李 芳, 羅 茜

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院, 廣東 深圳 518055)

人類多數(shù)疾病的發(fā)生是由環(huán)境和基因因素共同驅(qū)動(dòng),超過70%的疾病與環(huán)境污染有關(guān)[1]。明確環(huán)境污染暴露與人體健康及特定疾病間的因果關(guān)系,鎖定關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因子,有助于疾病的精準(zhǔn)防控。重金屬、顆粒物和有機(jī)污染物等的暴露從妊娠期開始貫穿整個(gè)生命周期,可通過呼吸、飲食、皮膚接觸和母嬰傳遞等途徑進(jìn)入體內(nèi),并對(duì)健康產(chǎn)生潛在威脅。污染物對(duì)健康的影響十分復(fù)雜,進(jìn)入體內(nèi)后由血液或其他體液轉(zhuǎn)送到機(jī)體各個(gè)組織和器官,進(jìn)行代謝和蓄積,通過與多種生物分子相互識(shí)別和交互作用而產(chǎn)生毒性效應(yīng)[2]。闡明外源性污染物在生物體內(nèi)和特定器官微區(qū)中的分布特征及暴露引發(fā)的毒性效應(yīng)是環(huán)境毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容。除了常規(guī)毒理學(xué)手段,組學(xué)技術(shù)也是目前解析污染物毒性效應(yīng)的有力工具。內(nèi)源性代謝物不僅可以放大相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的變化,還可作為調(diào)節(jié)劑直接調(diào)控生理過程和表型,定量描述代謝物變化的代謝組學(xué)技術(shù)已被用于多種環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)、作用機(jī)制和生物標(biāo)志物研究中[3]。

組織中外源性污染物的分布呈不均勻且動(dòng)態(tài)變化,內(nèi)源性代謝物合成和累積也具有精準(zhǔn)的空間分布,這與組織的細(xì)胞異質(zhì)性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)[4]。常用的正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、磁共振成像(MRI)、熒光成像和拉曼成像等分子成像技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率、實(shí)時(shí)性和非侵入性等優(yōu)勢(shì),但難以在無標(biāo)記的基礎(chǔ)上同時(shí)實(shí)現(xiàn)組織中數(shù)百種及以上化合物的可視化分析。質(zhì)譜技術(shù)是污染物和內(nèi)源性代謝物定性和定量分析最主要的技術(shù)手段。常規(guī)分析時(shí)需將生物樣品和組織勻漿處理以獲得豐富的分子信息,但此操作會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物的空間信息丟失。應(yīng)運(yùn)而生的激光顯微切割技術(shù)通過對(duì)特定位置細(xì)胞和組織進(jìn)行取樣而保留待測(cè)物的空間位置信息,是目前空間多組學(xué)分析的關(guān)鍵技術(shù),但后續(xù)生物分子的空間分布重構(gòu)較為復(fù)雜。質(zhì)譜成像技術(shù)(mass spectrometry imaging, MSI)是一種基于質(zhì)譜分析的新型分子影像技術(shù),能夠直接掃描生物組織切片,從而獲得大量已知或未知內(nèi)源性和外源性化合物(如小分子代謝物、蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)和藥物等)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、相對(duì)含量和空間分布信息[5]。Huang等[6]利用此技術(shù)對(duì)氯化石蠟和六溴環(huán)十二烷在斑馬魚器官中的毒代動(dòng)力學(xué)和代謝毒性效應(yīng)進(jìn)行了原位表征。本文基于不同MSI技術(shù)原理和特點(diǎn),系統(tǒng)綜述了MSI技術(shù)在環(huán)境污染物分析和代謝毒性效應(yīng)解析方面的應(yīng)用進(jìn)展。

1 質(zhì)譜成像技術(shù)概述

1.1 MSI技術(shù)原理

MSI技術(shù)是一種以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的表征離體組織和細(xì)胞中元素和化合物空間分布的免標(biāo)記影像技術(shù)。通過一個(gè)聚焦的電離源(如離子槍、激光、分子束等)直接掃描樣品使其表面分子解吸離子化,通過質(zhì)量分析器檢測(cè)各個(gè)像素點(diǎn)的質(zhì)荷比(m/z)和離子強(qiáng)度,最終由成像軟件結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)和位置信息對(duì)待測(cè)物的空間分布進(jìn)行重構(gòu)和可視化[7]。該技術(shù)可提供生物整體、組織微區(qū)、單細(xì)胞或亞細(xì)胞尺度待測(cè)物的定性、相對(duì)定量和定位信息。MSI技術(shù)于1997年首次用于大鼠垂體中激素肽和胰腺組織中胰島素的可視化分析,隨著電離源技術(shù)和質(zhì)量分析器的發(fā)展與進(jìn)步,目前已在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。

1.2 常用質(zhì)譜成像技術(shù)類型

目前常用MSI技術(shù)根據(jù)離子化方式的不同可分為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像技術(shù)(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging, MALDI-MSI)、解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像技術(shù)(desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, DESI-MSI)、二次離子質(zhì)譜成像技術(shù)(secondary ion mass spectrometry imaging, SI-MSI)和激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜成像技術(shù)(laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry imaging, LA-ICP-MSI)等[8]。這些技術(shù)在適用分析對(duì)象和空間分辨率等方面各具特點(diǎn),詳見表1。

表1 常見質(zhì)譜成像技術(shù)的比較

1.2.1MALDI-MSI技術(shù)

MALDI-MSI是目前應(yīng)用最廣泛的MSI技術(shù),通過激光束照射基質(zhì)噴涂過的樣品表面,基質(zhì)吸收激光能量并傳遞給待測(cè)物使其解吸與離子化,適用于生物樣本表面代謝物、多肽、蛋白質(zhì)和藥物等化合物的可視化分析[9]。除了激光激發(fā)波長(zhǎng)和強(qiáng)度外,基質(zhì)選擇對(duì)于MALDI離子化效率至關(guān)重要。常用基質(zhì)包括2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、α-氰基-4-羥基肉桂酸和芥子酸等[10],但它們存在背景峰干擾高、選擇性弱和相對(duì)分子質(zhì)量較低的化合物電離效率低等問題。為此,研究者們開發(fā)了9-氨基吖啶、N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽、1,5-二氨基萘、烷基化DHB和3-氨基鄰苯二甲酰肼等有機(jī)小分子[11,12]和金、銀、碳及其氧化物等無機(jī)納米材料新型基質(zhì)[13,14]。近期,我們團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一類具有甲基吡啶鎓甲醛陽離子結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性試劑,可與膽固醇的羥基進(jìn)行親核加成反應(yīng)促進(jìn)其解吸和電離[15]。該技術(shù)成像空間分辨率取決于基質(zhì)結(jié)晶尺寸和激光光斑尺寸,真空MALDI分辨率為5～10 μm,大氣壓MALDI分辨率最高可達(dá)1.4 μm[16]。最新的激光誘導(dǎo)后電離(MALDI-2)技術(shù)將空間分辨率提升至0.6 μm,靈敏度也提高了1～3個(gè)數(shù)量級(jí)[17]。

1.2.2DESI-MSI技術(shù)

DESI-MSI是一種常壓常溫、敞開式MSI技術(shù),高速霧化氣帶動(dòng)溶劑在高電壓下形成電噴霧,直接吹掃樣品表面濺射出含待測(cè)物的次級(jí)帶電液滴束,溶劑快速蒸發(fā)將電荷轉(zhuǎn)移給待測(cè)物并使其形成氣態(tài)離子,通過離子傳輸管進(jìn)入質(zhì)量分析器[18]。成像效果與電噴霧溶劑組成和流速有關(guān),會(huì)影響樣品表面待測(cè)物的溶解度、擴(kuò)散性和離子化效率,主要用于分子質(zhì)量2 000 Da以下化合物的分析。成像空間分辨率受噴霧裝置限制,噴嘴與樣品表面和質(zhì)譜進(jìn)樣口間的距離和角度對(duì)空間分辨率和信號(hào)強(qiáng)度影響極大?，F(xiàn)有商業(yè)儀器空間分辨率為20 μm,對(duì)于大面積生物樣品和非生物樣品中化合物成像分析獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。Laskin等[19]采用2個(gè)二氧化硅毛細(xì)管組裝的納噴解吸電噴霧電離源(Nano-DESI),通過將探針與流動(dòng)相形成流動(dòng)溶劑橋直接接觸樣品表面進(jìn)行成像分析,離子傳輸效率大大提升且易產(chǎn)生多電荷蛋白質(zhì)離子,最新研究將此技術(shù)空間分辨率降至7 μm[20]。

1.2.3SI-MSI技術(shù)

SI-MSI技術(shù)可用于元素和分子質(zhì)量小于1 000 Da的疏水性化合物的可視化分析,是目前空間分辨率最高的MSI技術(shù)。在高真空環(huán)境下,利用聚焦的高能初級(jí)離子束轟擊樣品表面,產(chǎn)生次級(jí)離子進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行分析,已被用于地球科學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域[21]。根據(jù)離子束類型和束流大小可分為動(dòng)態(tài)SI-MSI和靜態(tài)SI-MSI。前者采用單原子離子束(如CS+、O-和Ar+等)進(jìn)行元素成像分析,納米SI-MSI成像空間分辨率可達(dá)50 nm;后者以多原子或團(tuán)簇原子離子束(如Au3+、Bi3+、C60+、Ar2500+和Au400+等)進(jìn)行化合物和部分元素成像分析,空間分辨率為μm尺度。SI-MSI技術(shù)分析分子質(zhì)量較大化合物時(shí)存在二次離子產(chǎn)額較低且離子碎片化嚴(yán)重。Tian等[22]開發(fā)的可用于SI-MSI系統(tǒng)的70 keV (CO2)n+(n>10 000)氣團(tuán)離子束,化學(xué)破壞性較低,可檢測(cè)化合物分子質(zhì)量范圍擴(kuò)大到了3 000 Da,空間分辨率降至1 μm。

1.2.4LA-ICP-MSI技術(shù)

與前三者技術(shù)不同,LA-ICP-MSI技術(shù)發(fā)展最早且最為成熟,主要用于元素可視化分析。通過將激光束聚焦于樣品表面使微區(qū)樣品熔蝕氣化,由載氣將樣品微粒送至等離子體中進(jìn)行原子化并電離,最后進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行檢測(cè),具有分析速度快、進(jìn)樣效率高、可進(jìn)行多元素同時(shí)分析并提供同位素信息的優(yōu)勢(shì)。自2003年首次被用于表征羊肝臟組織中Cu的分布后,LA-ICP-MSI技術(shù)開始被廣泛用于生命科學(xué)領(lǐng)域中的元素成像分析[23]。由于衍射極限和透鏡數(shù)值孔徑限制,LA-ICP-MS技術(shù)的空間分辨率在μm尺度。Meng等[24]研制的三通結(jié)構(gòu)樣品剝蝕池使LA-ICP-MS成像系統(tǒng)空間分辨率降低至0.4 μm,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠小腸組織和Hela細(xì)胞內(nèi)藥物和納米材料的可視化分析。近年來,將LA-ICP-MS技術(shù)與免疫組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的質(zhì)譜流式成像系統(tǒng)可在單細(xì)胞層面實(shí)現(xiàn)數(shù)十個(gè)蛋白質(zhì)和其他生物分子的成像分析,擴(kuò)大了可檢測(cè)目標(biāo)物范圍。

1.2.5其他技術(shù)

隨著離子化技術(shù)的革新,一系列解吸/后電離和等離子體新型電離技術(shù)不斷出現(xiàn)?？諝鈩?dòng)力輔助離子源(AFAI-DESI)利用空氣流實(shí)現(xiàn)大氣壓中離子或帶電液滴的遠(yuǎn)距離傳輸,在質(zhì)譜入口富集帶電液滴,提高了離子化效率,并擴(kuò)展了待測(cè)樣品的應(yīng)用空間[25]。激光消融電噴霧電離源通過先將待測(cè)物激光消融解吸后再進(jìn)行電噴霧離子化,可進(jìn)行大分子質(zhì)譜化合物的成像分析[26]。介質(zhì)阻擋放電電離源通過在兩個(gè)放電電極之間放置絕緣介質(zhì),施加交流電壓使兩電極間的惰性氣體或混合氣體電離形成穩(wěn)定低溫等離子體,并對(duì)載體上的待測(cè)物進(jìn)行解吸和離子化[27]。低溫等離子體電離源則是利用氣體(He、Ar或空氣)在電場(chǎng)放電作用下產(chǎn)生的低溫等離子體噴射樣品表面使待測(cè)化合物解吸并離子化[28]。這些離子化技術(shù)在檢測(cè)目標(biāo)物類別、空間分辨率、電離效率、穩(wěn)定性和靈敏度等方面得到了不同程度的提升和改進(jìn)。

1.3 常見MSI質(zhì)量分析器

質(zhì)量分析器是成像質(zhì)譜儀的核心組成部分,高質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精度是進(jìn)行化合物準(zhǔn)確注釋的必要條件。MSI技術(shù)多采用高分辨質(zhì)量分析器。飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF MS)因靈敏度高、分析速度快、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分子且理論上無質(zhì)量檢測(cè)上限,成為MSI技術(shù)最常用的質(zhì)量分析器。靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和多反射TOF MS的質(zhì)量分辨率> 100 000、質(zhì)量精度< 10-6(1 ppm),常與DESI、常壓MALDI和AFAI-DESI等離子化技術(shù)相結(jié)合[29-31]。近年來,離子淌度技術(shù)因?qū)Y(jié)構(gòu)類似物和同分異構(gòu)體的分離能力強(qiáng)在MSI系統(tǒng)中表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì),顯著提高了化合物的鑒定準(zhǔn)確性和成像精度,尤其在脂質(zhì)組可視化分析方面。Djambazova等[32]將捕集離子淌度技術(shù)用于MALDI-MSI系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)峰容量提高了250%,實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂質(zhì)sn位置、酰基鏈和C=C位置異構(gòu)體的分離。近日,研究者將淌度分離后的母離子不經(jīng)質(zhì)量隔離而完全碎裂并進(jìn)行非依賴數(shù)據(jù)采集,結(jié)合智能譜圖解卷積算法實(shí)現(xiàn)了多種脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析和組織空間分布可視化,在不增加成像分析時(shí)間的情況下顯著提升了脂質(zhì)組結(jié)構(gòu)解析能力[33]。

1.4 質(zhì)譜成像技術(shù)分析流程

MSI分析工作流程為樣品制備-質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集-數(shù)據(jù)處理與可視化分析,見圖1。以小鼠腎臟組織成像為例,首先收集新鮮腎臟組織立即冷凍,冰凍切片(厚度5～20 μm),并進(jìn)行切片預(yù)處理;以網(wǎng)格劃分模式進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得各像素點(diǎn)質(zhì)譜圖,經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行鑒定、統(tǒng)計(jì)分析和可視化。

圖 1 常見MSI技術(shù)及工作流程Fig. 1 Common MSI techniques and visual workflow

維持組織形態(tài)不變和組織完整性對(duì)物質(zhì)分子信號(hào)強(qiáng)度和定位十分重要,同時(shí)組織切片操作和保存不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致表面分子降解移位影響質(zhì)譜成像的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。數(shù)據(jù)采集質(zhì)量取決于成像質(zhì)譜儀的性能,根據(jù)需求選擇離子化技術(shù),高分辨率和高精度質(zhì)量分析器是分子鑒定的必要條件。低極性、難電離物質(zhì)分子是MSI可視化分析的難點(diǎn),研究者們采用酯化、?；⒓映?、取代、氧化等化學(xué)原位衍生化技術(shù)增強(qiáng)它們的電離效率,并改變分子質(zhì)量與背景信號(hào)進(jìn)行區(qū)分。Shariatgorji等[34]使用具有1-甲基-2-氟代吡啶陽離子結(jié)構(gòu)的試劑對(duì)一級(jí)胺、二級(jí)胺和酚類等多種神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行原位衍生化,實(shí)現(xiàn)了腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的全景式可視化分析。海量成像數(shù)據(jù)經(jīng)基線校正、峰提取、峰對(duì)齊與峰校正、峰歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行化合物重構(gòu)和可視化[35],可用的成像軟件包括SCiLS lab、HDI和MassImagerTM等商業(yè)化軟件和MALDIquant、Cardinal、rMSIproc8、MSireader和Datacube Explorer等開源軟件。此外,以MSI數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),與組織學(xué)染色或影像學(xué)數(shù)據(jù)多模態(tài)融合實(shí)現(xiàn)分子信息與解剖結(jié)構(gòu)間的空間匹配,可更全面解讀污染物的毒性效應(yīng)[36]。

2 質(zhì)譜成像技術(shù)在環(huán)境污染物分析研究中的進(jìn)展

外源性的污染物進(jìn)入生物體內(nèi)后會(huì)分布到全身各個(gè)組織和器官,在不同組織和器官中的代謝速度和累積量不同。生物體內(nèi)污染物分布特征描述和量化是環(huán)境毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容。MSI技術(shù)已被用于模式動(dòng)物和植物中多種重金屬、顆粒物和有機(jī)污染物的可視化分析,見表2。

表2 MSI技術(shù)在生物體內(nèi)環(huán)境污染物分布特征研究中的應(yīng)用

2.1 重金屬

重金屬是一類重要的環(huán)境污染物,進(jìn)入體內(nèi)后不易被排出。Zarco-Fernández等[37]采用LA-ICP-MSI技術(shù)研究了Cd(Ⅱ)、CH3Hg(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)和iAs(Ⅲ)暴露48 h后在斑馬魚中的分布特征,發(fā)現(xiàn)Cd(Ⅱ)主要富集在眼睛處,CH3Hg(Ⅱ)則主要富集在消化道,其余兩個(gè)金屬離子均未進(jìn)入體內(nèi)。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)TiO2納米顆粒能顯著增加線蟲生殖腺和胚胎中Cd的負(fù)荷量,促進(jìn)Cd通過種系轉(zhuǎn)移到下一代。Pessa等[39]采用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)Cd可從土壤轉(zhuǎn)移到葵花仁種子中,且子葉中含量最高。由于缺乏與待測(cè)樣品基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、易受基體效應(yīng)、分餾效應(yīng)和質(zhì)量歧視等影響,LA-ICP-MSI技術(shù)難以對(duì)組織內(nèi)元素進(jìn)行絕對(duì)定量分析,可采用油墨印刷、干燥液滴、明膠薄膜基質(zhì)等策略進(jìn)行校正。

2.2 顆粒物

日常生活環(huán)境中存在著大量的顆粒物,如PM2.5和人造納米顆粒等。研究者們采用LA-ICP-MSI技術(shù)解析納米顆粒在小鼠器官中的分布特征,發(fā)現(xiàn)Ag納米顆粒主要聚集在小鼠腎臟腎皮質(zhì)及其與髓質(zhì)交界區(qū)域,且后者處的含量明顯高于前者[40], PbO納米顆粒呼吸暴露后除了肺組織還會(huì)進(jìn)入小鼠肝臟和腎臟組織中[41], CeO2納米顆粒主要累積在小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞和小葉周圍,在脾臟的累積與暴露時(shí)長(zhǎng)有關(guān),短期暴露主要累積在小鼠脾臟邊緣區(qū),長(zhǎng)期暴露會(huì)深入白髓區(qū)[42]。此技術(shù)還被用于解析顆粒物在植物中的分布和遷移規(guī)律,研究發(fā)現(xiàn)La2O3納米粒子主要分布在小球藻葉片的主靜脈中[43],石墨烯納米顆粒物富集在大豆葉片中央和主靜脈附近及根皮質(zhì)層,而氧化石墨烯則表現(xiàn)為更加均勻地向葉片周圍擴(kuò)散和富集在根篩管部[44]。黑碳污染物可不使用基質(zhì)直接進(jìn)行MALDI-MSI分析,且質(zhì)譜指紋圖譜不受其來源和形態(tài)影響,研究發(fā)現(xiàn)PM2.5來源的黑碳顆粒主要累積在小鼠肺部,且短期內(nèi)幾乎不會(huì)向其他組織和器官中轉(zhuǎn)移[45]。

2.3 有機(jī)污染物

有機(jī)污染物種類繁多,大多數(shù)具有生物累積性和持久性。Bian等[46]采用MALDI-MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)全氟辛酸能進(jìn)入斑馬魚多個(gè)組織,在膽囊、肝臟、心臟、腎臟與腸道中的動(dòng)態(tài)累積趨勢(shì)一致,在魚鰾、脊骨、鰓、肌肉與大腦一致,但與前者不同。Chen等[47]利用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)全氟辛烷磺酸主要富集在小鼠腎臟腎盂和外皮質(zhì)區(qū),在髓質(zhì)和內(nèi)皮質(zhì)區(qū)含量較少。將此技術(shù)用于蜜蜂體內(nèi)煙堿類農(nóng)藥毒代動(dòng)力學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)呋蟲胺(dinotefuran)和啶蟲脒(acetamiprid)農(nóng)藥經(jīng)口暴露2 h后能迅速穿透蜜蜂的各種生物屏障分布在全身部位,并在腸道進(jìn)行富集,6 h后呋蟲胺均勻分布在蜜蜂體內(nèi),而啶蟲脒則已降解50%[48]。此外,MSI技術(shù)還被用來解析植物中農(nóng)藥的遷移規(guī)律。Gerbig等[49]利用DESI-MSI技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉(imidacloprid)在平枝栒子(Cotoneasterhorizontalis)葉片邊緣積聚,而甲硫威(methiocarb)分布較均勻;土壤中的樂果(dimethoate)25天時(shí)主要分布在長(zhǎng)壽花(Kalanchoeblossfeldiana)運(yùn)輸系統(tǒng)中,60天時(shí)則主要分布在葉片中。

總體來說,MSI技術(shù)可繪制外源性環(huán)境污染物在生物組織中的空間分布特征,為污染物的毒代動(dòng)力學(xué)和植體內(nèi)遷移規(guī)律研究提供了更為直接的證據(jù)。與重金屬成像分析相比,生物組織中有機(jī)污染物的離子化效率低,目前商業(yè)化成像儀器僅可對(duì)少量有機(jī)污染物進(jìn)行可視化分析。最新研究通過在AFAI-DESI噴霧溶劑中加入四苯基氯化膦提高多鹵化烷基化合物的離子化效率[6],發(fā)現(xiàn)短鏈氯化石蠟、中鏈氯化石蠟和六溴環(huán)十二烷可進(jìn)入斑馬魚的多個(gè)組織中,前兩者在鰓、肝臟和心臟中含量最高,后者在腎臟中也高度富集。

3 質(zhì)譜成像技術(shù)在環(huán)境污染物毒性效應(yīng)研究中的進(jìn)展

3.1 MSI技術(shù)用于模式生物中內(nèi)源性代謝物的空間分布特征研究

環(huán)境污染物毒性效應(yīng)研究常選與人類基因高度相似的模式生物進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn),包括大小鼠和斑馬魚等,基于MSI的空間代謝組學(xué)技術(shù)可用于這些模式生物整體或特定組織中代謝物的可視化分析[50]。Pang等[31]采用AFAI-DESI-MSI技術(shù)表征了大鼠腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)、嘌呤、有機(jī)酸、多胺、膽堿和碳水化合物的微區(qū)分布,如乙酰膽堿在大腦皮質(zhì)中的豐度最高,γ-氨基丁酸在中腦、嗅球和下丘腦豐度較高,多巴胺主要分布在紋狀體,而組胺則主要分布在海馬和丘腦中,在此基礎(chǔ)上繪制了腦組織中不同微區(qū)間的代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜。腦組織中脂質(zhì)也具有特異的微區(qū)分布特征[51],我們團(tuán)隊(duì)采用DESI-MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)小鼠大腦中脂質(zhì)分布特征主要分為三類:白質(zhì)和丘腦區(qū)高豐度、皮層和海馬區(qū)高豐度及腦室區(qū)高豐度。斑馬魚因體型較小,采用明膠和羧甲基纖維素(CMC)包埋后可對(duì)胚胎、幼魚和成魚整體及特定組織進(jìn)行MSI分析。研究發(fā)現(xiàn),部分磷脂酰膽堿(PC)和脂肪酸在斑馬魚眼睛、腦、鰓、腸中的含量明顯高于其他組織,如PC(34∶1)在眼睛、腦和脊柱中豐度較高,PC(o-32∶0)在鰓中豐度較高,PC(30∶0)則在眼睛視網(wǎng)膜和晶狀體中高度富集,脂肪酸則主要分布在鰓和腸道中[52,53]。Duenas等[54]采用MALDI-MSI技術(shù)也發(fā)現(xiàn)新受精斑馬魚胚胎中常見磷脂在胚盤內(nèi)和卵黃邊界均呈對(duì)稱分布,PC特異性富集在卵黃和囊胚區(qū),磷脂酰乙醇胺(PE)富集在胚盤中,磷脂酸(PA)和磷脂酸(PI)富集在囊胚區(qū),磷脂酰絲氨酸(PS)則富集在胚胎壁上。此外,研究者們也采用MSI技術(shù)建立了特定脂質(zhì)與大型溞、昆蟲等模式生物解剖特征的關(guān)聯(lián)性[55]。

3.2 MSI技術(shù)在環(huán)境污染物毒性效應(yīng)研究中的應(yīng)用

環(huán)境污染物暴露會(huì)引起生物體內(nèi)生物學(xué)過程受損,對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且異質(zhì)性的靶器官和效應(yīng)器官的毒性效應(yīng)和機(jī)制更為復(fù)雜。基于MSI技術(shù)的空間代謝組學(xué)已被用于環(huán)境污染物毒性效應(yīng)、作用機(jī)制和暴露生物標(biāo)志物研究中,詳見表3。

表3 MSI技術(shù)在環(huán)境污染物毒性效應(yīng)研究中的應(yīng)用

MSI技術(shù)用于研究環(huán)境污染物全身效應(yīng)時(shí)主要針對(duì)體型較小的斑馬魚、蜜蜂和蚯蚓等模式生物。Liu等[56]采用MALDI-MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)氟蟲腈暴露后斑馬魚體內(nèi)PC、PS和PI含量明顯下降,眼睛部位最為明顯,顯著變化脂質(zhì)包括PC (34∶2)、PC (34∶1)、PC (34∶2)、PC (36∶4)、PC (38∶6)、PS (18∶0/22∶6)、PI (18∶0/20∶4)和PI (18∶1/20∶4)。Zhang等[57]采用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)石墨烯納米顆粒暴露會(huì)影響蚯蚓尾部區(qū)域丙氨酸和苯丙氨酸減少,頭部區(qū)域脯氨酸、組氨酸和精氨酸增加,且不同部位谷氨酸變化與暴露劑量有關(guān)。Huang等[6]采用AFAI-DESI-MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)短鏈和中鏈氯化石蠟暴露會(huì)導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)大多數(shù)內(nèi)源性代謝物濃度降低,前者主要引發(fā)肝臟中PC和PE含量下降和甘油三酯(TG)累積,后者主要引發(fā)肝臟、腸道、心臟、大腦中多胺和肌苷相關(guān)代謝物顯著降低;六溴環(huán)十二烷暴露可使得斑馬魚肌肉中脯氨酸、腎臟中肌酸和肌酐以及卵巢中甘油磷脂(PC和PE)含量升高。

基于空間代謝組學(xué)的環(huán)境污染物暴露對(duì)模式生物的器官毒性效應(yīng)研究主要采用MALDI-MSI技術(shù)。蔡宗葦教授團(tuán)隊(duì)采用此技術(shù)對(duì)雙酚S的靶器官毒性效應(yīng)進(jìn)行了全面解析,發(fā)現(xiàn)暴露后BALB/c裸鼠肝臟中PE、溶血PC(LPC)、溶血PE和溶血PS顯著升高,PC和PS顯著下調(diào),且部分脂質(zhì)呈非均勻變化[58];腎皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂中炎癥相關(guān)神經(jīng)酰胺和鞘磷脂(SM)上調(diào),腎皮質(zhì)中與結(jié)構(gòu)脂質(zhì)甘油磷脂、鞘脂和甘油酯變化趨勢(shì)多樣[59];脾臟白質(zhì)中炎癥相關(guān)脂質(zhì)也發(fā)生了顯著變化[60]。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露后孕鼠胎盤和胎鼠腦組織中部分脂質(zhì)含量上調(diào)且空間分布變化,并以性別特異性差異方式誘導(dǎo)子代認(rèn)知和情緒障礙[61]。我們團(tuán)隊(duì)采用此技術(shù)表征了苯并[a]芘暴露小鼠不同靶器官脂質(zhì)的變化特征,發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織中16個(gè)PC、LPC和SM共三類結(jié)構(gòu)脂質(zhì)空間分布發(fā)生變化,且含量均下調(diào)[62];腦組織皮層、海馬、白質(zhì)和丘腦4個(gè)腦區(qū)中甘油磷脂、甘油酯和脂肪酸含量也發(fā)生了變化,不同腦區(qū)差異脂質(zhì)類別明顯不同。此外,研究者們還發(fā)現(xiàn)Cd暴露會(huì)導(dǎo)致ICR小鼠肝臟中部分甘油二酯和甘油三酯含量下調(diào)[63],氯咪巴唑暴露可顯著影響斑馬魚卵巢中谷胱甘肽和脂肪酸代謝通路[64]。

總體來看,與代謝組學(xué)技術(shù)相比,基于MSI技術(shù)的空間代謝組學(xué)可原位表征生物體對(duì)污染物暴露的代謝應(yīng)答情況,尤其是在小體型模式生物和異質(zhì)性的組織和器官中。MSI技術(shù)為外源性污染物毒性效應(yīng)研究開辟了新視角,通過與常規(guī)毒理學(xué)技術(shù)或其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合可對(duì)污染物毒性進(jìn)行全面解讀。

4 結(jié)論與展望

MSI技術(shù)在環(huán)境污染物分析及毒性效應(yīng)研究中發(fā)揮著重要作用,主要用來提供外源性污染物和內(nèi)源性代謝物在模式生物全身和特定組織中的含量和空間分布信息。不同離子化技術(shù)的工作原理、適用分析對(duì)象和成像空間分辨率等不同。采用MSI技術(shù)原位解析模式生物體內(nèi)污染物的毒代動(dòng)力學(xué)與代謝應(yīng)答的毒性效應(yīng)研究,有助于闡明污染物的毒性效應(yīng)與作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)暴露生物標(biāo)志物。盡管MSI技術(shù)表現(xiàn)出了獨(dú)特的原位可視化分析的優(yōu)勢(shì),但對(duì)于低含量、難電離的有機(jī)污染物和內(nèi)源性代謝物的分析效果不佳。而且MSI技術(shù)本身也存在可重復(fù)性較差、數(shù)據(jù)采集時(shí)間長(zhǎng)、化合物注釋和鑒定難等問題。為此,迫切需要研發(fā)能夠兼顧高分辨率和成像速度的新型高靈敏度的成像質(zhì)譜,開發(fā)先進(jìn)的質(zhì)譜成像軟件和海量數(shù)據(jù)的挖掘系統(tǒng)。此外,發(fā)展多模態(tài)成像技術(shù),將MSI與其他分子成像技術(shù)和空間組學(xué)技術(shù)相結(jié)合,以最大限度地獲取化學(xué)和生物信息,全面解析污染物的毒性。隨著MSI成像技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,必將進(jìn)一步推動(dòng)環(huán)境污染物分析及毒理學(xué)研究,極大地拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。