔ)飼料+107CFU/mL球形賴氨酸芽孢桿菌), 每組3 個(gè)平行。每日飼喂2次(09:00 和15:00), 每隔48 h 換去養(yǎng)殖缸內(nèi)1/2 養(yǎng)殖水, 進(jìn)行為期33 d 的飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間水溫(27.5±1) °C、pH 為7.3～7.8、光暗周期為14 h:10 h。

1.3 樣品制備

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行24 h 饑餓處理。取樣前用丁香酚(1∶1 000)對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行麻醉, 并進(jìn)行各組的稱重與計(jì)數(shù)。每組取20 尾魚(yú)放置于無(wú)菌操作臺(tái)中, 冰上解剖取出腸道和肝臟于無(wú)酶無(wú)菌EP 管中后迅速放入液氮, 并-80 °C 保存, 用于肝臟與腸道生化指標(biāo)、腸道菌群與代謝的測(cè)定。另外每組取3 尾魚(yú)放置于無(wú)菌操作臺(tái)中, 取出的腸道放置裝有4%多聚甲醛的離心管中固定, 便于進(jìn)行后續(xù)的腸道組織學(xué)分析。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)數(shù)據(jù)處理 各生長(zhǎng)參數(shù)按下列公式計(jì)算:

上述公式中, IBW、FBW 分別表示實(shí)驗(yàn)魚(yú)初始體重和終末體重;No、Nt分別表示養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)網(wǎng)箱中魚(yú)的尾數(shù)和養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)網(wǎng)箱中魚(yú)的尾數(shù);t表示實(shí)驗(yàn)天數(shù)。

1.4.2 肝臟與腸道的生化指標(biāo) 肝臟抗氧化相關(guān)酶包括總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD);肝臟免疫相關(guān)酶包括堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT); 腸道消化酶包括胰蛋白酶、脂肪酶, 均使用南京建成生物工程研究所的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 腸道組織學(xué)觀察 將4%多聚甲醛溶液固定的組織送往杭州厚愛(ài)生物科技有限公司進(jìn)行組織切片的后續(xù)制作, 用Image-Pro Plus 6.0 軟件, 分別測(cè)量絨毛長(zhǎng)度(mm)、隱窩深度(mm), 每張切片選取5 根完整的絨毛, 計(jì)數(shù)每根完整絨毛上的杯狀細(xì)胞。

1.4.4 腸道菌群的測(cè)序 將-80 °C 保存的腸道送去上海元莘生物公司進(jìn)行腸道菌群的測(cè)序, 包括樣品的DNA 提取、測(cè)序建庫(kù)與多樣性分析。首先通過(guò)Illumina Novaseq 6000 進(jìn)行測(cè)序; 其次對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控、聚類/去噪, 劃分Feature, 并根據(jù)Feature 的序列組成得到其物種分類, 從而獲得各樣品的物種分布圖、物種聚類熱圖、屬分類學(xué)水平系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù); 最后使用QIIME2 軟件進(jìn)行樣品的Alpha、Beta 多樣性分析。

1.4.5 腸道代謝物的測(cè)定 將-80 °C 冰箱內(nèi)保存的腸道送去上海元莘生物公司進(jìn)行腸道代謝物的分析, 采用UHPLC 超高效液相色譜系統(tǒng)(Thermo)分離后, 用Q Exactive 系列質(zhì)譜儀(Thermo)進(jìn)行質(zhì)譜分析,檢測(cè)樣本中的代謝物, 通過(guò)與本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中代謝物的保留時(shí)間、分子質(zhì)量(誤差在10 ppm 內(nèi), ppm 為質(zhì)譜儀的精度單位part per million)、二級(jí)碎裂譜圖、碰撞能等信息進(jìn)行匹配, 對(duì)生物樣本中的代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定, 并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行嚴(yán)格的人工二次核對(duì)、確認(rèn)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard 轉(zhuǎn)換成mzXML 格式,然后采用XCMS 軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。對(duì)XCMS 提取得到的數(shù)據(jù)首先進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理, 然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià), 最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用Excel 2019 處理并采用SPSS 26.0 進(jìn)行方差分析,P＜0.05 表示差異顯著,P＞0.05 表示差異不顯著, 所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表1 可知, 各組間的終末體重、增重率、存活率和特定生長(zhǎng)率都沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05), 但ZF7組的終末體重和增重率相對(duì)ZF0 組有所升高。

表1 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Tab.1 Effects of L. sphaericus on growth performance of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.2 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟抗氧化免疫能力的影響

由表2 可知, ZF5、ZF7 組GPT 活性相比ZF0 組顯著提高(P＜0.05), ZF5 組AKP 活性顯著高于其余兩組(P＜0.05); 各組間的SOD、T-AOC、GOT 與ACP活性均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表2 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟抗氧化免疫能力的影響Tab.2 Effects of L. sphaericus on liver antioxidant and immune ability of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.3 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道消化酶活性的影響

由表3 可知, ZF7 組的脂肪酶、胰蛋白酶活性顯著高于ZF0 組(P＜0.05); ZF7 組腸道蛋白含量顯著高于ZF5 與對(duì)照組(P＜0.05)。

表3 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道消化酶活性的影響Tab.3 Effects of L. sphaericus on intestinal digestive enzyme activity of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.4 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

如表4 所示, 各組之間的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度具有顯著性差異(P＜0.05); ZF7 組的隱窩深度顯著低于其他兩組(P＜0.05); 實(shí)驗(yàn)組杯狀細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著性的差異(P＞0.05)。

表4 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Tab.4 Effects of L. sphaericus on intestinal structure of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.5 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha 多樣性分析 通過(guò)單樣本的多樣性分析(Alpha 多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。反映細(xì)菌群落豐富度的Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)隨著指數(shù)數(shù)值的增大, 豐富度增加。表5 可知, 對(duì)照組的豐富度(Ace、Chao)低于試驗(yàn)組, ZF5、ZF7 組Ace指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05); ZF7 組Chao 指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。Simpson 與Shannon 指數(shù)常用于反映群落多樣性, Simpson 指數(shù)值越大, 群落多樣性越低; Shannon 指數(shù)值越大, 群落多樣性越高。與對(duì)照組相比, 試驗(yàn)組群落豐富度顯著升高(P＜0.05)。Coverage 是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率, 其數(shù)值越高, 樣本中序列被測(cè)出的概率越高, 由表5 可知, 本試驗(yàn)中各組Coverage 指數(shù)接近于1, 表明樣本中幾乎所有序列都被檢測(cè)到了。

表5 Alpha 多樣性分析Tab.5 Alpha diversity analysis

2.5.2 Beta 多樣性分析 如圖1 所示, 在第一主成分(PC1, 83.39%)對(duì)照組與試驗(yàn)組相距較遠(yuǎn), 且試驗(yàn)組樣品分布較緊密; 對(duì)照組在第二主成分(PC2,8.34%)跨度較大, 但試驗(yàn)組仍保持緊密分布。根據(jù)圖2 可以看出對(duì)照組與試驗(yàn)組距離較遠(yuǎn), 各組之間都有較好重復(fù)性。

圖1 主成分分析圖Fig.1 Principal Component Analysis

圖2 聚類樹(shù)狀圖Fig 2 Clustering tree diagram

為了清晰地看到斑馬魚(yú)的腸道菌群組成, 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算各樣品的群落組成, 主要分析門水平和屬水平的微生物種群類別。由圖3a 所示, 門水平上, 斑馬魚(yú)腸道微生物主要由變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteriota)和放線菌門(Actinobacteriota)組成, Others 由物種豐度低于1%的各門類組成。對(duì)照組與各試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌門都是變形菌門, 試驗(yàn)組中放線菌門的豐度顯著提高。

圖3 群落結(jié)構(gòu)組分圖Fig 3 Map of community structure components

基于屬水平的腸道菌群組成(圖3b)所示, 對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬為鯨桿菌屬(Cetobacterium), 其中還含有大量的鄰單胞屬(Plesiomonas)。試驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)菌群仍為鯨桿菌屬, 但戈登氏菌(Gordonia)、細(xì)桿菌屬(Microbacterium)、副球菌屬(Paracoccus)等有益菌屬有所增加, 且鄰單胞屬大幅減少, ZF7 組氣單胞屬含量在菌群組成中也顯著降低。

2.6 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道代謝物的影響

2.6.1 單變量統(tǒng)計(jì)分析 單變量統(tǒng)計(jì)方法通過(guò)變異倍數(shù)分析與T 檢驗(yàn)/非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)兩組樣本進(jìn)行差異分析?；鹕綀D橫坐標(biāo)代表該組對(duì)比物質(zhì)的差異表達(dá)倍數(shù)(Flod Change)log2的對(duì)數(shù)值, 縱坐標(biāo)代表T 檢驗(yàn)P值的-lg 的對(duì)數(shù)值。圖中紅色表示顯著上調(diào)的差異代謝物(FC＞1.5,P＜0.05), 藍(lán)色表示顯著下調(diào)的差異代謝物(FC＜0.67,P＜0.05)。黑色表示不顯著的差異代謝物(P＞0.05)。ZF0 與ZF5 兩組共檢測(cè)到270 個(gè)差異代謝物, 相比ZF0 組, ZF5 組顯著上調(diào)172 個(gè)差異代謝物, 顯著下調(diào)98 個(gè)差異代謝物(圖4a)。ZF0 與ZF7兩組共檢測(cè)到183 個(gè)差異代謝物, 相比ZF0 組, ZF7組顯著上調(diào)110 個(gè)差異代謝物, 顯著下調(diào)73 個(gè)差異代謝物(圖4b)。ZF7 與ZF5 兩組共檢測(cè)到231 個(gè)差異代謝物, 相比ZF5 組, ZF7 組顯著上調(diào)67 個(gè)差異代謝物, 顯著下調(diào)164 個(gè)差異代謝物(圖4c)。

圖4 組間差異代謝物表達(dá)火山圖Fig.4 Volcanic plot of differential metabolite between control and treatment groups

2.6.2 篩選差異代謝物 OPLS-DA 模型得到的變量權(quán)重值(variable importance for the projection, VIP)能夠用于衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力, 通常VIP＞1 的代謝物被認(rèn)為在模型解釋中具有顯著貢獻(xiàn)。以 OPLS-DA VIP＞1 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著性差異代謝物?；诤Y選結(jié)果, 我們列出了ZF5 和ZF7 組中顯著上調(diào)和下調(diào)的前5 位差異表達(dá)代謝物(表6)。ZF5 和ZF7 處理組共同上調(diào)的差異代謝物有 Lipoxin a4、Prostaglandin g2 和11-dehydrothromboxane b2, 共同下調(diào)的差異代謝物有 5'-phosphoribosyl-5-amino-4-imidazolecarboxamide (aicar)。與ZF5 相比, ZF7 顯著上調(diào)的前兩位差異代謝物是 Sulfobacin b、5-Hydroxytryptophan; 顯著下調(diào)的前兩位差異代謝物是11-dehydrothromboxane b2 和Prostaglandin i2。

表6 組間差異表達(dá)代謝物TOP 5 (負(fù)離子模式下)Tab.6 TOP 5 metabolites were differentially expressed between groups (neg)

2.6.3 KEGG 分析 KEGG 通路富集分析是以KEGG 通路為單位, 通過(guò)計(jì)算各個(gè)通路代謝物富集度的顯著性水平, 從而確定受到顯著影響的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。P值越小, 則該代謝通路的差異性越顯著。圖5 所示, ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸(alanine,aspartate and glutamate metabolism)通路中包含的差異表達(dá)代謝物數(shù)目較多且富集程度極顯著, 氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)通路中包含的差異表達(dá)代謝物數(shù)目較多, 富集程度較顯著。

圖5 KEGG 富集通路圖Fig 5 KEGG enrichment pathway diagram

3 討論

3.1 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛, 常通過(guò)向飼料或養(yǎng)殖水體中添加益生菌制劑的方法來(lái)探究益生菌對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響(Lietal, 2019; Sumonetal, 2022)。大量研究表明, 益生菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)性能有促進(jìn)作用, 如在Padeniya 等(2022)的研究中發(fā)現(xiàn), 益生菌浸浴斑馬魚(yú)幼魚(yú)后加快其對(duì)卵黃的吸收, 增強(qiáng)其生長(zhǎng)性能。Snega Priya 等(2021)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 飼喂添加枯草芽孢桿菌的飼糧可以提高斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能, 飼糧中添加枯草芽孢桿菌和榴蓮皮PG 混合補(bǔ)充劑具有更高的效益。本試驗(yàn)結(jié)果表明, ZF5 和ZF7 組雖然沒(méi)有顯著增強(qiáng)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能, 但實(shí)驗(yàn)組末體重相比對(duì)照組有所提高,ZF7 組的WGR 相比ZF0 也有所提高, 總的來(lái)說(shuō), 添加球形賴氨酸芽孢桿菌后魚(yú)體終末體重與增重率有上升趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似, 表明球形賴氨酸芽孢桿菌可以改善斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)狀況,具體的作用效果還要根據(jù)益生菌的種類、劑量與補(bǔ)充持續(xù)時(shí)間而定。

3.2 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟抗氧化免疫指標(biāo)的影響

抗氧化酶的調(diào)節(jié)是改善宿主機(jī)體防御機(jī)制所必需的(Midhunetal, 2019b)。機(jī)體的健康狀況主要取決于活性氧(ROS)的代謝和免疫系統(tǒng)的功能。ROS 代謝涉及SOD、GPx、GR 和CAT 等酶, 它們是調(diào)節(jié)自由基發(fā)生和保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的第一道防線(Ramosetal, 2015)。在Giri 等(2013)的研究中, 用含植物乳桿菌的飼料飼喂露斯塔野鯪(Labeorohita)養(yǎng)殖30 d后 SOD 活性沒(méi)有得到顯著性改善, 養(yǎng)殖 60 d 后108CFU/g 處理組的SOD 活性顯著增強(qiáng), 這表明飼料中添加菌液濃度的高低與養(yǎng)殖周期的長(zhǎng)短都會(huì)得到不同的養(yǎng)殖效益。本研究中, 處理組SOD 活性相比于對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異, 推測(cè)可能由于養(yǎng)殖周期問(wèn)題, 球形賴氨酸芽孢桿菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)還沒(méi)有激發(fā)免疫組織增強(qiáng)其抗氧化作用。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)是肝臟內(nèi)活性較高的2 種轉(zhuǎn)氨酶,主要參與機(jī)體的轉(zhuǎn)氨基作用, 當(dāng)機(jī)體GPT 和GOT 活性較高時(shí), 轉(zhuǎn)氨作用相應(yīng)增強(qiáng), 容易進(jìn)行聯(lián)合脫氨作用, 增強(qiáng)氨基酸氧化分解從而減少氨基酸代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的毒害, 保持機(jī)體穩(wěn)定(劉盼等, 2022)。本試驗(yàn)中, ZF5、ZF7 組GPT 活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),表明添加球形賴氨酸芽孢桿菌后對(duì)斑馬魚(yú)機(jī)體具有保護(hù)作用。堿性磷酸酶(AKP)主要存在于肝臟與腸上皮, 是魚(yú)體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶, 主要參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝(郭文靜, 2020)。本試驗(yàn)中, 與其他兩組相比 ZF5 處理組的 AKP 活性顯著升高(P＜0.05)。Wang 等(2021)飼喂乳酸乳球菌Z-2 后, 顯著增加鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)體內(nèi)的AKP 活性, 與本試驗(yàn)結(jié)果相同。試驗(yàn)表明添加球形賴氨酸芽孢桿菌能夠增強(qiáng)斑馬魚(yú)幼魚(yú)機(jī)體的免疫能力。

3.3 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道消化酶的影響

腸道是魚(yú)類主要的消化器官, 腸道中的各種消化酶對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起主要作用(Girietal, 2013)。芽孢桿菌作用機(jī)制之一是能夠產(chǎn)生多種降解有機(jī)物的酶類(于瑞河,2020)。當(dāng)飼料中添加的益生菌在腸道成功定植后可產(chǎn)生細(xì)胞外酶, 從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗與吸收(Nedaeietal, 2019)。大量研究表明, 添加益生菌有助于魚(yú)類腸道消化酶的提高。例如, 添加不同劑型的乳酸乳球菌提高了鯉魚(yú)腸道消化酶活性(淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶) (Wangetal, 2021)。與對(duì)照組相比, 飼喂含有宿主相關(guān)益生菌乳酸菌(HAP)飼料的擬鯉(Rutilus rutiluscaspicus)幼魚(yú)體內(nèi)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性顯著提高(Tarkhanietal, 2020)。本研究中, ZF7 組脂肪酶、胰蛋白酶顯著高于其他兩組(P＜0.05), 表明球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)提高斑馬魚(yú)腸道消化酶活性有積極的作用。消化酶是魚(yú)類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化能力的重要指標(biāo)(胡亞軍等, 2016)。使用益生菌多黏類芽孢桿菌HGA4C 可以通過(guò)增加尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)的脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶來(lái)提高魚(yú)的消化能力(Midhunetal, 2019a)。本研究中, ZF7 組消化酶活性顯著提高增強(qiáng)了斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道的消化能力,這與ZF7 組的絨毛高度與v/c 顯著增高相呼應(yīng), 表明球形賴氨酸芽孢桿菌有助于魚(yú)類腸道的消化吸收。

3.4 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道組織的影響

魚(yú)類腸道不僅是消化吸收的重要場(chǎng)所, 具有容納和運(yùn)輸、消化食物、吸收營(yíng)養(yǎng)的功能, 還是具有生物、物理、化學(xué)、免疫屏障等多功能的免疫器官(涂永鋒等, 2004)。腸道結(jié)構(gòu)功能的完整對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)和消化吸收至關(guān)重要(王穎, 2022)。對(duì)腸道進(jìn)行組織觀察可進(jìn)一步了解魚(yú)類對(duì)食物消化吸收的能力(劉君恒等, 2021)。絨毛高度是判斷腸道消化吸收能力的重要指標(biāo), 且絨毛高度與腸道的吸收能力呈正相關(guān)(王子旭等, 2003)。隱窩深度的深淺可以體現(xiàn)出腸道的發(fā)育情況, 隱窩深度變淺, 腸道的消化吸收能力增強(qiáng)(歐紅霞等, 2020)。絨毛高度與隱窩深度的比值則是腸道綜合功能的評(píng)價(jià)指標(biāo), 體現(xiàn)為比值上升, 腸道黏膜消化吸收功能增強(qiáng), 機(jī)體生長(zhǎng)加快; 反之, 比值降低,腸黏膜出現(xiàn)破損, 其消化吸收能力減弱, 機(jī)體表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢(徐光科, 2007)。絨毛長(zhǎng)度越長(zhǎng), 隱窩深度越淺, V/C 值越大, 腸道吸收營(yíng)養(yǎng)的能力越強(qiáng)。本研究中,ZF7 組的絨毛高度與v/c 顯著高于其他兩組(P＜0.05);ZF7 組的隱窩深度顯著低于對(duì)照組與ZF5 組(P＜0.05),這與楊智仁等(2023)的結(jié)果一致, 表明添加球形賴氨酸芽孢桿菌有助于腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。在斑馬魚(yú)腸道化學(xué)屏障中, 杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白可作為潤(rùn)滑性黏液, 對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用(劉娜娜等, 2015)。大鼠(哺乳動(dòng)物)創(chuàng)傷性休克后的腸黏膜重建過(guò)程中, 有大量的杯狀細(xì)胞占據(jù)腸黏膜表面并呈現(xiàn)分泌狀態(tài)來(lái)促進(jìn)重建的完成(常建星等, 2005)。本研究顯示養(yǎng)殖水體添加球形賴氨酸芽孢桿菌后杯狀細(xì)胞數(shù)量減少, 這與劉娜娜等(2015)的研究結(jié)果相一致, 說(shuō)明添加益生菌后有助于提高腸道屏障的完整性, 加強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

3.5 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群的影響

魚(yú)類腸道菌群是一個(gè)動(dòng)態(tài)的微生態(tài)系統(tǒng), 養(yǎng)殖環(huán)境、飲食、宿主遺傳等因素都會(huì)影響腸道微生物的組成(Egertonetal, 2018)。本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Π唏R魚(yú)幼魚(yú)的腸道微生物進(jìn)行分析, 從而探究養(yǎng)殖水體添加球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群的影響。試驗(yàn)通過(guò)Alpha 和Beta 對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群進(jìn)行多樣性分析, 結(jié)果表明, 添加球形賴氨酸芽孢桿菌后斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道微生物群落的豐度與多樣性都顯著提高(P＜0.05), 這與林艾影(2019)的研究結(jié)果相似。在蔣廣志等(2023)的研究中發(fā)現(xiàn), 添加益生菌后改變了宿主腸道微生物的多樣性。本試驗(yàn)Beta分析的PCA 圖可清晰地看出在試驗(yàn)組與對(duì)照組中斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道樣品的物種豐度有一定的差別, 而兩試驗(yàn)組樣本間的物種相似度較高, 這也與本試驗(yàn)中斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群組成的結(jié)果相呼應(yīng)。研究表明,斑馬魚(yú)腸道主要由變形菌門(Proteobacteria)與梭桿菌門(Fusobacteriota)組成(Roeselersetal, 2011)。在本研究中, 對(duì)照組也得出相同結(jié)果, 試驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上顯著提高了放線菌門(Actinobacteriota)的豐度。與之相似的是, 汪磊(2022)使用復(fù)合益生菌飼喂眼斑雙鋸魚(yú)(Amphiprionocellaris)后提高其腸道菌群中放線菌門的豐度。放線菌門是一類具有廣泛應(yīng)用前景的微生物類群, 有抗菌活性(楊子文, 2018)。屬水平上, 相比于對(duì)照組, 試驗(yàn)組腸道菌群中的物種多樣性明顯增加,其中戈登氏菌屬(Gordonia) 、 細(xì)桿菌屬(Microbacterium)、賴氏菌屬(Leifsonia)、副球菌屬(Paracoccus)的相對(duì)豐度有所提高。Sheikhzadeh 等(2017)發(fā)現(xiàn)戈登氏菌顯著增強(qiáng)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的生長(zhǎng)與免疫性能。細(xì)桿菌屬對(duì)豐年蝦的生長(zhǎng)發(fā)育有良好的影響(Suoetal, 2017)。本研究中相比對(duì)照組, 試驗(yàn)組的生長(zhǎng)與免疫能力都有所改善, 推測(cè)可能與腸道中益生菌屬相對(duì)豐度提高有關(guān)。由此表明,添加球形賴氨酸芽孢桿菌可改善斑馬魚(yú)的腸道微生物組成。但在本試驗(yàn)中, 球形賴氨酸芽孢桿菌所屬的菌屬不是優(yōu)勢(shì)菌屬, 可能是由于腸道定植數(shù)量較少不足以顯示菌株的變化, 在Zhang 等(2020)的研究中使用檸檬酸桿菌作為飼料添加劑對(duì)魚(yú)類腸道菌群進(jìn)行探索也得出相同結(jié)果。綜上所述, 斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水體中添加球形賴氨酸芽孢桿菌可以改善其腸道微生物多樣性, 調(diào)節(jié)腸道菌群。

3.6 球形賴氨酸芽孢桿菌對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道代謝的影響

本研究中雖然斑馬魚(yú)腸道中有機(jī)酸及其衍生物在總代謝物中占比較大, 但脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子中差異代謝物變化更為明顯。Lipoxin a4 (LXA4)是腸道差異代謝物中上調(diào)最明顯的, 在ZF5 和ZF7 組分別上調(diào)到ZF0 的86 和11 倍。LXA4 屬于脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子中脂肪酰類(Fatty Acyls)的類花生酸(Eicosanoids), 主要參與花生四烯酸代謝中的新陳代謝與脂質(zhì)代謝。研究表明, 花生四烯酸通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞的增殖分化和凋亡來(lái)促進(jìn)脂肪的水解, 降低炎癥相關(guān)化學(xué)因子(Burnsetal, 2018)。Sepulcre 等(2016)在斑馬魚(yú)及其他硬骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn), 魚(yú)體內(nèi)中性粒細(xì)胞凋亡前會(huì)產(chǎn)生LXA4, LXA4 在抑制巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的同時(shí)加強(qiáng)了對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬活性。本研究中, 添加球形賴氨酸芽孢桿菌后LXA4 表達(dá)量明顯上調(diào), 從而可以降低炎性因子的表達(dá), 這與孫學(xué)亮等(2023)用屎腸球菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的研究結(jié)果相一致。與ZF5 相比, ZF7 上調(diào)最明顯的代謝物是Sulfobacin b(磺脲霉素B), 上調(diào)到ZF5 的6.17 倍。屬于脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子中脂肪酰類的脂肪酰胺(Fatty amides), 在Maeda 等(2010)的研究中發(fā)現(xiàn), 將磺脲霉素B 通過(guò)腹腔注射到lps 誘導(dǎo)的急性炎癥模型的小鼠體內(nèi), 可抑制小鼠血清TNF-α的產(chǎn)生, 表明磺脲霉素B是一種潛在的炎癥化療藥物。其次5-Hydroxytryptophan (5-羥色氨酸)上調(diào)到ZF5 的4.05 倍。5-羥色氨酸(5-HTP)屬于有機(jī)雜環(huán)化合物中吲哚衍生物(indoles and derivatives)的色胺衍生物(tryptamines and derivatives)。5-HTP 是一種天然氨基酸(AA), 目前, 5-HTP 主要從天然產(chǎn)品中提取, 但隨著生物技術(shù)的發(fā)展, 微生物合成5-羥基色氨酸的新策略被提出。Liu 等(2021)提出大腸桿菌是原核生物的模型菌株, 具有明確的遺傳信息和良好的發(fā)酵條件。本研究中ZF7 相比ZF5 組5-HTP 明顯上調(diào)可能的原因是由于較高濃度的球形賴氨酸芽孢桿菌更適合5-HTP 的產(chǎn)生。與ZF5 組相比, ZF7 組下調(diào)最明顯的代謝物是 11-dehydrothromboxane b2(11-脫氫血栓素 B2), 其次是Prostaglandin i2 (前列腺素I2), 分別下調(diào)到0.09 和0.11。其同屬于脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子中脂肪酰類的類花生酸。11-脫氫血栓烷B2(11-dhTXB2)是體內(nèi)形成的血栓烷A2 的標(biāo)記化合物(Takasakietal, 1991)。在Lukianets 等(2022)的研究中發(fā)現(xiàn), 人體尿液中11-dhTXB2 的含量升高表明血栓素在持續(xù)產(chǎn)生, 造成動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成從而增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。前列腺素I 2 (PGI 2)是一種脂質(zhì)介質(zhì), 對(duì)免疫細(xì)胞具有有效的抗炎作用(Norlanderetal,2021)。PGI2 信號(hào)也對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)大的抗炎作用(Tokietal, 2013)。大量研究證明, PGI2 不僅對(duì)treg 的形成和發(fā)展很重要, 反過(guò)來(lái), 在某些疾病模型中, treg 又促進(jìn)了PGI2 的生物利用度(Tamosiunieneetal, 2018)。在Norlander 等(2021)的研究中發(fā)現(xiàn), PGI2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以直接或間接的促進(jìn)treg 的形成和treg 功能, 從而治療炎癥性疾病或者自身免疫病。這可能與本試驗(yàn)中ZF5組的非特異性免疫酶AKP 顯著高于ZF7 組有關(guān)。

KEGG 中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、神經(jīng)活性配體-受體通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路中的差異表達(dá)代謝物數(shù)目較多且富集程度極顯著。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白催化ATP 的水解, 將反應(yīng)中釋放的能量與其他細(xì)胞功能耦合, 實(shí)現(xiàn)腸道內(nèi)各物質(zhì)的輸入與輸出(Bieczynskietal, 2021), 這與本研究中腸道消化酶和腸道組織的結(jié)果相呼應(yīng)。Xia 等(2020)對(duì)羅非魚(yú)的研究表明, 添加乳酸菌對(duì)其腸道差異代謝物的代謝途徑具有顯著影響, 包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋氨酸和半胱氨酸的代謝、氨基酸的生物合成、蛋白質(zhì)的消化吸收、花生四烯酸的代謝等。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑是主要參與神經(jīng)傳遞的氨基酸代謝途徑, 其代謝途徑是由多種代謝物變化的結(jié)果。其中γ -氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),在促進(jìn)攝食、調(diào)節(jié)能量代謝、參與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和免疫防御等方面發(fā)揮著重要作用(Xieetal, 2017)。在中華絨螯蟹的日糧中添加GABA 后, 影響了其攝食相關(guān)基因的表達(dá), 促進(jìn)了消化酶活性(Zhangetal, 2022)。這也與本研究中腸道消化酶顯著升高的結(jié)果相一致, 其原因可能是添加球形賴氨酸芽孢桿菌后增強(qiáng)了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑, 有助于其腸道消化吸收代謝物的富集, 從而增強(qiáng)了其消化吸收的能力。

4 結(jié)論

養(yǎng)殖水體中添加球形賴氨酸芽孢桿菌后提高了斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道微生物的多樣性, 使其腸道代謝產(chǎn)物發(fā)生顯著變化, 調(diào)節(jié)免疫能力的Lipoxin a4 顯著上調(diào), 促進(jìn)了斑馬魚(yú)幼魚(yú)抗氧化和免疫能力的提升。同時(shí)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝通路的富集促進(jìn)了斑馬魚(yú)幼魚(yú)腸道消化能力的提高, 有利于改善斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能。