王 燕,張 敏,朱曉艷,江玲麗,王如坤,鐘鶯鶯,譚 曜,保琦蓓*

(1.寧波海關(guān)技術(shù)中心,寧波 315012;2.南京海關(guān)危險貨物與包裝檢測中心,常州 213000;3.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,寧波 315100)

目前同位素稀釋-高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC-HRMS)被認為是二英類化合物檢測的金標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.205-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二英及其類似物毒性當(dāng)量的測定》),但是由于該方法檢測費用高、周期長等原因,限制了其在批量樣品檢測中的應(yīng)用,再加上設(shè)備昂貴也使得能開展此項檢測的實驗室較少。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,一些特異性強、靈敏度高、操作簡單且分析時間短的生物技術(shù),如酶聯(lián)免疫法(EIA)、酶活力誘導(dǎo)法(EROD)、化學(xué)激活熒光素酶表達基因法(CALUX)等被用于快速篩查樣品中二英類化合物。CALUX是基于二英類化合物產(chǎn)生的毒性作用需要與機體細胞核內(nèi)的二英反應(yīng)增強子結(jié)合,誘導(dǎo)機體內(nèi)特異基因表達而構(gòu)建CALUX系統(tǒng),根據(jù)系統(tǒng)合成的熒光素量、熒光強度與系統(tǒng)中二英類化合物濃度水平的關(guān)系來評估其毒性[1]。CALUX作為美國國家環(huán)境保護局(EPA)批準(zhǔn)的一種生物檢測方法[SW 846-4435MethodforToxicEquivalents(TEQS)DeterminationforDioxin-LikeChemicalActivitywiththeCALUXBioassay],被應(yīng)用于大量環(huán)境樣品中的二英類污染物的篩查。目前也有很多將CALUX應(yīng)用于土壤、水、煙氣、污泥、飼料、添加劑以及生物組織中二英類化合物快速篩查的研究[2-8]。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

XPE205型電子天平;ASE350型加速溶劑萃取儀;Thermo DFS型高分辨氣質(zhì)聯(lián)用儀;UV-1800型紫外-可見分光光度計;KA RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;MD 200型氮吹儀;MCO-18AC型二氧化碳培養(yǎng)箱;CKKX53型顯微鏡;SW-CJ-1FD型生物安全柜;Centro XS3 IB960型化學(xué)發(fā)光讀板機。

17種PCDD/Fs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：2,3,7,8-TCDD、2,3,7,8-四氯代二苯并呋喃(2,3,7,8-TCDF)的質(zhì)量濃度為0.5,2.0,10,40,200 ng·mL-1,1,2,3,7,8-五氯代二苯并對二英(1,2,3,7,8-PeCDD)、1,2,3,7,8-五氯代二苯并呋喃(1,2,3,7,8-PeCDF)、2,3,4,7,8-五氯代二苯并呋喃(2,3,4,7,8-PeCDF)、1,2,3,4,7,8-六氯代二苯并對二英(1,2,3,4,7,8-HxCDD)、1,2,3,6,7,8-六氯代二苯并對二英(1,2,3,6,7,8-HxCDD)、1,2,3,7,8,9-六氯代二苯并對二英(1,2,3,7,8,9-HxCDD)、1,2,3,4,7,8-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,7,8-HxCDF)、1,2,3,6,7,8-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,6,7,8-HxCDF)、1,2,3,7,8,9-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,7,8,9-HxCDF)、2,3,4,6,7,8-六氯代二苯并呋喃(2,3,4,6,7,8-HxCDF)、1,2,3,4,6,7,8-七氯代二苯并對二英(1,2,3,4,6,7,8-HpCDD)、1,2,3,4,6,7,8-七氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,6,7,8-HpCDF)、1,2,3,4,7,8,9-七氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,7,8,9-HpCDF)的質(zhì)量濃度為2.5,10,50,200,1 000 ng·mL-1,八氯代二苯并對二英(OCDD)、八氯代二苯并呋喃(OCDF)的質(zhì)量濃度為5.0,20,100,400,2 000 ng·mL-1,溶劑為壬烷。

同位素標(biāo)記的混合內(nèi)標(biāo)溶液：13C標(biāo)記的17種PCDD/Fs,質(zhì)量濃度均為100 ng·mL-1。

回收率內(nèi)標(biāo)溶液：13C-1,2,3,4-TCDD和13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD的質(zhì)量濃度均為200 ng·mL-1。

正己烷、甲苯、二氯甲烷、甲醇、壬烷均為色譜純。

從超市收集24份城市居民日常消費的動物源性固態(tài)食品,包括肉類9份(牛肉、豬肉、雞肉各3份),海鮮類9份(鯽魚、鱸魚、魷魚各3份,去除內(nèi)臟,取帶皮可食肉質(zhì)部分),配方乳粉6份,樣品處理前先將其均質(zhì)化并冷凍干燥成粉末,于-20 ℃儲存。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);不分流進樣;載氣流量1.0 mL·min-1;進樣口溫度280 ℃,傳輸線溫度310 ℃。柱升溫程序：初始溫度140 ℃,保持1 min;以20 ℃·min-1速率升溫至200 ℃,保持1 min;以5 ℃·min-1速率升溫至220 ℃,保持16 min;以5 ℃·min-1速率升溫至235 ℃,保持7 min;以5 ℃·min-1速率升溫至310 ℃,保持10 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源,離子源能量45 eV,離子源溫度260 ℃;接口溫度270 ℃;以全氟煤油(PFK)為質(zhì)量校正物質(zhì),質(zhì)譜分辨率大于10 000;選擇離子監(jiān)測模式檢測。其他質(zhì)譜參數(shù)參考GB 5009.205-2013附錄C中的表C.3。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取與凈化

將1片乙酸纖維素膜放入萃取池底部,加入約10 g硅藻土,填充均勻后加入4～5 g樣品,再在樣品上部加入少量硅藻土并留出部分間隙,然后加入10 μL同位素標(biāo)記的混合內(nèi)標(biāo)溶液(CALUX測定時不加)和1片乙酸纖維素膜,蓋上蓋子,以體積比1…1的二氯甲烷-正己烷的混合溶液為萃取劑,在150 ℃和10.3 MPa條件下萃取10 min(循環(huán)1次),然后將萃取液轉(zhuǎn)移至已稱重的500 mL平底燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,稱重,計算脂肪含量。按照上述同樣的方法再處理一份4～5 g樣品,將萃取液和洗滌液(用體積比1…1的二氯甲烷-正己烷的混合溶液洗壁3次)一起轉(zhuǎn)移至15 mL玻璃離心管中(約12 mL)。對于采用CALUX分析的樣品,將上述溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL,再用正己烷定容至1.0 mL,于-20 ℃保存,待測;對于采用HRGC-HRMS分析的樣品,將上述溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1.5 mL,氮吹至近干,加入20 μL壬烷和5 μL回收率內(nèi)標(biāo)溶液,振蕩均勻,待測。

1.3.2 樣品的測定

將保存用于CALUX分析的樣品恢復(fù)至室溫,然后氮吹至近干,加入2 mL DMSO復(fù)溶;分取10 μL,與100 μLα-MEM培養(yǎng)基混合,配制成樣品溶液。將細胞置于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和100 U·mL-1抗生素的α-MEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞以(3～4)×104個/孔的密度接種到96孔白底潔凈板中間的60個孔中,接種量為100 μL·孔-1。培養(yǎng)24 h后,向細胞中加入上述樣品溶液,平行加入3份;暴露24 h后,用細胞裂解緩沖液振蕩15 min結(jié)束細胞反應(yīng),在每個孔中加入50 μL熒光素酶試劑,再加入50 μL DMSO溶解并按照體積比1…1 000進行稀釋,使用化學(xué)發(fā)光讀板機測量溶液的相對光單位(RLU值)。

將用于HRGC-HRMS分析的樣品按照1.2節(jié)儀器工作條件進行測定。

1.4 毒性當(dāng)量的評估

基于HRGC-HRMS的毒性當(dāng)量結(jié)果以TEQ值表示,參考文獻[16]和2005年世界衛(wèi)生組織確定的毒性當(dāng)量因子(TEF)計算TEQ上、下限值。

基于CALUX的毒性當(dāng)量結(jié)果以BEQ值表示,通過2,3,7,8-TCDD的響應(yīng)曲線,利用擬合的四參數(shù)希爾方程計算得到樣品中2,3,7,8-TCDD的含量,即樣品的BEQ值。

2 結(jié)果與討論

2.1 HRGC-HRMS的測定結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照1.2節(jié)儀器工作條件測定17種PCDD/Fs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),目標(biāo)物與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,17種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0,相關(guān)性較好,滿足測定的要求。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)。結(jié)果顯示：2,3,7,8-TCDD和2,3,7,8-TCDF的檢出限為0.04 ng·kg-1,OCDD和OCDF的檢出限為0.40 ng·kg-1,其余13種目標(biāo)物的檢出限均為0.20 ng·kg-1。

2.1.2 樣品中17種PCDD/Fs的含量

采用HRGC-HRMS對收集的24份樣品進行測定,內(nèi)標(biāo)法定量,17種PCDD/Fs的中位值如圖1所示。

圖1 樣品中17種PCDD/Fs的含量Fig.1 Contents of 17 PCDD/Fs in the samples

結(jié)果表明：17種PCDD/Fs在肉類樣品中的總檢出量為0.43～1.07 pg·g-1,在海鮮類樣品中的總檢出量為0.09～2.21 pg·g-1,在配方乳粉樣品中的總檢出量為0.09～0.42 pg·g-1。由于PCDD/Fs主要為脂溶性化合物,容易積累于富含脂肪的食品中,而配方乳粉的主要成分為蛋白質(zhì),因此其中PCDD/Fs的含量較低。7種PCDDs在24份樣品中的平均檢出率為29%,10種PCDFs的平均檢出率為37%,二者差別不大;17種目標(biāo)物中1,2,3,4,6,7,8-HpCDF的檢出率最高,為63%,其次是2,3,4,6,7,8-HpCDF和OCDD,檢出率各為50%;1,2,3,4,7,8,9-HpCDF僅在2份樣品中有檢出,檢出率最低,為8%。

2.2 CALUX的測定結(jié)果

以DMSO稀釋2,3,7,8-TCDD標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制質(zhì)量濃度為48.94,1.472×102,4.411×102,1.327×103,3.961×103,1.191×104,3.574×104,1.000×105,3.000×105pg·L-1的2,3,7,8-TCDD標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的RLU值(y)與質(zhì)量濃度(x)對數(shù)的響應(yīng)曲線,結(jié)果如圖2所示。

圖2 2,3,7,8-TCDD的響應(yīng)曲線Fig.2 Response curve of 2,3,7,8-TCDD

使用origin軟件進行擬合,得到四參數(shù)希爾方程為y=1.437×105+2.497×106/[1+10(lg3.8-lgx)×9.9],相關(guān)系數(shù)為0.999 7。繪制3條曲線,計算各點RLU值的變異系數(shù)(CV)。結(jié)果顯示,當(dāng)2,3,7,8-TCDD質(zhì)量濃度為48.94～1.000×105pg·L-1時,每個點的CV值均低于20%。因此,將48.94～1.000×105pg·L-1作為該標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的線性范圍。若樣品中2,3,7,8-TCDD的計算結(jié)果高于線性范圍上限,需要對樣品進行稀釋后再檢測。

2.3 基于CALUX和HRGC-HRMS評估17種PCDD/Fs的毒性當(dāng)量

根據(jù)HRGC-HRMS和CALUX的測定結(jié)果,按照1.4節(jié)方法評估24份樣品中17種PCDD/Fs的毒性當(dāng)量,結(jié)果見表1;7種PCDDs和10種PCDFs的毒性當(dāng)量(TEQ上限值)貢獻率如圖3所示。

表1 樣品中17種PCDD/Fs的毒性當(dāng)量結(jié)果

圖3 樣品中PCDDs和PCDFs的毒性當(dāng)量貢獻率Fig.3 Toxic equivalent contribution rates of PCDDs and PCDFs in the samples

結(jié)果表明：HRGC-HRMS得到的樣品的TEQ下限值為0.001～0.106 pg·g-1,TEQ上限值為0.004～0.242 pg·g-1,遠低于歐盟法規(guī)EC 1881/2006中規(guī)定的限量值(3.5 pg·g-1);CALUX得到的肉類樣品的BEQ值為0.74～1.30 pg·g-1,海鮮類樣品的BEQ值為0.31～0.63 pg·g-1,配方乳粉樣品的BEQ值為0.043～0.074 pg·g-1。雖然目前有不少研究已經(jīng)將CALUX應(yīng)用于牛奶、肉類、蛋類、魚和魚油、海產(chǎn)品等食品和動物飼料中二英類物質(zhì)的檢測, 但是并沒有形成以CALUX為標(biāo)準(zhǔn)的限量值。從本工作試驗結(jié)果來看,3種動物源性固態(tài)食品的BEQ值均大于使用HRGC-HRMS測定得到的TEQ值,這也與其他研究結(jié)果類似[12,16]。CALUX測定的是樣品提取物中能與芳基烴受體(AhR)結(jié)合的化合物,這些化合物不僅包括二英、呋喃以及多氯聯(lián)苯等,也包括提取脂肪中的其他鹵代化合物,因此BEQ值與TEQ值相比存在差異。從PCDDs和PCFDs的毒性當(dāng)量(TEQ上限值)貢獻率來看,幾乎所有樣品中均以PCDDs占據(jù)主導(dǎo),其對PCDD/Fs總毒性當(dāng)量的平均貢獻率達到74.3%,而PCDFs的平均貢獻率僅為25.7%。

2.4 基于CALUX和HRGC-HRMS評估17種PCDD/Fs毒性當(dāng)量的相關(guān)性分析

為分析基于CALUX和HRGC-HRMS得到的毒性當(dāng)量結(jié)果之間的關(guān)系,繪制了TEQ值與BEQ/TEQ比值的函數(shù)關(guān)系,結(jié)果如圖4所示。

圖4 TEQ值與BEQ/TEQ比值的函數(shù)關(guān)系Fig.4 Functional relationship between TEQ value and BEQ/TEQ value ratio

由圖4可知：以TEQ下限值為計算依據(jù)時,對于較低的毒性當(dāng)量(TEQ下限值小于0.020 pg·g-1),BEQ/TEQ比值波動相對較大,對于較高的毒性當(dāng)量(TEQ下限值大于0.020 pg·g-1),BEQ/TEQ比值趨于穩(wěn)定;以TEQ上限值為計算依據(jù)時,BEQ/TEQ比值的波動范圍相對較小。

為進一步分析這兩種方法測定結(jié)果之間的關(guān)系,使CALUX能在動物源性固態(tài)食品中二英類化合物篩查中得以應(yīng)用,分別建立了肉類、海鮮類和配方乳粉中17種PCDD/Fs的BEQ值與TEQ值的關(guān)系曲線,結(jié)果如圖5所示。

圖5 樣品中17種PCDD/Fs的BEQ值與TEQ值的關(guān)系曲線Fig.5 Relation curves between BEQ and TEQ values of 17 PCDD/Fs in the samples

由圖5可知：3種類型的動物源性固態(tài)食品中17種PCDD/Fs的BEQ值與TEQ值之間存在一定的相關(guān)性,BEQ值與TEQ上限值的相關(guān)性均顯著高于BEQ值與TEQ下限值的;配方乳粉樣品的BEQ值與TEQ上限值的相關(guān)性最低(相關(guān)系數(shù)為0.475 1),海鮮類樣品的BEQ值與TEQ上限值的相關(guān)性較高(相關(guān)系數(shù)為0.907 4)。因此,在海鮮類樣品中,基于CALUX得到的BEQ值與基于HRGC-HRMS得到的TEQ上限值較接近,當(dāng)BEQ值大于0.50 pg·g-1時,可使用方程BEQ=3.989×TEQ(上限值)+0.195 4來對CALUX的毒性當(dāng)量結(jié)果進行換算,從而評價食品的風(fēng)險性;肉類和配方乳粉樣品的BEQ值與TEQ值相關(guān)性較差,不建議使用CALUX對這兩類動物源性固態(tài)食品的毒性當(dāng)量進行換算。

本工作基于CALUX和HRGC-HRMS評估了肉類、海鮮類與配方乳粉等3類動物源性固態(tài)食品中7種PCDDs和10種PCDFs的毒性當(dāng)量,并分析了二者之間的相關(guān)性。在后續(xù)研究中可以補充dl-PCBs的擬合分析,進一步完善CALUX快速篩查二英類化合物毒性當(dāng)量一致性的評估結(jié)果,并通過更大量的樣品數(shù)據(jù)進行驗證,以提高這種生物法測定結(jié)果的通用性與認可度。