馬亞軍,焦智慧,劉笑凝,陸翔羽,劉 濤,王 月,樸晨曦,王洪斌*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030; 2.黑龍江省普通高等學(xué)校動物普通疾病防治重點實驗室,哈爾濱 150030)

肝IRI是一種病理生理應(yīng)激狀態(tài),指的是肝的血液供應(yīng)被中斷,一定時間后重新恢復(fù)血供應(yīng)所引起的損傷。肝IRI發(fā)生后,低氧誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活并在肝中積聚,這些細(xì)胞通過旁分泌和自分泌方式分泌活性氧(reactive oxygen species, ROS)和炎性細(xì)胞因子來加劇肝IRI[1]。細(xì)胞焦亡是一種炎性相關(guān)的細(xì)胞死亡[2],與其他形式的細(xì)胞死亡不同,它是一種由NLRP3炎癥小體和caspase-1介導(dǎo)的溶解型細(xì)胞死亡。其特征在于質(zhì)膜被GSDMD透化,導(dǎo)致隨后釋放細(xì)胞內(nèi)容物[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎癥小體作為炎癥的關(guān)鍵介質(zhì),被組織損傷時細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的“危險”信號激活,從而快速啟動免疫反應(yīng)[5]。肝IRI期間,肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等受到損傷并釋放大量的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)[6-7]。近幾年,NLRP3炎癥小體已成為抗炎治療的新靶點,通過抑制NLRP3炎癥小體的激活和下調(diào)細(xì)胞焦亡能夠有效降低炎癥反應(yīng),改善損傷[8]。已有研究表明NLRP3炎癥小體的激活與肝IRI有著密切聯(lián)系[9]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種可以自我更新的祖細(xì)胞,可在特定條件下分化成各種細(xì)胞類型。MSCs來自不同來源的成體干細(xì)胞,包括骨髓、脂肪組織、臍帶、外周血,甚至腫瘤[10]。盡管存在許多MSCs來源,但可以被采取的組織量是有限的,且每次分離培養(yǎng)收獲的細(xì)胞量也相對較少。相比于其他MSCs,ADSCs可以通過非常微小的侵入性程序(例如吸脂術(shù))重復(fù)獲得,此獲取途徑具有低發(fā)病率和高產(chǎn)量的MSCs[11]。此外,ADSCs具有比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更強的細(xì)胞分裂能力且同樣具有很好的再生能力,可以分化成多種細(xì)胞,包括肝細(xì)胞,因此ADSCs在細(xì)胞治療和組織工程中具有更大潛力[10,12]。除此之外,ADSCs在抗炎和免疫調(diào)節(jié)方面也具有調(diào)節(jié)作用,目前已被發(fā)現(xiàn)在多種疾病治療中擁有很好的發(fā)展前景,尤其是免疫性疾病[13]。近些年,許多研究者用ADSCs對IRI的治療作用進行了大量研究,這里也包括很多ADSCs對肝IRI修復(fù)的研究[14-16]。為探究ADSCs對肝IRI損傷的修復(fù)機制,作者建立了小型豬肝IRI合并肝切除模型,研究ADSCs對細(xì)胞焦亡的調(diào)節(jié)作用,為ADSCs應(yīng)用到臨床提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

廣西巴馬小型豬:4～6月齡,重20～25 kg。所有動物均在相同且適宜的環(huán)境下飼養(yǎng),試驗前均經(jīng)過臨床和實驗室健康檢測。

1.2 試驗儀器與試劑

氣腹機、腹腔鏡器械、腹腔鏡(日本Olympus公司)、冷光源、高清內(nèi)窺鏡攝像系統(tǒng)(深圳市神州醫(yī)療設(shè)備有限公司)、實時熒光定量PCR儀(上海羅氏制藥有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)。

注射用丙泊酚(西安力邦制藥有限公司)、異氟烷(河北一品制藥有限公司)、胎牛血清(美國CLARK公司)、1%青鏈霉素,1%谷氨酰胺(Solarbio, China)、L-DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司)、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)、RNA抽提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)、β-actin抗體(Cell Signaling Technology),IL-1β抗體(ABmart),IL-18、Caspase1、NLRP3抗體(萬類生物),ASC、p-NF-κBp65抗體(Santa Cruz Biotechnology),GSDMD抗體(Affinity Biosciences),NF-κBp65抗體(Proteintech)。

1.3 ADSCs分離與培養(yǎng)

采集小型豬腹股溝處脂肪塊,經(jīng)PBS清洗,剔除血管、筋膜組織,剪碎,然后經(jīng)0.01%Ⅰ型膠原酶消化、終止、過濾、離心。最終將細(xì)胞沉淀重懸于配有10% FBS,1%青鏈霉素,1%谷氨酰胺的L-DMEM培養(yǎng)液中置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。ADSCs培養(yǎng)至第4代時進行流式鑒定以及誘導(dǎo)分化鑒定。小型豬ADSCs流式鑒定結(jié)果顯示,CD29、CD90和CD44陽性表達(>95%),CD34陰性(<2%),符合國際細(xì)胞治療學(xué)會的定義。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的體外分化培養(yǎng),ADSCs能夠分別分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞[17]。

1.4 手術(shù)流程

健康巴馬小型豬18頭被隨機分為Sham組、IRI組和ADSCs組,每組6頭豬。如前所述,應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)建立手術(shù)模型,進行左半肝切除,右半肝缺血60 min[18]。Sham組只建立氣腹,翻動肝葉;IRI組與ADSCs組進行上述手術(shù)操作,其中,IRI組和ADSCs組分別在術(shù)后即刻通過肝實質(zhì)注射生理鹽水和ADSCs(1×106·kg-1)。于術(shù)后1、3、7 d應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)進行肝組織樣本采集。

1.5 血清樣本分析

按照使用的試劑盒說明書對血清中的IL-1β和IL-18進行含量檢測。

1.6 Real-time PCR

根據(jù)制造商說明書提取肝總RNA。然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green 三步法實時熒光定量RT-qPCR檢測基因IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、capase1、GSDMD、NF-κBp65以及內(nèi)參β-actin的表達量。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性15 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán),最后進行熔解反應(yīng)。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequences

1.7 Western blot

向肝組織樣品中加入蛋白裂解液,使用組織勻漿機進行研磨,并在4 ℃下裂解30 min,最后經(jīng)離心(12 000 r·min-1,4 ℃,5 min)獲得含有組織總蛋白的上清液。應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。使用Buffer(5×)進行蛋白樣本處理。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光檢測樣本相應(yīng)目的蛋白相對表達量。經(jīng)檢測的目的蛋白包括:IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、capase1、GSDMD、NF-κBp65、p-NF-κB以及內(nèi)參β-actin,使用圖像處理應(yīng)用程序ImageJ對目的條帶進行分析。

1.8 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, USA)對所有數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)值均表示為“平均值±SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)”。各組之間的比較通過ANOVA(單向方差分析)進行評估。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs對肝IRI合并肝切除誘導(dǎo)的促炎因子分泌的影響

如圖1所示,術(shù)后1 d時,IRI組與sham組相比,血清中IL-18、IL-1β含量顯著增加(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs組與sham組相比,血清中IL-18、IL-1β含量顯著性增加(P<0.05或P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01或P<0.05);ADSCs組與IRI組相比,血清中的IL-18、IL-1β含量顯著性減少(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性降低(P<0.05或P<0.01)。術(shù)后3 d時,IRI組與sham組相比,血清中IL-18、IL-1β含量顯著性增加(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs組與sham組相比,血清中IL-1β含量顯著性增加(P<0.05),肝組織中IL-1β基因和IL-18蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs與IRI組相比,血清中的IL-18、IL-1β含量顯著性減少(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性降低(P<0.01)。術(shù)后7 d時,各組血清和肝組織IL-18、IL-1β表達量無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,肝IRI合并肝切除損傷能夠促進促炎因子IL-18、IL-1β分泌,而ADSCs的干預(yù)可有效抑制促炎因子的表達。相關(guān)機制研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡可促進炎性因子IL-18、IL-1β的成熟與釋放,因此本次研究進一步探究了ADSCs對肝IRI合并肝切除引起的組織細(xì)胞焦亡的影響。

2.2 ADSCs對肝IRI合并肝切除誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的影響

如圖2所示,術(shù)后1 d時,IRI組與sham組相比,細(xì)胞焦亡相關(guān)因子NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs組與sham組相比,基因NLRP3、ASC和Caspase-1轉(zhuǎn)錄水平顯著性升高(P<0.05),GSDMD無顯著性差異(P>0.05),蛋白ASC和Caspase-1呈顯著性升高(P<0.01),NLRP3和GSDMD無顯著變化(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因與NLRP3、ASC蛋白表達量顯著性降低(P<0.01),GSDMD蛋白表達顯著(P<0.05)降低。術(shù)后3 d時,IRI組與sham組相比,細(xì)胞焦亡相關(guān)因子NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01或P<0.05);ADSCs組與sham組相比,基因ASC、Caspase-1和GSDMD轉(zhuǎn)錄水平均顯著性升高(P<0.05),NLRP3無顯著變化(P>0.05),蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1表達水平均顯著性升高(P<0.01或P<0.05),GSDMD無顯著變化(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因和蛋白表達量均顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。術(shù)后7 d時,IRI組與sham組相比,細(xì)胞焦亡相關(guān)基因Caspase-1和GSDMD轉(zhuǎn)錄水平仍呈顯著性升高(P<0.01或P<0.05),細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白ASC和Caspase-1表達呈顯著性升高(P<0.01),其他因子均無顯著差異(P>0.05);ADSCs組與sham組無顯著差異(P>0.05)。ADSCs組與IRI組相比,基因GSDMD、蛋白ASC、Caspase-1顯著降低(P<0.05或P<0.01),基因NLRP3、ASC和蛋白NLRP3、GSDMD均無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,肝IRI合并肝切除激活了NLRP3炎癥小體,進一步促進GSDMD的切割,ADSCs可抑制NLRP3炎癥小體的激活,減少GSDMD的切割,降低NLRP3、ASC、caspase1和GSDMD的表達,抑制肝組織細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

A、B. 促炎因子血清學(xué)檢測結(jié)果;C、D. 促炎因子在肝組織中的基因檢測結(jié)果;E、F. 促炎因子在肝組織中的蛋白檢測結(jié)果。與sham組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;ADSCs與IRI組相比,*.P<0.05,**.P<0.01 A, B. Serological test results of pro-inflammatory factors; C, D. Genetic testing results of proinflammatory factors in liver tissue; E, F. Protein detection results of pro-inflammatory factors in liver tissue. Compared with the sham group, #.P<0.05, ##.P<0.01; ADSCs compared with the IRI group, *.P<0.05,**.P<0.01圖1 促炎因子分泌水平Fig.1 Pro-inflammatory factor secretion level

2.3 ADSCs對肝IRI合并肝切除中的炎癥調(diào)節(jié)因子NF-κB的影響

如圖3所示,術(shù)后1 d時,IRI組與sham組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性升高(P<0.01);ADSCs與sham組相比,NF-κBp65基因呈顯著性升高(P<0.05),p-NF-κBp65/NF-κBp65無顯著性差異(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。術(shù)后3 d時,IRI組與sham組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性升高(P<0.01);ADSCs與sham組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65無顯著性差異(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性降低(P<0.01)。術(shù)后7 d時,各組之間無顯著性差異。NF-κB作為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的主要因子,與NLRP3炎癥小體的激活密切相關(guān)。以上結(jié)果表明,肝IRI合并肝切除后,NF-κBp65相關(guān)基因與蛋白明顯增加,ADSCs干預(yù)后明顯抑制了NF-κBp65的表達。結(jié)合細(xì)胞焦亡相關(guān)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADSCs對于肝IRI合并肝切除引起的肝組織細(xì)胞焦亡的抑制作用可能與NF-κBp65信號通路相關(guān)。

(圖2續(xù) Continued)

A. NF-κB相關(guān)蛋白圖;B. p-NF-κB/NF-κB在肝組織中的蛋白表達結(jié)果;C. NF-κB在肝組織中的基因表達結(jié)果。與sham組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;ADSCs與IRI組相比,*.P<0.05,**.P<0.01 A. NF- κ B-related protein map; B. The protein expression results of P-NF-κB/NF-κB in liver tissue; C. The gene expression results of NF- κ B in liver tissue. Compared with the sham group, #.P<0.05, ##.P<0.01; ADSCs compared with the IRI group, *.P<0.05,**.P<0.01圖3 NF-κBp65基因與蛋白表達水平Fig.3 NF- κBp65 gene and protein expression levels

3 討 論

肝IRI是肝切除和肝移植手術(shù)不可避免的并發(fā)癥,對于術(shù)后肝功能障礙具有不利影響。目前,肝IRI的損傷機制涉及多個方面,包括微循環(huán)功能障礙、缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥等[19]。肝內(nèi)存有多種免疫細(xì)胞,肝損傷通常伴有強烈的炎癥反應(yīng),這是導(dǎo)致肝細(xì)胞大量死亡及肝損傷嚴(yán)重的重要因素[20]。作者之前的研究發(fā)現(xiàn),小型豬肝IRI合并肝切除術(shù)能夠引發(fā)嚴(yán)重炎癥反應(yīng),進一步造成肝損傷[21]。細(xì)胞焦亡是一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡模式,參與IRI的發(fā)生與發(fā)展[22-24]。焦亡發(fā)生時,NLRP3作為一種細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)能夠直接或通過ASC募集 caspase-1前體,從而形成蛋白復(fù)合體,即炎性體[25]。當(dāng)受到刺激時,這些炎性體誘導(dǎo)caspase-1活化,活化后的caspase-1能夠促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放。此外,激活的caspase-1導(dǎo)致GSDMD蛋白裂解并釋放其N端結(jié)構(gòu)域,后者聚合并在質(zhì)膜上形成孔,進而引發(fā)細(xì)胞炎性死亡。本研究發(fā)現(xiàn),小型豬肝IRI合并肝切除后,NLRP3炎癥小體被激活,caspase-1活化,GSDMD表達量增加,炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18大量釋放。

MSCs是一種具有再生潛力與免疫調(diào)節(jié)特性的基質(zhì)細(xì)胞,作為一種特殊的免疫調(diào)節(jié)物被廣泛應(yīng)用于多種炎癥相關(guān)疾病的治療研究[26-29]。在肝IRI小鼠模型中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡在肝損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[30]。Li等[31]發(fā)現(xiàn),肝巨噬細(xì)胞的焦亡是肝IRI損傷炎癥調(diào)節(jié)的重要機制。MSCs能夠表達多種趨化因子和黏附蛋白來募集免疫細(xì)胞并通過直接細(xì)胞接觸調(diào)節(jié)免疫,抑制炎癥反應(yīng)[32]。MSCs還能夠分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子,包括轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor beta,TGF-β)、肝再生增強因子(hepatocyte growth factor, HGF)、白介素10(interleukin-10, IL-10)、白介素1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)等[33]。對此,一項小鼠心肌梗塞模型的研究證明,MSCs通過旁分泌作用抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡,降低心肌梗塞引起的炎癥反應(yīng)[34]。作者以前的研究發(fā)現(xiàn),ADSCs能夠減輕肝IRI合并肝切除導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),促進肝再生[35]。為進一步探究ADSCs對小型豬肝IRI合并肝切除引起的細(xì)胞焦亡的影響,作者在術(shù)后對細(xì)胞焦亡相關(guān)基因和蛋白進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADSCs的干預(yù)后NLRP3炎癥體被抑制,炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18)釋放量顯著減少。

NF-κB形成一系列轉(zhuǎn)錄因子,在多種生理和病理過程中起重要作用。NF-κB家族有5個成員,p65(RelA)、RelB、c-Rel、p105/p50和p100/p52,所有這些都共享一個共同的氨基末端REL同源結(jié)構(gòu)域RHD[36]。核因子NF-κB作為一種炎癥和免疫穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,一直被認(rèn)為是新型抗炎藥物的重要靶點[37]。NF-κB 活化增加NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄[38],從而激活casapse-1并分離GSDMD的N端和C端以誘導(dǎo)焦亡[39]。因此,作者假設(shè)肝IRI誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化與細(xì)胞焦亡受NF-κB信號通路調(diào)節(jié)。針對這一假設(shè),作者對NF-κBp65相關(guān)蛋白與基因進行檢測發(fā)現(xiàn),與細(xì)胞焦亡結(jié)果基本一致,肝IRI損傷發(fā)生后,NF-κBp65的表達水平顯著升高,而ADSCs干預(yù)后,其表達被明顯抑制。上述結(jié)果表明,ADSCs可能通過NF-κB通路降低小型豬肝IRI合并肝切除誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

4 結(jié) 論

小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝切除術(shù)激活了NLRP3炎性體,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生,而ADSCs的干預(yù)能夠有效降低細(xì)胞焦亡損傷,減少焦亡相關(guān)炎性因子的釋放,且修復(fù)機制可能與炎癥重要調(diào)節(jié)因子NF-κB的抑制有關(guān)。