王適雨 謝雪鋒 陳 剛△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 2泌尿外科 上海 201508）

前列腺癌是男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅男性身體健康［1］。早期局限性前列腺癌可通過(guò)根治性切除術(shù)得到較好的療效，而進(jìn)展期前列腺癌一般行雄激素剝奪治療［2］，但是多數(shù)行雄激素剝奪治療的進(jìn)展期前列腺癌患者會(huì)逐漸發(fā)展至去勢(shì)抵抗階段［3］，此時(shí)患者會(huì)面臨很高的死亡風(fēng)險(xiǎn)［2］。因此，有必要尋找影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的新的靶點(diǎn)。

核不均一核糖核蛋白F（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins F，HNRNPF）是HNRNP 蛋白家族的成員之一，其可以與核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）結(jié)合，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可以影響hnRNA 的剪接和修飾、mRNA 的成熟和穩(wěn)定性以及mRNA 的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程［4］。HNRNPF 在人體各器官組織中廣泛表達(dá)，且在前列腺中的表達(dá)非常豐富［5］。已有多項(xiàng)研究報(bào)道HNRNPF 在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)［6-7］，提示HNRNPF可能是一個(gè)重要的原癌基因。目前HNRNPF 在前列腺癌中的表達(dá)特征和生物學(xué)功能尚不明確。

本研究首先對(duì)HNRNPF 在前列腺癌中的表達(dá)特征及其與前列腺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，然后通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探究其對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3 和DU145 的增殖、遷移和侵襲能力的影響。本研究有助于提高對(duì)于HNRNPF在前列腺癌中作用的認(rèn)識(shí)，有望為探索新的前列腺癌診療靶點(diǎn)提供幫助。

材 料 和 方 法

數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)集癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是一個(gè)收集了多種惡性腫瘤的患者臨床數(shù)據(jù)及相應(yīng)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫(kù)［8］，本研究分析了HNRNPF 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的前列腺癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)特征、免疫浸潤(rùn)特征和臨床相關(guān)性?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）是一個(gè)儲(chǔ)存高通量芯片或測(cè)序數(shù)據(jù)集的公共數(shù)據(jù)庫(kù)［9］，本研究分析了HNRNPF 在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的6 個(gè)前列腺癌數(shù)據(jù)集（GSE35988、GSE46602、GSE60329、GSE69223、GSE70770、GSE114740）中的表達(dá)特征。

細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145 和人胚胎腎細(xì)胞HEK293T 采購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。PC-3 細(xì)胞使用DME/F12 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司），DU145 和HEK293T 細(xì)胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）和1%青霉素-鏈霉素溶液，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃恒溫、5%CO2、潮濕的環(huán)境中。

質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染靶向HNRNPF mRNA 的shRNA 序列如下（5’-3’）：sh-HNRNPF1，AGCGACCGAGAACGACATTTACTCGAGTAAATGTCGTTCTCGGTCGCTTTTTT；sh-HNRNPF2，TGGATCAGAAGATGATGTAAACTCGAGTTTACATCATCTTCTGATCCATTTTT。以無(wú)意義shRNA 為對(duì)照：shNC，TTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT。 將上述序列克隆至載體質(zhì)粒pLKO.1-Puro 中，與輔助質(zhì)粒pMD2.G 和pSPAX2共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞中，收集病毒上清液感染前列腺癌細(xì)胞PC-3 和DU145，使用2 μg/mL 的嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。

RNA 提取和實(shí)時(shí)定量PCR使用RNA 快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）提取細(xì)胞中的總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix（日本Takara 公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用BeyoFast SYBR Green qPCR Mix（2×，High ROX，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以β-actin 為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。本研究所用引物序列如下（5’-3’）：HNRNPF，ACTGCCAGGAGGTACATTGG（正向）/CTGAGGTCTCTCCCGAACAG（反向）；β-actin，CATGTACGTTGCTATCCAGGC（正向）/CTCCTTAATGTCACGCACGAT（反向）。

Western blot 實(shí)驗(yàn)使用10%的SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到經(jīng)甲醇激活的PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司）上，使用5%的脫脂牛奶封閉PVDF 膜30 min，使用HNRNPF 和GAPDH（美國(guó)Proteintech 公司）一抗在 4 ℃下孵育過(guò)夜，使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖曲線參考Hanniford等［10］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)步驟完成。將前列腺癌細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔的密度鋪至96 孔板中，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h 后，用4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞，然后使用1%結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，洗滌后使用分光光度計(jì)檢測(cè)595 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，繪制吸光度隨培養(yǎng)時(shí)間變化的曲線；EdU 實(shí)驗(yàn)使用Alexa Fluor 555 EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）完成，使用倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）進(jìn)行拍攝；集落形成實(shí)驗(yàn)：將前列腺癌細(xì)胞以1 000 個(gè)/孔的密度鋪至6 孔板中培養(yǎng)14天，使用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，使用1%結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell 實(shí)驗(yàn)：在Transwell 上層小室中加入4 萬(wàn)個(gè)（DU145）或8 萬(wàn)個(gè)（PC-3）細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，體積統(tǒng)一為100 μL。在下層小室中加入500 μL 含有20%胎牛血清的DMEM 或DME/F12 培養(yǎng)基。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h（DU145）或48 h（PC-3）后，使用4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞，使用1%結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，洗滌后使用棉簽擦掉上層小室中的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移至下層小室的情況。在每個(gè)Transwell 上層小室中加入100 μL 用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至250 μg/mL 的Matrigel 基質(zhì)膠，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜。次日吸棄小室內(nèi)仍然呈液態(tài)的基質(zhì)膠后，可見(jiàn)小室底面內(nèi)側(cè)覆蓋了一層凝固的基質(zhì)膠。使用這種經(jīng)過(guò)處理的小室進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)即可檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：將前列腺癌細(xì)胞鋪入6 孔板中培養(yǎng)至100%匯合度，使用200 μL 移液器槍頭在細(xì)胞中劃出等寬的劃痕，然后將完全培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，在劃痕后0、24、48 h 觀察劃痕寬度的變化情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用R（v.3.6.3）或GraphPad Prism（v.8.0.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布）或Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)（數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布）進(jìn)行2 組樣本間的比較檢驗(yàn)，使用單因素方差分析進(jìn)行3 組樣本間的比較檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

HNRNPF 在前列腺癌中高表達(dá)本研究分析了GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的6 個(gè)前列腺癌數(shù)據(jù)集（表1），在這些數(shù)據(jù)集中，HNRNPF 在前列腺癌標(biāo)本中的表達(dá)均顯著高于正常前列腺組織（圖1A～F）。對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中配對(duì)的前列腺癌樣本數(shù)據(jù)的分析顯示，HNRNPF 在前列腺癌標(biāo)本中的表達(dá)顯著高于正常前列腺組織（圖1G）。

圖1 HNRNPF mRNA 在GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)集中的前列腺癌和正常前列腺癌標(biāo)本中的表達(dá)Fig 1 The expression of HNRNPF mRNA in prostate cancer and normal prostate tissues in GEO and TCGA datasets

表1 本研究納入的GEO 數(shù)據(jù)集信息Tab 1 Details of GEO datasets included in this study

HNRNPF 與前列腺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性臨床相關(guān)性分析基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌患者的臨床信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)完成。首先使用Logistic 回歸法分析，結(jié)果顯示HNRNPF表達(dá)量更高的患者具有更高的T 分期（P=0.006）和Gleason 評(píng)分（P=0.019），與年齡、N 分期、M 分期和前列腺特異性抗原（prostate specific antigen， PSA）水平的關(guān)聯(lián)不顯著（表2）。當(dāng)以不同的臨床病理特征對(duì)患者進(jìn)行分組，比較具有不同特征患者的前列腺癌標(biāo)本中HNRNPF 表達(dá)量的差異時(shí)，結(jié)果顯示T分期、PSA 水平、Gleason 評(píng)分更高的患者，其前列腺癌標(biāo)本中HNRNPF 的表達(dá)量顯著升高（圖2A～C）。，HNRNPF 表達(dá)量更高的患者，其總生存期和疾病特異性生存期均較短（圖2D～E）。

圖2 HNRNPF mRNA 表達(dá)量與前列腺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性Fig 2 Relationship between HNRNPF mRNA expression and clinicopathologic characteristics in prostate cancer

表2 HNRNPF 與前列腺癌患者臨床病理特征之間的Logistic 回歸分析Tab 2 Logistic regression of HNRNPF expression and clinicopathological characteristics in prostate cancer

HNRNPF 的表達(dá)量與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)免疫浸潤(rùn)分析基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)數(shù)據(jù)完成。分析結(jié)果顯示HNRNPF 的表達(dá)量與多數(shù)類型的免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)（圖3A），其中與漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）（圖3B、F）和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞（圖3C、G）的負(fù)相關(guān)程度最為顯著。另一方面，HNRNPF 的表達(dá)量與2 型輔助型T（T helper 2，Th2）細(xì)胞（圖3D、H）和中央記憶型T（central memory T，Tcm）細(xì)胞（圖3E、I）呈較為顯著的正相關(guān)。

圖3 HNRNPF mRNA 表達(dá)量與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系Fig 3 Relationship between HNRNPF mRNA expression and immune infiltration in the tumor microenvironment

沉默HNRNPF 基因可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖能力首先使用RNA 干擾法在前列腺癌細(xì)胞系PC-3 和DU145 中成功敲低HNRNPF mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)量（圖4A～C）。細(xì)胞增殖曲線顯示沉默HNRNPF后，前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著降低（圖4D～E）。EdU 實(shí)驗(yàn)顯示，沉默HNRNPF后，EdU 陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著下降（圖4F～I(xiàn)），這表明固定細(xì)胞時(shí)正處于分裂增殖狀態(tài)的前列腺癌細(xì)胞比例下降，證明前列腺癌細(xì)胞增殖能力受損。此外，HNRNPF被沉默后，前列腺癌細(xì)胞形成的單克隆集落的數(shù)量和大小均下降（圖4J～L），這反映了細(xì)胞定植能力和定植后的增殖速度均下降。

圖4 沉默HNRNPF 抑制前列腺癌細(xì)胞增殖Fig 4 HNRNPF silencing inhibits prostate cancer cell proliferation

沉默HNRNPF 基因可抑制前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力Transwell 實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默HNRNPF后，前列腺癌細(xì)胞穿過(guò)小孔遷移/侵襲至下層小室的數(shù)量顯著下降（圖5A、B、E、F）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默HNRNPF后，前列腺癌細(xì)胞想劃痕中線遷移的速度顯著降低（圖5C、D、G、H）

圖5 沉默HNRNPF 抑制前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲Fig 5 HNRNPF silencing inhibits prostate cancer cell migration and invasion

討 論

HNRNP 蛋白家族在hnRNA 的剪接、成熟、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［17］。也有文獻(xiàn)報(bào)道HNRNP 可以影響circRNA 和lncRNA 的形成［18-19］。已有多個(gè)HNRNP 蛋白家族成員被報(bào)道具有促癌作用，例如HNRNPA1 可促進(jìn)肺癌和乳腺癌的進(jìn)展［20-21］；HNRNPA2/B1 對(duì)多個(gè)癌癥細(xì)胞系的增殖能力有影響［22］；HNRNPL 可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖［19］。

HNRNPF 已被報(bào)道與直腸癌、膀胱癌、甲狀腺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6，23-24］，但目前其在前列腺癌中扮演的角色尚無(wú)相關(guān)研究，有研究報(bào)道HNRNPF 在前列腺組織中的表達(dá)非常豐富［5］，這提示我們HNRNPF 可能對(duì)保持前列腺的正常生理功能非常重要，其表達(dá)異?？赡軙?huì)與前列腺疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)前列腺癌數(shù)據(jù)集中，HNRNPF 在前列腺癌組織中的表達(dá)量均顯著高于癌旁，且癌組織中HNRNPF 的表達(dá)量更高的患者其癌癥分期更高、預(yù)后更差。而沉默前列腺癌細(xì)胞中的HNRNPF之后，前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均有顯著下降，但這其中的作用機(jī)制尚待研究。

RNA 選擇性剪接是真核細(xì)胞中廣泛存在的生物學(xué)過(guò)程［25］，這一過(guò)程的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致多種疾?。?6］。HNRNPF 是一個(gè)重要的選擇性剪接調(diào)節(jié)因子，有文獻(xiàn)報(bào)道HNRNPF 可通過(guò)其3’末端修飾功能促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲［23］。還有文獻(xiàn)報(bào)道HNRNPF 在癌癥中可以調(diào)節(jié)RNA G-四鏈體介導(dǎo)的RNA 翻譯和RNA 剪接［27］。Montero-Conde等［24］通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)沉默HNRNPF后，細(xì)胞中出現(xiàn)174 項(xiàng)剪接異常，這些異常會(huì)影響RTK/RAS/MAPK 和PI3K/AKT/MTOR 等多個(gè)癌癥相關(guān)信號(hào)通路。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫微環(huán)境對(duì)前列腺癌發(fā)生發(fā)展也具有重要影響［28］。本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPF 的表達(dá)量與前列腺癌腫瘤微環(huán)境中pDC 和NK 細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，與Tcm 和Th2 細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。pDC 可以分泌大量Ⅰ型干擾素，促進(jìn)抗腫瘤免疫［29］；NK 細(xì)胞可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞并增強(qiáng)抗體和T 細(xì)胞的抗腫瘤功能［30］。pDC 和NK 細(xì)胞的缺失已被報(bào)道與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［31-32］。Tcm 是原始T 細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后產(chǎn)生的記憶細(xì)胞，其本身不直接發(fā)揮功能，而是當(dāng)其再次接受相同抗原刺激后轉(zhuǎn)化為效應(yīng)記憶T（effector memory T，Tem）細(xì)胞發(fā)揮功能［33］。Th2 細(xì)胞主要在2 型免疫途徑中發(fā)揮輔助作用，提高抗體的產(chǎn)生以應(yīng)對(duì)外源性病原體［34］。目前未見(jiàn)Tcm 和Th2 細(xì)胞與癌癥直接相關(guān)的報(bào)道。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPF 在前列腺癌中呈高表達(dá)，高表達(dá)HNRNPF 的患者具有更高的癌癥分期和更短的生存期，在前列腺癌細(xì)胞中沉默HNRNPF可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。本研究提示HNRNPF 能夠促進(jìn)前列腺癌的惡性進(jìn)展，顯著的臨床相關(guān)性使其具有成為前列腺癌診斷或預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物的潛力。

作者貢獻(xiàn)聲明王適雨 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和執(zhí)行，數(shù)據(jù)整理和分析，論文撰寫(xiě)和修訂。謝雪鋒 數(shù)據(jù)整理和分析。陳剛 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和指導(dǎo)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明沒(méi)有利益沖突。