陽 鴻 鄧亞東 丁春華 許寶紅 呂 釗 肖調(diào)義

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 長沙 410128)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國“四大家魚”之一, 年產(chǎn)量居淡水養(yǎng)殖品種之首。然而, 草魚常因感染草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)而患草魚出血病, 死亡率可達(dá)90%[1], 給我國草魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。盡管近年來在草魚出血病致病機(jī)理解析、疫苗研制、中草藥開發(fā)等方面取得了重要進(jìn)展[2,3], 但目前仍沒有穩(wěn)定防控草魚出血病的策略。研究發(fā)現(xiàn)不同地域草魚群體的免疫機(jī)能存在差異[4], 不同個(gè)體應(yīng)對GCRV的抗性存在差異[5], 基于自然界存在的GCRV抗性草魚群體開展分子輔助選育獲得高抗性草魚品系是解決草魚出血病難題的有效途徑之一。

魚類抗病性狀由多基因決定, 因此挖掘關(guān)鍵抗性基因及遺傳標(biāo)記對高抗性品系分子輔助選育具有重要意義[6]。關(guān)于草魚GCRV抗性基因及分子標(biāo)記的研究已有報(bào)道, 以往研究結(jié)果揭露草魚補(bǔ)體、模式識別受體、干擾素及干擾刺激因子等免疫基因[5,7—10]在抗GCRV感染中發(fā)揮重要作用, 其中Toll樣受體8基因、黑色素瘤分化相關(guān)基因5、視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ、抗黏液病毒基因等存在與GCRV抗性關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記[11—14]。但由于這些研究比較分散, 僅局限在單個(gè)基因, 目前仍難以確認(rèn)草魚關(guān)鍵的GCRV抗性基因。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步及草魚全基因組序列的破譯[15], 利用組學(xué)系統(tǒng)地挖掘草魚抗性基因成為重要的研究方向。Xu等[16]通過比較GCRV感染前后的草魚脾臟轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn), 差異表達(dá)基因主要注釋為補(bǔ)體凝血級聯(lián)及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子互作等先天性免疫通路相關(guān)的基因。Li等[17]通過比較分析易感染GCRV的一齡草魚和不易感染GCRV的三齡草魚脾臟轉(zhuǎn)錄組, 篩選到差異表達(dá)基因9450個(gè), 主要富集在補(bǔ)體凝血級聯(lián)、TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等免疫相關(guān)的通路。此外, 本團(tuán)隊(duì)前期對GCRV感染前后草魚頭腎進(jìn)行了miRNA測序分析, 共篩選到118個(gè)差異miRNAs, 這些 miRNAs的靶基因達(dá)數(shù)千個(gè), 主要富集在肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)以及趨化因子與趨化因子受體等信號通路[18]。轉(zhuǎn)錄組測序分析系統(tǒng)評價(jià)了草魚GCRV抗性的分子基礎(chǔ), 而缺點(diǎn)是篩選到的抗性基因過多, 判別關(guān)鍵抗性基因具有難度。

蛋白質(zhì)是生命活動的主要執(zhí)行者, 蛋白質(zhì)組比轉(zhuǎn)錄組可以更直接、真實(shí)地反映生物表型變化。目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在人類和動植物疾病標(biāo)志物篩選及農(nóng)業(yè)生物抗病品系培育等研究中得到廣泛應(yīng)用, 利用疾病抗性/易感群體開展蛋白質(zhì)組分析篩選到了人類抑郁癥[19]、家蠶核型多角體病[20]和小麥赤霉病[21]等疾病的抗性/易感關(guān)鍵基因, 而對魚類相關(guān)研究的報(bào)道還較少。動物血清是疾病檢測中最常用的樣本, 血清蛋白參與機(jī)體免疫、凝血/抗凝血、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的生理過程, 血清蛋白在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變可反映機(jī)體的生理或病理狀況[22,23]。通過血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析疾病抗性/易感動物群體的血清蛋白表達(dá)差異有利于挖掘關(guān)鍵的抗性基因[20,21]。團(tuán)隊(duì)前期利用大規(guī)模群體感染的方式獲得了候選GCRV抗性草魚材料, 本研究將應(yīng)用4D label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù), 系統(tǒng)比較候選抗性草魚材料與對照草魚血清蛋白表達(dá)的差異, 解析抗性相關(guān)的關(guān)鍵分子組成,旨在豐富草魚GCRV抗性分子基礎(chǔ)的理論研究, 為高抗性草魚選育及分子設(shè)計(jì)育種工作提供可參考的信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草魚來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園魚類繁育基地, 候選抗性草魚材料為團(tuán)隊(duì)前期利用GCRV感染篩選的存活群體, 將未經(jīng)感染的健康草魚作為對照組。隨機(jī)選取規(guī)格為14—17 cm的候選抗性組草魚與對照組草魚各30尾, 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)10尾草魚。采樣前在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)28℃暫養(yǎng)7d, 隨后進(jìn)行尾靜脈采血, 4℃靜置過夜后吸取上清,分別混合抗性組與對照組草魚各重復(fù)10尾草魚的血清并保存于-80℃冰箱備用。

1.2 蛋白樣品檢測及酶解

利用BCA試劑盒(Thermo Fisher, 美國)對草魚血清進(jìn)行蛋白濃度測定, 同時(shí)使用SDS-PAGE凝膠電泳檢測血清樣品中蛋白的完整性。隨后取各樣品等量蛋白進(jìn)行還原, 即加入終濃度為5 mmol/L的二硫蘇糖醇, 置于56℃孵育30min。之后加入終濃度為11 mmol/L的碘乙酰胺, 室溫避光孵育15min進(jìn)行烷基化。將烷基化好的樣品轉(zhuǎn)移至超濾管, 室溫12000×g離心20min, 接著用8 mol/L尿素溶液置換3次, 用置換溶液置換尿素3次, 然后以1∶50的比例(蛋白質(zhì)與蛋白酶比例)加入胰蛋白酶, 酶解過夜。室溫12000×g離心10min回收酶解肽段, 接著用超純水清洗回收肽段1次, 合并兩次收集的肽段溶液, 待質(zhì)譜分析。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

肽段溶液用液相色譜流動相A相溶解后, 采用EASY-nLC1200超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液; 流動相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置為:0—96min, 4%—20% B; 96—112min, 20%—32% B;112—116min, 32%—80% B; 116—120min, 80% B,流速維持在500 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離, 然后在Orbitrap Exploris?480儀器進(jìn)行質(zhì)譜分析。離子源電壓設(shè)置為2.3 kV, FAIMS補(bǔ)償電壓設(shè)置為-70和-45 V之間交替, 肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測和分析。一級質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為400—1200 m/z, 掃描分辨率設(shè)置為60000; 二級質(zhì)譜掃描范圍固定起點(diǎn)為110 m/z, 二級掃描分辨率設(shè)置為30000, Turbo TMT設(shè)置為Off。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描程序, 即在一級掃描后選擇信號強(qiáng)度最高的前15肽段母離子依次進(jìn)入HCD碰撞池, 使用27%的碎裂能量進(jìn)行碎裂, 同樣依次進(jìn)行二級質(zhì)譜分析。為了提高質(zhì)譜的有效利用率, 自動增益控制設(shè)置為75%, 信號閾值設(shè)置為1E4 ions/s, 最大注入時(shí)間設(shè)置為100ms, 串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30s以避免母離子的重復(fù)掃描。

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對鑒定及定量

使用軟件Proteome Discoverer (v2.4.1.15)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)在已有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和檢索。檢索參數(shù)設(shè)置: 數(shù)據(jù)庫設(shè)置為斑馬魚蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù), 于Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫下載獲得, 添加反庫計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽性率(FDR); 酶切方式設(shè)置為Trypsin(Full); 漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2; 肽段最小長度設(shè)置為6個(gè)氨基酸殘基; 肽段最大修飾數(shù)設(shè)為3; 一級母離子質(zhì)量誤差容忍度設(shè)為10 ppm, 二級碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.02 Da。將Carbamidomethyl (C)設(shè)置為固定修飾, 將Oxidation (M)、Acetyl (N-terminus)、Met-loss (M)、Met-loss+acetyl (M)和Deamidated(N, Q)設(shè)置為可變修飾。將蛋白、肽段和PSM鑒定的FDR都設(shè)置為1%。依據(jù)Proteome Discoverer軟件計(jì)算的LFQ intensity值, 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化得出蛋白在不同樣本中的相對定量值。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

質(zhì)譜下機(jī)的數(shù)據(jù), 在完成數(shù)據(jù)庫比對后, 對其進(jìn)行一系列質(zhì)控評價(jià), 包括肽段長度分布、肽段數(shù)分布、蛋白覆蓋度分布和蛋白分子量分布。在進(jìn)行蛋白定量之后, 采用皮爾森相關(guān)性(Pearson’s Correlation Coefficient, PCC)統(tǒng)計(jì)分析方法評估樣品間的重復(fù)性。

1.6 差異表達(dá)蛋白篩選及功能注釋與富集

依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平, 當(dāng)兩組樣品蛋白平均表達(dá)量差異倍數(shù)Fold change≥1.2或＜0.83且經(jīng)t檢驗(yàn)P＜0.05時(shí), 視為差異表達(dá)蛋白。為揭示差異表達(dá)蛋白的功能屬性, 利用Wolfpsort在線工具(https://wolfpsort.hgc.jp)獲得差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位信息。利用DAVID在線工具(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)獲得差異表達(dá)蛋白的功能注釋信息, 并進(jìn)行GO、KEGG及蛋白結(jié)構(gòu)域的富集分析,使用Fisher精確檢驗(yàn)確定富集途徑的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO、KEGG及蛋白結(jié)構(gòu)域富集途徑的P值經(jīng)過Bonferroni、Holm、Sidak和錯誤發(fā)現(xiàn)率校正后≤0.05則被認(rèn)為顯著富集。

1.7 血清C3和IgM蛋白免疫印跡(Western Blot)分析

將候選抗性和對照草魚血清用PBS稀釋10倍后進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。接著, 使用快速封閉液(碧云天生物科技, 中國)與PVDF膜于室溫孵育15min。封閉完成后, 于4℃搖床過夜孵育一抗(1∶1000稀釋), 所用草魚C3 (Accession: AAQ74974)抗體為團(tuán)隊(duì)前期制備的兔源多克隆抗體, 草魚IgM抗體為鼠單克隆抗體, 由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)聶品研究員贈送[24]。翌日, 用PBS洗膜3次, 每次10min; 隨后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000稀釋),室溫孵育1h。使用PBS洗膜3次后, 暗室中滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物混合液, 使用Bio-Rad凝膠成像儀對PVDF膜上的條帶拍照。采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析, 結(jié)合SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn), 分析差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE分析候選抗性草魚與對照草魚血清蛋白樣品

為檢測草魚血清樣品中蛋白的完整性, 并初步觀察候選抗性草魚與對照草魚血清蛋白組成及表達(dá)差異, 將血清蛋白濃度調(diào)整一致后進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳分析。結(jié)果顯示, 6個(gè)血清樣品蛋白條帶清晰, 無拖尾現(xiàn)象, 說明蛋白完整度高, 可滿足后續(xù)質(zhì)譜鑒定需求。組內(nèi)重復(fù)各泳道平行性較好,組間各泳道蛋白條帶分布、灰度存在差異, 表明候選抗性草魚與對照草魚血清蛋白的組成及表達(dá)水平存在差異(圖1)。

圖1 候選抗性草魚與對照草魚血清蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of serum proteins from the candidate resistant grass carps and the control grass carps

2.2 候選抗性草魚與對照草魚的血清蛋白質(zhì)組測定

利用質(zhì)譜技術(shù)從兩組草魚血清蛋白中共獲得524548張二級譜圖; 繼而通過比對斑馬魚蛋白數(shù)據(jù)庫共匹配到30829張有效譜圖, 基于譜圖共鑒定到2239條肽段, 其中蛋白特異性肽段2022條, 共鑒定到858個(gè)蛋白(圖2A)。其中792個(gè)蛋白在候選抗性組中被定量, 815個(gè)蛋白在對照組中被定量, 784個(gè)蛋白在兩個(gè)組中均被定量(圖2A)。依據(jù)LFQ intensity值對蛋白進(jìn)行定量后, 采用皮爾森相關(guān)性(Pearson’s Correlation Coefficient, PCC)分析方法評估樣品間的重復(fù)性, 發(fā)現(xiàn)候選抗性組樣品與對照組樣品的關(guān)系界線明確, 證明組間結(jié)果存在差異; 組內(nèi)樣品間的皮爾森相關(guān)系數(shù)均大于99.8%, 說明組內(nèi)重復(fù)的結(jié)果一致性高(圖2B)。

在肽段長度分布上, 大部分肽段分布在7—20個(gè)氨基酸, 符合基于酶解和質(zhì)譜碎裂方式的一般規(guī)律, 質(zhì)譜鑒定到的肽段長度的分布符合質(zhì)控要求(圖2C)。在蛋白分子量分布上, 所鑒定蛋白處于不同分子量階段, 且分布均勻(圖2D)。在肽段的數(shù)量分布上, 大部分蛋白對應(yīng)兩個(gè)以上肽段, 代表定量結(jié)果的精確性和可信性較高(圖2E)。在蛋白覆蓋度上, 大部分蛋白的覆蓋度在30%以下, 說明實(shí)驗(yàn)對血清高豐度蛋白的去除效果較好(圖2F)。質(zhì)譜下機(jī)數(shù)據(jù)的綜合質(zhì)控評價(jià)結(jié)果良好, 可用于下一步分析。

2.3 候選抗性草魚與對照草魚的血清蛋白質(zhì)組比較分析

差異表達(dá)蛋白篩選本研究以火山圖形式顯示了候選抗性草魚與對照草魚血清蛋白差異表達(dá)情況, 候選抗性草魚與對照草魚血清中共篩選到329個(gè)差異表達(dá)蛋白(差異倍數(shù)大于1.2倍); 其中163個(gè)蛋白在候選抗性草魚血清中顯著高表達(dá),166個(gè)蛋白顯著低表達(dá)(圖3)。

差異表達(dá)蛋白的功能分類為分析329個(gè)差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能, 對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了COG功能分類以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測。COG功能分類結(jié)果顯示, 差異表達(dá)蛋白中有169個(gè)蛋白的功能可歸類為細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 32個(gè)蛋白的功能歸類為信息儲存與處理, 66個(gè)蛋白的功能歸類為代謝, 17個(gè)蛋白的功能未知。這些蛋白的功能具體主要涉及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞骨架等(圖4A)。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn), 此次實(shí)驗(yàn)鑒定到的差異表達(dá)蛋白大部分為細(xì)胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞外蛋白,占比66.57%; 其中細(xì)胞質(zhì)蛋白有118個(gè), 細(xì)胞外蛋白有99個(gè)(圖4B)。

差異表達(dá)蛋白的功能富集為進(jìn)一步明晰差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能, 利用Fisher氏精確雙端檢測方法對差異蛋白進(jìn)行GO、KEGG及Domain富集分析。圖5A列出了P＜0.05的所有GO條目, 差異表達(dá)蛋白主要富集到生物過程(BP)中的體液免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)(Regulation of humoral immune response)和補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)(Regulation of complement activation)等條目, 細(xì)胞組分(CC)中的細(xì)胞外空間(Extracellular space)和細(xì)胞外區(qū)域(Extracellular region)等條目及分子功能(MF)中的絲氨酸蛋白酶活性(Serine hydrolase activity)和絲氨酸型肽酶活性(Serine-type peptidase activity)等條目。

圖5 差異表達(dá)蛋白的GO、KEGG及Domain富集分析Fig.5 GO, KEGG and Domain enrichment analysis of differentially expressed proteins

KEGG富集分析顯示, 差異表達(dá)蛋白主要富集在補(bǔ)體凝血級聯(lián)(Complement and coagulation cascades)、細(xì)胞黏附分子(Cell adhesion molecules)、膽固醇代謝(Cholesterol metabolism)和鐵死亡(Ferroptosis)等免疫與代謝相關(guān)信號通路(圖5B)。

Domain富集分析表明, 差異表達(dá)蛋白顯著富集的結(jié)構(gòu)域有三環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(Kringle domain)和補(bǔ)體分子C3、C4、C5共有的羧基端結(jié)構(gòu)域(UNC-6/NTR/C345C module; 圖5C)。三環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(Kringle domain)在調(diào)節(jié)蛋白水解活性中起重要作用, 具有三環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的蛋白主要有凝血酶原、纖維蛋白溶解酶原、載脂蛋白和凝血因子等。UNC-6/NTR/C345C module與金屬鋅蛋白家族的鋅金屬蛋白酶的抑制有關(guān), 存在于C3、C4、C5等補(bǔ)體分子中。

2.4 候選抗性草魚與對照草魚差異表達(dá)的免疫相關(guān)蛋白分析

魚類主要依靠免疫系統(tǒng)抵御病原, 部分免疫基因與魚類抗病力密切關(guān)聯(lián), 因此本研究對顯著差異表達(dá)的免疫相關(guān)蛋白進(jìn)行了重點(diǎn)分析。結(jié)果顯示,在候選抗性/對照草魚組間差異表達(dá)的329個(gè)蛋白中, 總共有118個(gè)蛋白與先天性或適應(yīng)性免疫過程相關(guān); 其中59個(gè)蛋白在候選抗性草魚血清中顯著高表達(dá), 59個(gè)蛋白顯著低表達(dá)。

先天性免疫分子先天性免疫分子主要包括補(bǔ)體、細(xì)胞因子、抗菌肽及酶類物質(zhì)等。本研究發(fā)現(xiàn), 候選抗性草魚血清中甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2 (MASP2)、補(bǔ)體組分4 (C4)、補(bǔ)體組分4b (C4b)、補(bǔ)體組分7b (C7b)、補(bǔ)體組分8b (C8b)、補(bǔ)體組分9 (C9)、補(bǔ)體I因子(CFI)、補(bǔ)體組分3a (C3a.1、C3a.2、C3a.3、C3a.6)等補(bǔ)體分子的蛋白表達(dá)水平顯著高于對照草魚。此外, 候選抗性草魚血清中細(xì)胞因子受體如白介素6受體(IL6ST)、白介素11受體(EBI3)、介導(dǎo)粒細(xì)胞微生物識別及吞噬的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子(CD66), 以及具有抗氧化功能的超氧化物歧化酶(SOD2)和α1微球蛋白(AMBP)等免疫分子的蛋白表達(dá)水平也顯著高于對照草魚(圖6)。

適應(yīng)性免疫分子適應(yīng)性免疫發(fā)揮作用的核心組分主要包括主要組織相容性復(fù)合體(MHC)、T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體和免疫球蛋白等。本研究結(jié)果顯示, 候選抗性草魚血清中Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體分子(MHC1UBA)及免疫球蛋白輕鏈分子(IGL4V8)等蛋白表達(dá)水平顯著高于對照草魚, 而T細(xì)胞受體(TRAV)及免疫球蛋白重鏈分子(IGHV1-1、IGHV2-1、IGHV6-1、IGHV3-2、IGHV11-2)等蛋白表達(dá)水平顯著低于對照草魚(圖6)。

2.5 候選抗性與對照草魚血清補(bǔ)體C3與IgM蛋白表達(dá)量分析

利用Western Blot檢測分析先天性免疫代表分子補(bǔ)體C3及適應(yīng)性免疫代表分子IgM在候選抗性草魚與對照草魚血清中表達(dá)水平的差異, 發(fā)現(xiàn)Western Blot檢測結(jié)果與定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致,分別證實(shí)了候選抗性草魚血清中C3蛋白的表達(dá)量顯著高于對照草魚, 為對照草魚的2.46倍; 候選抗性草魚血清中IgM蛋白的表達(dá)量也顯著高于對照草魚, 為對照草魚的1.71倍(圖7)。

圖7 Western blot分析候選抗性及對照草魚血清C3及IgM表達(dá)差異Fig.7 Western Blot analysis of serum C3 and IgM from the resistant grass carps and the control grass carps

3 討論

近年來我國在魚類抗病選育工作中取得了一系列進(jìn)展, Li等[25]采用哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)連續(xù)感染的方法, 經(jīng)多代篩選獲得了抗病力強(qiáng)的半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)國審新品種“鰨優(yōu)1號”。Zhu等[26]采用類似方法對羅非魚(Oreochromis mossambicus)開展抗無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)病選育, 培育了抗病力強(qiáng)、養(yǎng)殖成活率高的“壯羅1號”羅非魚。這些研究表明, 通過人工感染篩選具有抗性性狀的個(gè)體或群體, 經(jīng)過多次選優(yōu)去劣, 可獲得抗性性狀的新品種; 其原理是利用抗性篩選不斷富集優(yōu)良基因的頻率、淘汰不利的基因頻率, 優(yōu)良基因的富集會導(dǎo)致這些基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA及編碼的蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的變化,最終反映為相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。Zhu等[26]發(fā)現(xiàn)羅非魚無乳鏈球菌病抗性家系肝臟超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和溶菌酶表達(dá)量顯著高于易感家系。王紅權(quán)等[27]發(fā)現(xiàn)GCRV感染后存活草魚血清溶菌酶、超氧化物歧化酶、免疫球蛋白及干擾素表達(dá)水平顯著高于對照草魚。因而, 深入分析抗性魚類的蛋白表達(dá)譜有助于揭示魚類抗病的分子或遺傳基礎(chǔ)。

血清中部分關(guān)鍵蛋白的含量(水平)可以作為標(biāo)志表征著多種疾病的發(fā)生發(fā)展?fàn)顟B(tài)及易感程度。但血清蛋白組成特殊, 由少數(shù)幾種高豐度蛋白占據(jù)血清總蛋白的99%以上, 這嚴(yán)重影響常規(guī)質(zhì)譜方法分析血清低豐度蛋白的效果。4D蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)在3D質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上增加了第四維度即離子淌度(Mobility), 提高了血清樣本蛋白質(zhì)組的檢測深度[28]。與3D非標(biāo)質(zhì)譜及iTRAQ等同位素標(biāo)記質(zhì)譜分別鑒定到326種鯉(Cyprinus carpio)和513種紅大馬哈魚(Oncorhynchus nerka)血清蛋白相比[29,30],本研究應(yīng)用4D label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從草魚血清中鑒定到858個(gè)蛋白, 其中784個(gè)蛋白被順利定量, 提高了血清蛋白的鑒定深度, 以便下一步更準(zhǔn)確地挖掘草魚抗性分子基礎(chǔ)。

本研究鑒定到候選抗性草魚與對照草魚血清中顯著差異表達(dá)的蛋白329個(gè), 這些差異表達(dá)蛋白主要與體液免疫反應(yīng)與補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)相關(guān), 可能參與補(bǔ)體凝血級聯(lián)、細(xì)胞黏附、鐵死亡等免疫過程或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。候選抗性草魚血清中先天性免疫分子MASP2、C4和C4b等及適應(yīng)性免疫分子MHC1UBA、IGL4V8等分子蛋白表達(dá)水平顯著高于對照草魚, 而免疫球蛋白重鏈分子IGHV1-1、IGHV2-1及T細(xì)胞受體TRAV等分子蛋白表達(dá)水平則顯著低于對照草魚。這些結(jié)果表明候選抗性草魚與對照草魚血清的免疫蛋白水平具有顯著差異, 體現(xiàn)了免疫分子表達(dá)與草魚抗病力存在密切關(guān)聯(lián)。此外, 與前期報(bào)道利用轉(zhuǎn)錄組篩選鑒定草魚潛在抗性基因相比, 本研究通過蛋白質(zhì)組比較分析候選抗性草魚與對照草魚血清的蛋白表達(dá)差異, 同樣篩選到了眾多差異表達(dá)的免疫相關(guān)分子[9,16], 再次證實(shí)這些免疫分子在草魚抗GCRV感染中發(fā)揮重要作用。與轉(zhuǎn)錄組鑒定到草魚成千上萬潛在抗性基因不同的是, 本研究利用蛋白組篩選到的目標(biāo)分子更聚焦, 集中在部分關(guān)鍵的先天性免疫和適應(yīng)性免疫蛋白如組織蛋白酶D (CTSD)、主要組織相容性復(fù)合體(MHC1UBA)及癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子3(CD66)等蛋白, 它們在候選抗性草魚血清的蛋白表達(dá)水平分別是對照草魚的8.5、4.8及4.6倍, 這些結(jié)果對進(jìn)一步明確草魚抗性關(guān)鍵分子的基礎(chǔ)研究具有重要意義。

先天性免疫是魚類抵御病原入侵的第一道防線, 本研究結(jié)果揭示先天性免疫重要組分——補(bǔ)體系統(tǒng)的激活狀態(tài)可反映草魚的抗性水平。與高等脊椎動物相比, 魚類的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)演化不夠完善, 先天性免疫補(bǔ)體系統(tǒng)在魚類抵抗病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原入侵的過程中可能發(fā)揮更為重要的作用[7,31—33]。Xu等[16]基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), 草魚在感染GCRV后脾臟補(bǔ)體凝血級聯(lián)通路相關(guān)基因富集最為顯著。Xiong等[7]分析GCRV感染后草魚補(bǔ)體C3基因的甲基化與表達(dá)水平變化, 發(fā)現(xiàn)GCRV期間補(bǔ)體C3基因甲基化水平降低, 表達(dá)量顯著升高,證明草魚補(bǔ)體系統(tǒng)在機(jī)體抵抗GCRV感染的過程中具有極其關(guān)鍵的作用。Li等[17]通過比較易感GCRV的1齡草魚和不易感染的3齡草魚脾臟轉(zhuǎn)錄組觀察到3齡草魚的補(bǔ)體表達(dá)水平整體顯著高于1齡草魚。這些研究結(jié)果均表明草魚補(bǔ)體的表達(dá)水平可能與抗病能力相關(guān)聯(lián)。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心成分, 其介導(dǎo)補(bǔ)體經(jīng)典途徑、替代途徑、凝集素途徑的激活, 是補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)功能的關(guān)鍵分子, 也是所有補(bǔ)體成分中含量最高的蛋白。C3激活后裂解為C3a和C3b, 參與炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)理作用。研究發(fā)現(xiàn), 在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、斑馬魚(Danio rerio)和泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)等多種硬骨魚類中均存在多個(gè)補(bǔ)體C3基因[34—36],不同C3亞型的蛋白在特異性結(jié)合羥基或氨基的硫酯催化位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)位點(diǎn)上有所差異[36], 它們的溶血活性及與各種天然靶標(biāo)的結(jié)合特異性亦不同[37], 提示不同C3亞型具有不同的識別功能。最近的研究發(fā)現(xiàn), 草魚擁有9個(gè)C3基因, 其中C3.1(AAQ74974)表達(dá)最為廣泛[38]。本研究借助質(zhì)譜技術(shù)在候選抗性草魚血清中發(fā)現(xiàn)4種C3a蛋白亞型表達(dá)水平顯著高于對照草魚, 同時(shí)采用Western Blot檢測進(jìn)一步證實(shí), 補(bǔ)體C3.1蛋白在候選抗性草魚血清中的表達(dá)水平顯著高于對照草魚, 即候選抗性草魚具有更高的補(bǔ)體激活水平。

適應(yīng)性免疫是魚類抵御病原入侵的第二道防線, 包括B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫, 本研究結(jié)果還揭示體液免疫反應(yīng)水平可反映草魚的抗性水平。魚類作為最早出現(xiàn)的脊椎動物, 已具備介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的分子體系。例如, 魚類擁有結(jié)構(gòu)與功能與高等哺乳動物保守的T細(xì)胞受體, 其由α、β兩條鏈經(jīng)二硫鍵組成異源二聚體, 每條鏈有兩個(gè)功能區(qū), 即可變區(qū)和恒定區(qū)[39,40]。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)主要分為3類, 其中MHC Ⅰ類幾乎分布于所有細(xì)胞表面, 能結(jié)合并呈遞抗原給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)大菱鲆MHC Ⅰ類分子基因的多態(tài)性與遲緩愛德華氏菌抗性/易感性顯著相關(guān)[41]。魚類免疫球蛋白、B細(xì)胞受體的組成不同于高等哺乳動物, 主要包括IgM、IgD和IgT。它們由輕鏈和重鏈組成, 輕鏈、重鏈均包含一個(gè)可變區(qū)(V區(qū)); V區(qū)氨基酸序列的組成、排列隨免疫球蛋白結(jié)合抗原的不同而變化, 所以V區(qū)具有高度的多態(tài)性。本研究質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了候選抗性草魚血清中免疫球蛋白部分輕鏈可變區(qū)片段(IGL4V8)的高表達(dá)和部分重鏈可變區(qū)片段(IGHV1-1、IGHV2-1、IGHV6-1、IGHV3-2、IGHV11-2)的低表達(dá)。因?yàn)闊o法確證這些輕鏈、重鏈片段的組合關(guān)系, 該結(jié)果不能說明候選抗性草魚和對照草魚血清中IgM、IgD和IgT任意一種免疫球蛋白的表達(dá)趨勢或差異, 但是可見兩類草魚的免疫球蛋白可變區(qū)存在不同, 可能是由兩類草魚經(jīng)歷的病原史不一樣所導(dǎo)致, 相似結(jié)果在大鼠中亦有報(bào)道[42]。IgM是硬骨魚類中最早發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白, 也是硬骨魚類血清中表達(dá)量最高的免疫球蛋白, 具有激活補(bǔ)體、凝集作用和調(diào)理細(xì)胞毒作用等功能。早前已有研究報(bào)道, 草魚在GCRV感染后血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化[43], 脾臟IgM、MHC分子的mRNA表達(dá)發(fā)生上調(diào)[44], 提示了草魚適應(yīng)性免疫在抵抗GCRV入侵的過程中發(fā)揮重要作用。本研究質(zhì)譜分析結(jié)果顯示, 候選抗性草魚血清中MHC Ⅰ類分子MHC1UBA的蛋白表達(dá)水平顯著高于對照草魚,可能賦予其更高效的抗原識別與呈遞能力。值得注意的是, 本研究質(zhì)譜和Western Blot檢測分析還表明, 候選抗性草魚血清中IgM蛋白水平顯著高于對照草魚, 而T細(xì)胞受體TRAV蛋白水平顯著低于對照草魚, 該結(jié)果表征著候選抗性草魚在適應(yīng)性免疫層面可能擁有較高的體液免疫反應(yīng)水平和較低的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平, 這將有利于機(jī)體的免疫平衡。因此, 結(jié)合前述候選抗性草魚高表達(dá)C3等補(bǔ)體蛋白的結(jié)果, 我們推測以C3和IgM為代表的體液免疫分子表達(dá)水平與草魚抗病能力密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述, 本研究應(yīng)用4D Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 候選抗性草魚與對照草魚血清中免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)差異顯著, 主要表現(xiàn)為候選抗性草魚顯著高表達(dá)部分體液免疫和抗原提呈分子,而低表達(dá)T細(xì)胞免疫相關(guān)分子; 其中以C3和IgM為代表的體液免疫分子在候選抗性草魚血清中顯著高表達(dá), 可能與草魚抗病能力關(guān)聯(lián)。本研究將為高抗性草魚的選育提供可參考的分子資源。