俞超華 曾傲瓊

（1紹興市食品藥品檢驗研究院，浙江紹興 312000；2國家黃酒產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，浙江紹興 312000；3江南大學(xué)，江蘇無錫 214000）

近年來，α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor，α-AI）成為各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)，它屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種[1-2]。α-AI 能在一定程度上抑制胃腸道內(nèi)胰淀粉酶的活性，從而延緩小腸中碳水化合物的分解，起到降低血糖和血脂的作用，同時能夠改善腸道微生態(tài)和身體機(jī)能，在糖尿病患者的飲食治療中起到了積極的作用[3]（圖1）。α-AI 具有減少糖向脂肪轉(zhuǎn)化、延緩腸道排空速度和增加脂肪消耗的作用，在減輕肥胖患者體重方面表現(xiàn)出良好效果[4]。因此，α-AI 可作為有效的治療手段，用于預(yù)防和治療糖尿病、高血脂、脂肪過多癥以及肥胖癥等疾病。市場上標(biāo)注不同α-AI 活力相關(guān)的產(chǎn)品種類繁多[5]，其中從白蕓豆提取物中獲得α-AI 具有高效價及耐熱性。

圖1 α-淀粉酶抑制劑改善餐后高血糖的作用機(jī)理

目前，體外α-AI的篩選方法主要有3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法。3，5-二硝基水楊酸（DNS）法是指DNS會與還原糖中的游離羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成紅棕色化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸），在540 nm 波長下有最大的吸光度[6]。由于α-AI對淀粉的水解具有抑制作用，在使用3，5-二硝基水楊酸方法時，樣品的吸光度值變低，從而通過計算樣品中淀粉酶活性的抑制率來評估待測物對淀粉酶的抑制能力。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性較好，因此使用DNS試劑量化還原糖含量的方法已被廣泛應(yīng)用于測量蛋白、多糖和多酚[7-9]等化合物對α-淀粉酶活性的抑制作用。碘-淀粉顯色法是通過形成藍(lán)色或紫色的復(fù)合物來表示樣品中淀粉的含量，從而直觀地觀察到樣品中淀粉的水解程度，屬半定量方法，靈敏度低[10]。

本試驗采用3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法，對從白蕓豆提取物中的α-AI 活力進(jìn)行測定，并對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行對比，為α-AI抑制α-淀粉酶活性的研究提供可借鑒的試驗數(shù)據(jù)，為精準(zhǔn)控制產(chǎn)品質(zhì)量和指導(dǎo)生產(chǎn)過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

針對不同品類的白蕓豆α-AI 產(chǎn)品，共收集4種樣品。A：白蕓豆提取物（型號：Destarch-01；蘇州某公司，標(biāo)注α-AI 活力：30 000 U/g）；B：白蕓豆提取物（型號：amyless；蘇州某公司，標(biāo)注α-AI 活力：100 000 U/g）；C：白蕓豆提取物（型號：P40 型；云南某公司，標(biāo)注α-AI 活力：20 000 U/g）；D：白蕓豆提取物（型號：MIC 型；云南某公司，標(biāo)注α-AI 活力：10 000 U/g）。每個樣品至少4 份樣品（其中2 份用于2 種方法的檢測，另外2 份留樣），每份樣品不少于20 g。

α-淀粉酶（美國Sigma-Aldrich公司）；3，5-二硝基水楊酸、麥芽糖、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、氯化鈉、碘和碘化鉀等（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，瑞士梅特勒電子天平LE204E；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司HH-4；渦旋混合器，德國IKA VORTEX 3；手動單道可調(diào)式移液器，美國賽默飛世爾科技公司thermo scientific 100～1 000 μL；全波長酶標(biāo)儀，南京拜爾沃爾克智能科技有限公司Epoch。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗原理（1）3，5-二硝基水楊酸法。由于α-AI對淀粉水解產(chǎn)生的還原糖具有抑制作用，在進(jìn)行3，5-二硝基水楊酸法測定時，樣品中生成的棕紅色氨基化合物的含量會減少，相應(yīng)的最大吸光度值也會下降。通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定不同樣品中還原性糖的含量變化，并通過計算方法可以得出α-AI的活性[11]。（2）碘-淀粉顯色法。通過在一定濃度范圍內(nèi)將淀粉溶液與碘-碘化鉀反應(yīng)，可以觀察到藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物。這種藍(lán)色產(chǎn)物的吸光度在波長660 nm 處與淀粉的量之間存在線性關(guān)系。通過測量不同樣品中的吸光值，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中淀粉的含量。在檢測之前和之后分別加入α-AI，通過測量吸光度值，可以確定α-淀粉酶分解淀粉的量。通過計算吸光度值的差異，即可計算出α-AI的活性[12]。

1.3.2 測定方法（1）3，5-二硝基水楊酸法[13]。首先將濃度為0.05 mg/mL的α-淀粉酶溶液0.25 mL與α-AI 樣品0.25 mL 在37 ℃下結(jié)合10 min。隨后加入1%可溶性淀粉0.50 mL，在37 ℃下保溫反應(yīng)5 min。接著加入1.00 mL 的DNS 試劑，并在沸水浴中加熱10 min。待冷卻后，稀釋適當(dāng)倍數(shù)并在540 nm波長測定OD 值。（2）碘-淀粉顯色法。測定過程在試管中進(jìn)行。首先取1.00 mL 濃度為0.15 mg/mL 的α-淀粉酶，用磷酸緩沖液（PBS，pH 值6.9）配制而成，其次加入1.00 mL 待測液，在37 ℃下結(jié)合10 min。接著加入0.2%可溶性淀粉溶液5.00 mL，同時保持在37 ℃下反應(yīng)一定時間后進(jìn)行碘顯色，最后根據(jù)顯色程度來確定α-AI 的相對活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 3，5-二硝基水楊酸法測定α-AI 活力過程中，在PBS（pH 值為6.9）溶液體系下，使用可溶性淀粉作為底物，通過測定酶解反應(yīng)后釋放的葡萄糖與DNS 反應(yīng)產(chǎn)生的有色產(chǎn)物來評估淀粉酶活性的抑制情況。具體的添加量如表1所示。

表1 α-AI活力測定體系單位：mL

樣品中α-AI對α-淀粉酶的抑制率計算公式如下。

式（1）中，A1、A2、A3和A4分別為540 nm 空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光度值。α-淀粉酶的抑制率為20%～50%，相關(guān)數(shù)據(jù)才可以用于計算α-AI活力。

α-AI活力（U/g）為在37 ℃、pH值6.9的情況下，在α-淀粉酶催化淀粉水解的反應(yīng)中，1 min 內(nèi)抑制1 μg麥芽糖生成所需α-AI的量。樣品中α-AI活力按下式計算。

式（2）中，U2為對照管中α-淀粉酶活力（U）；U1為抑制管中α-淀粉酶活力（U）；M為白蕓豆提取物的取樣量（g）。

1.4.2 碘-淀粉顯色法通過碘-淀粉顯色反應(yīng)測定淀粉的降解程度。在淀粉酶作用下，淀粉會被水解成小分子的糖，而未被酶降解的淀粉可以與碘化鉀形成深藍(lán)色絡(luò)合物。因此，通過測定α-AI 處理后淀粉溶液中的碘化鉀復(fù)合物的吸光度來判斷淀粉酶抑制劑的效果。具體的添加量如表2所示。

表2 α-AI活力測定體系單位：mL

試樣中的α-AI含量計算公式如下。

式（3）中，A1為淀粉酶對照品的吸光度；A2為白蕓豆提取物的吸光度；M取樣量為白蕓豆提取物的取樣量（g）；342.3 為麥芽糖的摩爾質(zhì)量（g/mol）；T為反應(yīng)時間（min）；F為樣品的轉(zhuǎn)化系數(shù)，即固定值1 000；106為摩爾與微摩爾的單位轉(zhuǎn)化系數(shù)。本品按干燥品計算，其淀粉酶抑制活性不得低于1 000 U/g。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組試驗重復(fù)3次。采用OriginPro 9.0繪圖，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。使用SPSS進(jìn)行方差分析（one-way ANOVA），不同字母代表在P＜0.05 下差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法測定α-AI活力原理比較

如圖2A 所示，DNS 與還原糖中的還原羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)可產(chǎn)生的紅棕色化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸）。該反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于測定α-AI活性，因為它具有高準(zhǔn)確度和靈敏度[14]，同時該化學(xué)反應(yīng)在相對較短的時間內(nèi)就可以完成[15]。需要注意的是，使用3，5-二硝基水楊酸法測定α-AI 活性時，需要建立一系列含有已知濃度還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并間接準(zhǔn)確地計算出待測樣品中α-AI 活力。碘-淀粉顯色法測定α-AI 活力的原理是基于直鏈淀粉與碘之間的化學(xué)反應(yīng)[16]。如圖2B所示，直鏈淀粉與碘形成的直鏈淀粉-碘復(fù)合物會呈現(xiàn)藍(lán)色。這是因為碘分子會插入直鏈淀粉分子的內(nèi)部，圍出了一個“圓筒”（I2-I-鍵對）[17]，從而形成藍(lán)色的化合物。與此不同，支鏈淀粉的分支結(jié)構(gòu)會阻礙碘分子的插入，因此支鏈淀粉不會與碘發(fā)生顏色反應(yīng)，溶液的顏色不會變深（圖2C）。在試驗中，通常會將直鏈淀粉與淀粉酶和α-AI 樣品一起加入試管中，并設(shè)定一定的反應(yīng)時間。然后通過加入含碘的溶液來觀察試管內(nèi)的顏色變化。在酶對照組中，淀粉被酶降解，導(dǎo)致與碘的反應(yīng)減弱，使得顏色變淺。而在樣品組中，由于添加了α-AI，它會與淀粉結(jié)合，防止酶降解淀粉的發(fā)生。因此，樣品組中的直鏈淀粉的降解較少，與碘的反應(yīng)增強(qiáng)，使顏色變深。需要注意的是，在缺乏樣品對照的情況下，可能難以完全排除樣品本身顏色對結(jié)果的影響。一些物質(zhì)本身可能具有顏色，當(dāng)與碘反應(yīng)時會產(chǎn)生顏色變化，這可能會干擾對試驗結(jié)果的正確解讀。因此，在今后的試驗中，最好同時進(jìn)行一個樣品的對照試驗，其中只添加α-AI 樣品，可以更準(zhǔn)確地觀察并分析顏色變化，從而得出對α-AI 活力的正確評估。

圖2 2種方法測定α-AI活力原理比較

2.2 2種方法測定α-AI活力比較

由表3 可知，通過3，5-二硝基水楊酸法所獲得的α-AI活力與標(biāo)注值之間的存在正偏差，這表明通過該方法得到的測定結(jié)果高于標(biāo)注值。同時，偏差率隨著測定α-AI活力的增加而逐漸減小，說明在較低的α-AI活力水平下，偏差較大，而在較高的α-AI活力水平下，偏差相對較小。此外，偏差率D＞偏差率C＞偏差率A＞偏差率B，可以推斷出測定結(jié)果的準(zhǔn)確性隨著測定α-AI 活力的增加而提高。以上結(jié)果表明，隨著測定α-AI 活力的增加，通過3，5-二硝基水楊酸法所獲得的測定值更接近標(biāo)注值。結(jié)果表明標(biāo)注的α-AI 活力越高，所獲得的α-AI活力測定值更接近產(chǎn)品的標(biāo)注值。這也可能暗示著樣品性質(zhì)或反應(yīng)條件對2 種方法的測定結(jié)果產(chǎn)生了影響。

表3 不同白蕓豆提取物中α-AI活力數(shù)值

由表4 可知，通過碘-淀粉顯色法所獲得的α-AI 活力與標(biāo)注值之間存在負(fù)偏差，這表明通過該方法得到的測定結(jié)果低于標(biāo)注值，且該偏差率的絕對值隨著測定α-AI 活力的增加而逐漸減小。

表4 不同白蕓豆提取物中α-AI活力數(shù)值

一些原因可能導(dǎo)致這2 種方法獲得不同α-AI活力結(jié)果。（1）反應(yīng)機(jī)理不同。3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法在測定α-AI活力時使用了不同的反應(yīng)機(jī)理。不同的反應(yīng)機(jī)理可能導(dǎo)致2種方法對α-AI 的測定結(jié)果有一定的差異。（2）選擇的試劑。在2 種方法中，所使用的試劑也可能不同。不同試劑可能對α-AI的反應(yīng)具有不同的選擇性和靈敏度，導(dǎo)致2 種方法下α-AI 活力檢測結(jié)果存在差異。（3）試驗條件的不同。試驗條件如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和溶液pH值等，也可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如果在2種方法中使用的試驗條件不同，那么所獲得的α-AI 活力結(jié)果可能不一致。（4）樣品處理的差異。樣品的制備和處理過程也可能引起2 種方法之間的差異。樣品的制備過程中可能存在一些誤差或不一致性，這可能導(dǎo)致2種方法對α-AI活力的測定結(jié)果有不同的影響。（5）測定范圍不同。2種方法可能在測定α-AI 活力的線性范圍或靈敏度方面存在差異。這就意味著2 種方法在不同濃度范圍內(nèi)可能顯示出不同的準(zhǔn)確性和可靠性。

由上可得，3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法在測定α-AI 活力時可能存在多個差異源，包括反應(yīng)機(jī)理、試劑選擇、試驗條件和樣品處理等。這些差異可能導(dǎo)致2 種方法獲得不同的α-AI 活力結(jié)果。上述的研究和試驗數(shù)據(jù)顯示，3，5-二硝基水楊酸法的偏差更小且更接近實際值，表明在測定α-AI活力時，該方法可能更具有準(zhǔn)確性和可靠性。

2.3 2種方法測定方法比較

α-AI 對α-淀粉酶的抑制模式如圖3 所示。α-淀粉酶是一個催化淀粉分子降解的酶，α-AI 通過與α-淀粉酶結(jié)合，并干擾其催化淀粉分子降解的過程，從而達(dá)到抑制的目的。具體來說，在沒有α-AI 的情況下，α-淀粉酶能夠?qū)⒌矸鄯肿哟呋癁辂溠刻腔螓溠亢取．?dāng)α-AI 存在時，它會與α-淀粉酶結(jié)合，形成一個復(fù)合物，從而阻止α-淀粉酶催化淀粉分子的能力。這種結(jié)合可能是可逆的或不可逆的，具體取決于α-AI 本身的特性。3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法都可以用于測定α-AI 的含量，但原理有所不同。3，5-二硝基水楊酸法基于α-AI 對淀粉的降解作用。在反應(yīng)體系中，α-AI 會減緩或抑制淀粉的降解速率，導(dǎo)致與淀粉降解相關(guān)的酶促反應(yīng)也會減緩。這使得DNS 的還原速率減慢，從而影響比色反應(yīng)的結(jié)果。通過測量淀粉降解速率的變化，可以間接測定α-AI 的含量。碘-淀粉顯色法基于α-AI 的影響會導(dǎo)致淀粉降解速率減慢。在碘和淀粉溶液反應(yīng)時，如果存在α-AI，它會減慢淀粉的降解速度，從而碘與淀粉進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致較多的藍(lán)色產(chǎn)物形成。通過測量藍(lán)色產(chǎn)物形成深淺的變化，可以間接測定α-AI 的活性。

圖3 α-AI對α-淀粉酶的抑制模式

在3，5-二硝基水楊酸法中，淀粉酶作用下的淀粉被轉(zhuǎn)化為還原糖，其中包括一些還原性基團(tuán)，如醛基。這些還原性基團(tuán)與DNS 反應(yīng)產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成紅棕色產(chǎn)物（圖2A）。因此，只要淀粉經(jīng)過淀粉酶的作用形成了還原糖，就可觀察到顯色反應(yīng)。同時，在試驗中使用了合適的抑制對照組進(jìn)行比較，減少樣品背景的影響，以排除其他可能干擾測定結(jié)果的因素，可以確保測定α-AI活力結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對于碘-淀粉顯色法，淀粉分子具有完整的空間結(jié)構(gòu)時（由許多α-葡萄糖單元組成），其淀粉分子與碘分子通過非共價鍵（主要包括氫鍵和范德華力等）的相互作用[18]，從而實現(xiàn)碘-淀粉復(fù)合物的形成。這種復(fù)合物可以吸收可見光，表現(xiàn)為藍(lán)色（圖2B）。然而，淀粉經(jīng)過淀粉酶的作用后空間結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致碘分子無法充分與淀粉分子相互作用，使得產(chǎn)生的復(fù)合物少于完整的淀粉分子時的數(shù)量，從而降低顯色的程度（圖4A）。在α-AI 的存在下，α-AI 通過抑制淀粉酶的活性來減少淀粉的降解。因此，在α-AI 的存在下，淀粉分子的結(jié)構(gòu)可能不會被完全破壞，碘分子仍然可以與已被酶降解的淀粉分子形成復(fù)合物，產(chǎn)生一定程度的顯色反應(yīng)（圖4B）。因此，淀粉的藍(lán)色程度與淀粉的結(jié)構(gòu)可能不是線性關(guān)系。在這種情況下，使用碘-淀粉顯色法測定α-AI 含量可能會產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。

圖4 完全降解淀粉或未完全降解淀粉分別與碘分子顯色反應(yīng)情況

3 結(jié)論與討論

3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法均基于顯色反應(yīng)的前后變化進(jìn)行測量，但具體的反應(yīng)機(jī)理和檢測原理不同。3，5-二硝基水楊酸法是通過紅棕色產(chǎn)物的生成來間接測定α-AI 的活性，而碘-淀粉顯色法則是通過測量淀粉與碘絡(luò)合物的吸光度變化來間接測定α-AI 的活性。其中，碘-淀粉顯色法使用碘作為指示劑，它與淀粉形成藍(lán)色或紫色絡(luò)合物來定性或定量分析。然而，該方法在一些情況下可能存在選擇性差的問題，因為其他物質(zhì)或不完全降解淀粉也可能與碘發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致誤判。而在3，5-二硝基水楊酸法中，只要淀粉被淀粉酶催化產(chǎn)生還原糖，就可觀察到顯色反應(yīng)，可以更好地為白蕓豆提取物α-AI產(chǎn)品質(zhì)量提供指導(dǎo)方向。

本研究采用3，5-二硝基水楊酸法和碘-淀粉顯色法對白蕓豆提取物中α-AI活力進(jìn)行定量分析，并對不同檢測方法的結(jié)果準(zhǔn)確性進(jìn)行綜合比較。結(jié)果表明，3，5-二硝基水楊酸法測定α-AI的活力的偏差率的絕對值均低于碘-淀粉顯色法，并且標(biāo)注α-AI活力越高，測定α-AI活力越接近標(biāo)注值。因此，3，5-二硝基水楊酸法更具有前瞻性，可為產(chǎn)品的生產(chǎn)提供指導(dǎo)。