于家樂,李松濤,趙桂琴

(承德醫(yī)學院 中藥研究所 河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,河北 承德 067000)

臨床上常用的化療藥物對腫瘤組織細胞的選擇性差,導致患者出現(xiàn)脫發(fā)、白細胞減少、免疫力下降等一系列嚴重的毒副反應,限制了其在臨床上的應用[1-2]。因此,提高抗腫瘤藥物對腫瘤組織細胞的選擇性尤為必要。

受體介導的藥物靶向遞送是抗腫瘤藥物研究領域的重要方向之一。轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)可以與轉鐵蛋白特異性結合并介導后者的胞吞,其功能是參與維持機體鐵離子平衡和調節(jié)細胞生長[3-4]。研究表明,腫瘤細胞快速增殖對鐵離子的需求量增大,導致TfR在腦部腫瘤、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤細胞表面的表達量較正常細胞顯著提高[5],使得TfR成為抗腫瘤藥物靶向遞送的作用靶點[6]。

TfR親和肽(TfR binding peptide,TfRBP,肽序列：HAIYPRH)[7]與TfR的結合位點不同于轉鐵蛋白[8],其與TfR的結合活性不受內源性轉鐵蛋白的競爭性抑制,被認為是一種理想的TfR靶向配體。作者采用Fmoc固相合成法制備一種TfRBP氮末端連接半胱氨酸(Cys)的衍生物(肽序列：CHAIYPRH),以Cys的側鏈巰基作為活性反應位點偶聯(lián)抗腫瘤藥物,實現(xiàn)其作為TfR靶向給藥載體的功能,為進一步構建TfR靶向多肽-藥物偶聯(lián)物奠定基礎。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

2-氯三苯甲基氯(2-CTC)樹脂(取代度1.2 mmol·g-1),天津南開和成科技有限公司;N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-組氨酸[Fmoc-His(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-(N′-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?-L-精氨酸[Fmoc-Arg(Pbf)-OH]、N-芴甲氧羰基-L-脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸[Fmoc-Tyr(tBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-L-異亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸[Fmoc-Cys(Trt)-OH],成都新誠諾科技有限公司;甲醇、乙腈,色譜純;其它試劑均為市售分析純。

U3000型高效液相色譜儀,美國Thermo Fisher公司;安捷倫 6420型液質聯(lián)用儀,美國Agilent公司;Newstyle型反相半制備高效液相色譜儀,蘇州漢邦科技有限公司;CHRIST凍干機,北京博勵行儀器有限公司;L530型低速離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;Quintix124-1CN型分析天平,賽多利斯科學儀器北京有限公司;BUCHI R-300型旋轉蒸發(fā)儀,青島佳鼎分析儀器有限公司;MS-H280-Pro型數顯加熱磁力攪拌器,北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Fmoc-組氨酸-CTC樹脂的合成

將經N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶脹后的2-CTC樹脂(0.83 g,1 mmol)置于干燥的反應柱中,依次加入DMF(5 mL)、Fmoc-His(Trt)-OH(1.87 g,3 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(DIPEA,0.52 mL,3 mmol);室溫下氮氣鼓動反應2 h,抽濾,分別用DMF和二氯甲烷(DCM)洗滌3次;加入20 mL封閉液DCM-甲醇-DIPEA(80∶15∶5,體積比,下同),封閉2次,每次15 min;抽濾去除封閉液,分別用DMF和DCM洗滌3次,得到Fmoc-組氨酸-CTC樹脂。

1.2.2 TfRBP衍生物全保護肽樹脂的合成

向Fmoc-組氨酸-CTC樹脂中加入體積分數20%的哌啶/DMF溶液(15 mL)去Fmoc保護2次,抽濾,分別用DMF和DCM洗滌3次;茚三酮檢測呈藍色,表明組氨酸氨基上的Fmoc保護基團已被成功脫除;向脫除Fmoc保護的組氨酸-CTC樹脂中加入DMF(10 mL)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.95 g,3 mmol)、N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC,0.46 mL,3 mmol)和1-羥基苯并三唑(HOBt,0.41 g,3 mmol),室溫反應3 h;茚三酮檢測呈無色,表明氨基酸偶聯(lián)完成;抽濾,分別用DMF和DCM洗滌3次。重復上述脫Fmoc保護與氨基酸偶聯(lián)過程,將剩余氨基酸連接到樹脂上,得到TfRBP衍生物全保護肽樹脂,用甲醇收縮2次,真空減壓干燥后,備用。Fmoc保護氨基酸的用量見表1。

表1 Fmoc保護氨基酸的用量

1.2.3 TfRBP衍生物全保護肽樹脂的裂解

將TfRBP衍生物全保護肽樹脂置于干燥的反應容器中,加入20 mL裂解試劑三氟乙酸-1,2-乙二硫醇-水-三異丙基硅烷(94∶2.5∶2.5∶1),室溫反應2 h后抽濾;將濾液緩慢滴入冰乙醚(50 mL)中,離心后棄去上清液,沉淀用冰乙醚洗滌(20 mL×3),真空減壓干燥,得到TfRBP衍生物粗品。

1.2.4 TfRBP衍生物粗品的純化

采用半制備高效液相色譜法對TfRBP衍生物粗品進行純化。色譜條件：Hedera ODS-2反相半制備C18色譜柱(20 mm×250 mm,10 μm);流動相為0.2%醋酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫程序：0～30 min,10%B～30%B;30～30.1 min,30%B～10%B;30.1～40 min,10%B;流速10 mL·min-1;檢測波長215 nm。分段收集主峰,合并相同流分,用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮,冷凍干燥,得到0.41 g白色絮狀固體,即TfRBP衍生物純品。

2 結果與討論

2.1 HPLC分析

將TfRBP衍生物純品(1 mg)溶解于1 mL超純水中,經0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析。色譜條件[9]：Venusil ASB C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為0.1%三氟乙酸水溶液(A)-含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液(B),梯度洗脫程序：0～20 min,5%B～95%B;20～20.1 min,95%B～5%B;20.1～25 min,5%B;流速1 mL·min-1;檢測波長215 nm;柱溫35 ℃。TfRBP衍生物純品的HPLC圖譜見圖1。

圖1 TfRBP衍生物純品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectrum of pure TfRBP derivative

由圖1可知,主峰的保留時間為8.033 min,TfRBP衍生物純品的純度為97.9%(峰面積歸一化法),總收率為40.3%。

2.2 ESI-MS分析

TfRBP衍生物純品的ESI-MS圖譜見圖2。

圖2 TfRBP衍生物純品的ESI-MS圖譜Fig.2 ESI-MS spectrum of pure TfRBP derivative

由圖2可知,TfRBP衍生物純品的ESI-MS(m/z)數據：996.6 [M+H]+,其相對分子質量與理論值(997.1 [M+H]+)一致。

2.3 討論

在氨基酸偶聯(lián)過程中需加入過量的反應原料,原料濃度較高有利于正向反應的進行,可縮短氨基酸偶聯(lián)反應時間,提高氨基酸偶聯(lián)效率,使整個合成過程能夠快速、高效地進行。在Fmoc-組氨酸-CTC樹脂的合成過程中,需使用封閉液對樹脂進行封閉,這樣可以將樹脂上未能與組氨酸反應的活性位點進行填充,當加入下一種氨基酸時,其只能與組氨酸上脫去Fmoc保護的氨基反應,以保證全保護肽樹脂合成結束后所連接的首個氨基酸的正確性。

Fmoc固相合成法常用三氟乙酸進行切肽和脫除側鏈保護基團。在切割TfRBP衍生物全保護肽樹脂時,側鏈保護基團脫除后會釋放大量具有高反應活性的碳正離子,若這些離子沒有被及時吸附,就會與TfRBP衍生物的Tyr和Cys的親核性側鏈發(fā)生副反應[10]。為避免上述問題,在裂解過程中需添加清除劑以吸附碳正離子。其中含硫試劑1,2-乙二硫醇在裂解過程中對碳正離子具有極強的吸附能力,水是針對tBu、Trt、Pbf常用的捕獲劑,三異丙基硅烷可避免非芳香性氨基酸在裂解過程中發(fā)生副反應。因此,采用三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水和三異丙基硅烷組成的混合試劑對全保護肽樹脂進行裂解。

與液相多肽合成法相比,Fmoc固相合成法具有反應條件溫和、氨基酸保護基選擇多、合成方便、工作量小、易實現(xiàn)自動化、合成規(guī)模易放大等優(yōu)點,但也存在固相樹脂載體上的中間體雜肽無法及時分離、目標產物需采用反相高效液相色譜等方法進行純化等缺點。

3 結論

采用Fmoc固相合成法成功制備了TfRBP衍生物,其純品的HPLC純度為97.9%,總收率為40.3%,經ESI-MS鑒定其相對分子質量與理論值一致。該方法具有操作簡便、合成周期短、總收率高等優(yōu)點,為腫瘤靶向多肽類配體的制備提供了參考,也為進一步構建TfR靶向多肽-藥物偶聯(lián)物奠定了基礎。