胡小鍵, 李振環(huán), 謝琳娜, 付 慧, 朱 英

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

抗生素是一類具有抑菌和殺菌活性的化合物,其被廣泛應(yīng)用于臨床治療、畜牧養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域,并發(fā)揮了重要作用[1,2]。我國(guó)作為抗生素生產(chǎn)和消費(fèi)的第一大國(guó),2020年抗生素產(chǎn)量高達(dá)22.3萬噸[3]。β-受體激動(dòng)劑能夠與腎上腺素β受體結(jié)合,從而激活受體產(chǎn)生腎上腺素樣作用,可用于治療哮喘或慢性阻塞性肺疾病。β-受體激動(dòng)劑還因具有促生長(zhǎng)作用,曾廣泛應(yīng)用于增加畜牧養(yǎng)殖過程中的牲畜重量、提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加瘦肉率等。隨著抗生素和β-受體激動(dòng)劑用量的不斷增多,其在不同環(huán)境介質(zhì)及食品中的檢出率也不斷增高[4-10],這給生態(tài)環(huán)境和人體健康均帶來了較大的風(fēng)險(xiǎn)[11]。抗生素和β-受體激動(dòng)劑會(huì)通過環(huán)境暴露和食物鏈進(jìn)入人體,進(jìn)而造成一系列人體健康危害。此外,抗生素會(huì)導(dǎo)致抗性基因和耐藥性等問題的產(chǎn)生,其危害影響更加深遠(yuǎn)[12]。β-受體激動(dòng)劑在人體內(nèi)蓄積到一定量時(shí),會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生肌肉震顫、頭暈、心跳加快等癥狀?？股馗鶕?jù)用途分類,可分為人用抗生素(human antibiotics, HAs)、獸用抗生素(veterinary antibiotics, VAs)、優(yōu)先作為人用抗生素(antibiotics preferred as HA, PHAs)和優(yōu)先作為獸用抗生素(antibiotics preferred as VA, PVAs)。我國(guó)正在逐漸收緊VAs的限量標(biāo)準(zhǔn)及種類,并明確禁止在動(dòng)物飼料和飲用水中使用β-受體激動(dòng)劑。青少年階段是人體生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,長(zhǎng)期受到低劑量抗生素和β-受體激動(dòng)劑暴露會(huì)對(duì)青少年的健康產(chǎn)生不良影響。目前我國(guó)關(guān)于青少年體內(nèi)抗生素水平的研究較少,本研究主要針對(duì)山東省某地區(qū)青少年體內(nèi)的35種抗生素和4種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行測(cè)定,旨在了解該地區(qū)青少年體內(nèi)抗生素和β-受體激動(dòng)劑的暴露特征,為科學(xué)管理抗生素和β-受體激動(dòng)劑的使用、降低人群健康風(fēng)險(xiǎn)等方面提供重要依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效液相色譜(I Class,美國(guó)Waters公司)-串聯(lián)質(zhì)譜儀(QTRAP 6500,美國(guó)AB SCIEX公司); BY-400C型96孔離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司); LW20型振蕩水浴鍋(北京萊伯泰科儀器股份有限公司); PL2002型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); VORTEX-6型渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); IQ7005型純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司); EVOLUTE?EXPRESS ABN 96孔固相萃取板、ExtraheraTMHV-5000大容量自動(dòng)化樣品制備工作站、TurboVap?96 Dual全自動(dòng)氮吹濃縮儀(瑞典Biotage公司)。

甲醇和乙腈(質(zhì)譜級(jí),德國(guó)Merck公司);甲酸、乙酸和乙酸銨(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Thermo Fisher公司);β-葡萄糖醛酸酶(葡萄糖醛酸酶活力≥85 000 units/mL,含芳基硫酸酯酶活力≤7 500 units/mL,美國(guó)Sigma公司); 35種抗生素、4種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)(純度均>95%)購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 研究對(duì)象

選擇山東省某中學(xué)的442名青少年為研究對(duì)象,年齡分布為11～15歲;所有研究對(duì)象均為該地區(qū)的常住居民,由本人及其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書,并配合完成生物樣本的采集及相應(yīng)的調(diào)查。根據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(USCDC)標(biāo)準(zhǔn)[13],本研究按照身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)百分位數(shù)將青少年體重劃分成4個(gè)等級(jí),分別為體重過輕(BMI<5%)、正常體重(5%≤BMI<85%)、超重(85%≤BMI<95%)和肥胖(≥95%)。本研究已取得中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所倫理審查委員會(huì)的許可(編號(hào)201813),且每位研究對(duì)象的個(gè)人信息均得到保密。青少年調(diào)查對(duì)象的人口學(xué)特征見表1。

表1 青少年調(diào)查對(duì)象的人口學(xué)特征

1.3 尿樣采集

采用醫(yī)用尿杯對(duì)研究對(duì)象的即時(shí)尿進(jìn)行收集,之后在現(xiàn)場(chǎng)分裝成5 mL/管,并置于凍存管中,于4 ℃冰箱暫存,待樣品全部采集完成后統(tǒng)一低溫轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存。同時(shí)在現(xiàn)場(chǎng)用純水模擬尿樣采集過程,設(shè)置現(xiàn)場(chǎng)空白。

1.4 尿樣檢測(cè)

1.4.1尿肌酐檢測(cè)

參考《尿中肌酐分光光度測(cè)定方法》(WS/T 97-1996)[14],利用分光光度法對(duì)尿肌酐的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2抗生素和β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)

采用同位素稀釋-高通量全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對(duì)尿液中的抗生素和β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。首先在1 mL尿液樣本中加入10 μL內(nèi)標(biāo)(0.4 ng/μL)、200 μL乙酸銨緩沖液(1 mol/L, pH 5)和20 μLβ-葡萄糖醛酸酶,經(jīng)37 ℃水浴水解12 h后,采用96孔固相萃取板對(duì)其進(jìn)行前處理,獲得樣本提取液;利用氮吹儀將提取液濃縮至0.2 mL,并采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。具體溶液配制方法、樣品前處理方法和儀器分析條件參考《基于高通量全自動(dòng)固相萃取的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人尿中16種抗生素和4種β-受體激動(dòng)劑》[15];其中,39種目標(biāo)物及同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表2,流動(dòng)相的梯度洗脫程序見表3?；前芳讎f唑、甲氧芐啶、磺胺林、磺胺氯吡嗪分別以其對(duì)應(yīng)的13C同位素為內(nèi)標(biāo),克拉霉素以其13C和D代同位素為內(nèi)標(biāo),土霉素以四環(huán)素-D6為內(nèi)標(biāo),貝西沙星、甲?；h(huán)丙沙星、8-氟代加替沙星、去甲基氧氟沙星以氧氟沙星-D3為內(nèi)標(biāo),磺胺對(duì)甲氧嘧啶以磺胺甲嘧啶-D4為內(nèi)標(biāo),4-(間甲苯氨基)吡啶-3-磺胺以磺胺甲噁唑-13C6為內(nèi)標(biāo),頭孢克洛和氨芐西林以頭孢噻呋-D3為內(nèi)標(biāo);其余25種目標(biāo)物均以其對(duì)應(yīng)的D代同位素為內(nèi)標(biāo)。

表2 39種目標(biāo)物及同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

表3 梯度洗脫程序

1.5 數(shù)據(jù)分析

將研究對(duì)象按性別、年齡和體重等級(jí)分組,計(jì)算目標(biāo)物的檢出率。采用皮爾森卡方檢驗(yàn)對(duì)目標(biāo)物檢出率與性別、年齡和體重等級(jí)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。在調(diào)整了混雜因素后,采用Logistic回歸模型來評(píng)估目標(biāo)物檢出率與不同組別間的相關(guān)性,并計(jì)算比值比(OR)。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用統(tǒng)計(jì)軟件包R(version 4.0.5),概率值(p)<0.050定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

采用1.4.2節(jié)方法對(duì)35種抗生素和4種β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(x)、峰面積之比為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,39種目標(biāo)物在0.02～10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,且相關(guān)系數(shù)均>0.997。向空白尿樣中加入低濃度(10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度)標(biāo)準(zhǔn)品,配制成7個(gè)平行的加標(biāo)樣品,采用上述分析方法進(jìn)行測(cè)定。以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限(MDL)、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法定量限(MQL)。39種目標(biāo)物的MDL和MQL分別為0.01～0.18 ng/mL和0.02～0.60 ng/mL。在實(shí)際尿液樣品中分別添加低(0.5 ng/mL)、中(2 ng/mL)、高(5 ng/mL)3個(gè)水平的39種目標(biāo)物,并對(duì)加標(biāo)回收率和日內(nèi)、日間精密度進(jìn)行考察。結(jié)果表明,39種目標(biāo)物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率分別為83.2%～120.8%、86.2%～119.6%和86.9%～117.8%,日內(nèi)精密度和日間精密度分別為2.0%～7.9%(n=6)和2.5%～8.9%(n=6)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本文所建立的方法能夠滿足青少年尿液中35種抗生素和4種β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)要求。

2.2 青少年體內(nèi)抗生素和β-受體激動(dòng)劑的檢出率

尿液檢測(cè)結(jié)果以采用尿肌酐校正后的含量(ng/g)來表示,結(jié)果如表4所示。442名青少年中有397名青少年的體內(nèi)至少檢出一種抗生素或β-受體激動(dòng)劑;39種目標(biāo)物中共有29種目標(biāo)物被檢出,檢出率為0.2%～59.0%。四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類抗生素的檢出率均大于10%,檢出率分別為81.9%、42.3%、21.0%、15.8%;四環(huán)素類抗生素中檢出率最高的是強(qiáng)力霉素(59.0%),其次是土霉素(56.1%)和四環(huán)素(32.8%);大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中檢出率最高的是阿奇霉素(34.6%);磺胺類抗生素中檢出率最高的是甲氧芐啶(12.2%);喹諾酮類抗生素檢出率最高的是氧氟沙星(10.0%),其他抗生素的檢出率均小于10.0%。替米考星、培氟沙星、洛美沙星、8-氟代加替沙星、磺胺甲嘧啶、磺胺林、頭孢噻呋和喹烯酮共8種抗生素在所有樣品中均未檢出。在7類抗生素中,四環(huán)素類抗生素的檢出率和檢出含量最高,表明四環(huán)素類抗生素是青少年體內(nèi)的首要抗生素種類。Lyu等[16]發(fā)現(xiàn),四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素是我國(guó)于土壤中發(fā)現(xiàn)的主要抗生素,磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素是我國(guó)于地表水中發(fā)現(xiàn)的主要抗生素。結(jié)合本研究中青少年尿樣的檢測(cè)結(jié)果可以說明,四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和喹諾酮類抗生素廣泛存在于環(huán)境中,并且會(huì)通過某些途徑進(jìn)入人體。

β-受體激動(dòng)劑在青少年尿液中的檢出率較低,總體檢出率為2.7%。442名青少年中僅有5人檢出特布他林(1.1%)、7人檢出克倫特羅(1.6%);沙丁胺醇和萊克多巴胺在所有研究對(duì)象中均未檢出。一份關(guān)于我國(guó)β-受體激動(dòng)劑使用情況的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),盡管克倫特羅和萊克多巴胺已被禁止使用,但二者仍在城市污水中被檢出,表明我國(guó)仍存在此類藥物的使用現(xiàn)象[17]。結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),β-受體激動(dòng)劑能通過各種途徑進(jìn)入人體。

對(duì)39種目標(biāo)物進(jìn)行混合暴露分析可以發(fā)現(xiàn),同時(shí)暴露于兩種或兩種以上目標(biāo)物的調(diào)查對(duì)象占總?cè)藬?shù)的55.6%;其中四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素復(fù)合暴露的檢出率最高(36.9%)。在同種類抗生素中,強(qiáng)力霉素和土霉素復(fù)合暴露的檢出率最高(36.4%);在不同種類抗生素中,阿奇霉素和強(qiáng)力霉素復(fù)合暴露的檢出率最高(19.2%)。

表4 研究對(duì)象中35種抗生素和4種β-受體激動(dòng)劑的檢出率和檢出含量

表4 (續(xù))

2.3 性別、年齡、BMI與抗生素暴露的關(guān)系

將研究對(duì)象按性別、年齡和BMI等級(jí)分組,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,不同組別中各類目標(biāo)物的檢出率如圖1所示。按性別分組,男性青少年中39種目標(biāo)物的總體檢出率為92.4%,女性青少年的總體檢出率為87.4%;其中,男性青少年體內(nèi)大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素的檢出率均高于女性;由皮爾森卡方檢驗(yàn)結(jié)果可知,四環(huán)素類抗生素的檢出率在男女性別間存在顯著差異(p=0.004)。Ben等[11]發(fā)現(xiàn)食物中的抗生素是我國(guó)人群體內(nèi)抗生素暴露的主要來源。有研究[18]表明,男性青少年對(duì)食物的攝入量一般高于女性,由此推測(cè),食品暴露可能是導(dǎo)致不同性別青少年體內(nèi)抗生素檢出率不同的原因之一。將研究對(duì)象按年齡分成4組(11、12、13、14～15歲),采用皮爾森卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出率在不同年齡分組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.010)。將研究對(duì)象按肥胖程度分成4組(體重過輕、正常體重、超重和肥胖),并采用皮爾森卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出率在不同肥胖等級(jí)分組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.003);隨著肥胖程度的增加,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出率也逐漸增加。有研究[19]推測(cè),長(zhǎng)期、低劑量的抗生素暴露會(huì)對(duì)人體腸道微生物菌群造成破壞,使得新陳代謝活動(dòng)低下、脂肪含量增加,從而導(dǎo)致肥胖。本研究也進(jìn)一步表明,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素暴露可能是導(dǎo)致青少年肥胖的一個(gè)因素。

采用多因素Logistic回歸模型對(duì)影響大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素檢出率的因素進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。在調(diào)整了年齡和BMI因素后,四環(huán)素類抗生素與性別間的相關(guān)性依舊存在,在男性青少年中四環(huán)素類抗生素的檢出風(fēng)險(xiǎn)是女性的2.17倍;在調(diào)整了性別和BMI因素后,與11歲組別相比,其他年齡組中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出風(fēng)險(xiǎn)更高,其中12、13歲年齡組的檢出風(fēng)險(xiǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.010和p=0.004);在調(diào)整了性別和年齡因素后,與正常體重組相比,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在肥胖組中的檢出風(fēng)險(xiǎn)最高(OR=2.35,p=0.002),且隨體重等級(jí)的增加而增大。

圖 1 不同(a)性別、(b)年齡和(c)BMI等級(jí)分組中抗生素和β-受體激動(dòng)劑的檢出率Fig. 1 Detection rates of antibiotics and β-receptor agonists in groups of different (a) genders, (b) ages, and (c) BMI grades* 0.010≤p<0.050; ** p<0.010.

2.4 暴露來源初步分析

人體內(nèi)抗生素和β-受體激動(dòng)劑的直接來源包括臨床用藥和自我用藥,而其間接來源途徑較為復(fù)雜,各種介質(zhì)中的抗生素和β-受體激動(dòng)劑都有可能通過飲食、飲水、呼吸和皮膚接觸等途徑進(jìn)入人體。因此,人體內(nèi)抗生素和β-受體激動(dòng)劑的暴露來源解析難度較大。本研究根據(jù)抗生素和β-受體激動(dòng)劑目前的主要用途來初步推斷其可能的暴露來源。

按抗生素用途分類,442名青少年中PVAs的檢出率最高(85.1%),其次依次為HAs(41.0%)、VAs(12.0%)和PHVs(7.2%)。PVAs如四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類抗生素具有價(jià)格低廉和抗菌譜寬等特點(diǎn),在畜牧養(yǎng)殖中能夠加速幼崽生長(zhǎng)、縮短飼養(yǎng)周期、增加經(jīng)濟(jì)效益。PVAs被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖,我國(guó)多地外環(huán)境或食物中也因此頻繁檢出此類物質(zhì),本研究中檢出率最高的強(qiáng)力霉素和土霉素是養(yǎng)殖場(chǎng)廣泛使用的四環(huán)素類抗生素。還有研究[20]發(fā)現(xiàn),葉菜對(duì)土壤中的強(qiáng)力霉素具有吸附和富集作用。本研究發(fā)現(xiàn),青少年體內(nèi)強(qiáng)力霉素和土霉素的檢出率最高,但二者在體內(nèi)的含量卻不高(75分位含量分別為0.1 ng/g和0.6 ng/g),由此推斷食物暴露可能是青少年體內(nèi)強(qiáng)力霉素和土霉素的主要來源。阿奇霉素、克拉霉素和羅紅霉素僅用作HVs,因此在尿液中檢測(cè)到的此類抗生素可能主要來源于臨床使用或自我用藥;但在本研究中,阿奇霉素的檢出率高達(dá)34.6%,不排除存在阿奇霉素違法用于養(yǎng)殖的可能,已有研究[21,22]在雞肉和魚腸道內(nèi)檢出阿奇霉素。

β-受體激動(dòng)劑已被禁止用于動(dòng)物飼養(yǎng),并被列為安全監(jiān)督和常規(guī)監(jiān)測(cè)的目標(biāo)物質(zhì)[23]。青少年體內(nèi)的β-受體激動(dòng)劑主要來源于食物和環(huán)境暴露,本研究中β-受體激動(dòng)劑的檢出率僅為2.7%,表明我國(guó)對(duì)β-受體激動(dòng)劑的管控較好,青少年經(jīng)食物和環(huán)境暴露β-受體激動(dòng)劑的風(fēng)險(xiǎn)較小。

3 結(jié)論

本研究采用同位素稀釋-高通量全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了青少年體內(nèi)35種抗生素和4種β-受體激動(dòng)劑的暴露水平,并初步了解到,青少年普遍受到低濃度抗生素暴露的影響,且不同性別、年齡和BMI等級(jí)分組中青少年的暴露風(fēng)險(xiǎn)不同。優(yōu)先獸用抗生素是青少年體內(nèi)的主要抗生素種類,而β-受體激動(dòng)劑對(duì)青少年的暴露風(fēng)險(xiǎn)較小。本研究也存在不足之處,實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)山東省某地區(qū)的青少年展開調(diào)查,無法代表全國(guó)青少年抗生素和β-受體激動(dòng)劑的整體暴露水平,且本研究屬于橫斷面調(diào)查,不能反映抗生素和β-受體激動(dòng)劑長(zhǎng)期、低劑量暴露對(duì)人體健康的影響。