劉暢，房振楠，趙芬，汪玉鋒，徐龍芳，王廣榮，王慶華

1 青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院兒保科，山東青島 266000；2 菏澤市婦幼保健院兒?？?；3 菏澤市婦幼保健院產(chǎn)科；4 菏澤市婦幼保健院新生兒疾病篩查診治中心；5 菏澤市婦幼保健院檢驗(yàn)科

希特林蛋白缺乏導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積癥屬于希特林蛋白缺乏癥的一種類型，該類型多于新生兒晚期起病［1］，有部分患兒可因嚴(yán)重肝硬化或嚴(yán)重感染等并發(fā)癥死亡，若早期診斷并干預(yù)治療，多數(shù)患兒在1歲左右臨床癥狀及體征將會消失。文獻(xiàn)［2］報(bào)道，早期診斷和飲食干預(yù)是改善希特林蛋白缺乏導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒預(yù)后的關(guān)鍵。研究［3-6］顯示，亞洲地區(qū)根據(jù)SLC25A13 基因變異率預(yù)測希特林蛋白缺乏癥的患病率為1/38 000～1/7 100，而通過新生兒篩查發(fā)現(xiàn)確診的僅有1/82 352［7］，說明肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒在新生兒期存在漏診。隨著應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜法篩查遺傳代謝病的普及，肝內(nèi)膽汁淤積癥也被作為新生兒篩查疾病的病種之一，但篩查敏感性問題一直在探討中。肝內(nèi)膽汁淤積癥早期可出現(xiàn)串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果中瓜氨酸顯著升高，但若僅根據(jù)瓜氨酸是否顯著升高來排除診斷存在假陰性患兒。本研究采集2015 年5 月—2021 年12 月菏澤市出生的296 106 例新生兒足跟血，分別采用初篩手段（液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測）和復(fù)篩手段［液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、氣相色譜質(zhì)譜、血甲胎蛋白（AFP）、SLC25A13 基因檢測］篩查新生中希特林蛋白缺乏導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積癥，并分析比較篩查結(jié)果及篩查手段，旨在為提高此病的篩查提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015 年5 月1 日—2021 年12月31 日菏澤地區(qū)出生的新生兒296 106 例。篩查時間：所有新生兒均為產(chǎn)后72 h 或至少充分哺乳6 次后篩查。所有患兒監(jiān)護(hù)人均在知情同意下自愿進(jìn)行檢測，本研究經(jīng)菏澤市婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，批準(zhǔn)號為2017051603。

1.2 初篩手段 初篩手段為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。采集新生兒足底血，制成干血濾紙片，2～8 ℃冷藏保存，通過專用冷鏈遞送渠道，5 個工作日內(nèi)送至篩查中心實(shí)驗(yàn)室。應(yīng)用API3200MD 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。共定量分析11種氨基酸和31種?；鈮A，氨基酸包括丙氨酸（ALA）、精氨酸（ARG）、瓜氨酸（CIT）、甘氨酸（GLY）、亮/異亮氨酸（LEU + ILE）、蛋氨酸（MET）、鳥氨酸（ORN）、苯丙氨酸（PHE）、脯氨酸（PRO）、酪氨酸（TYR）、纈氨酸（VAL），酰基肉堿包括游離肉堿（CO）、乙?；鈮A（C2）、丙?；鈮A（C3）、丙二酸酰基肉堿（C3DC + C4OH）、丁?；鈮A（C4）、甲基丙二?；鈮A（C4DC + C5OH）、異戊?；鈮A（C5）、甲基巴豆?；鈮A（C5︰1）、戊二?；鈮A（C5DC + C6OH）、己?；鈮A（C6）、己二?；鈮A（C6DC）、辛?；鈮A（C8）、辛烯?；鈮A（C8︰1）、癸?；鈮A（C10）、癸烯?；鈮A（C10︰1）、癸二烯?；鈮A（C10︰2）、十二烷?；鈮A（C12）、十二烯?；鈮A（C12︰1）、十四烷?；鈮A（C14）、十四烯酰基肉堿（C14︰1）、十四二烯?；鈮A（C14︰2）、3-羥基十四烷?；鈮A（C14OH）、十六烷?；鈮A（C16）、十六烯?；鈮A（C16︰1）、3-羥基十六烷?；鈮A（C16OH）、3-羥基十六烯?；鈮A（C16︰10H）、十八烷?；鈮A（C18）、十八烯?；鈮A（C18︰1）、十八二烯酰基肉堿（C18︰2）、3-羥基十八烷酰基肉堿（C18OH）、3-羥基十八烯?；鈮A（C18︰10OH）。參考范圍：CIT 5.5～33 μmol/L，MET 11～55 μmol/L、PHE 24～105 μmol/L、TYR 40～330 μmol/L、ARG 1～70 μmol/L。

1.3 復(fù)篩手段 復(fù)篩手段為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、氣相色譜質(zhì)譜、血甲胎蛋白（AFP）、SLC25A13 基因檢測及治療評估。8 例初篩高度懷疑，通過后續(xù)檢查確診；5 例初篩瓜氨酸數(shù)值略升高或正常范圍高限，但伴有其他氨基酸水平異常，再次進(jìn)行復(fù)篩確診；3例篩查為陰性，后因黃疸、肝功能異常等住院治療時再次進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析；14例患兒行基因檢測。

1.3.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測 檢測方法同“1.2”。

1.3.2 氣相色譜質(zhì)譜檢測 采集可疑患兒新鮮尿液制成尿紙片，進(jìn)行尿氣相色譜質(zhì)譜檢測，可檢測包括氨基酸、單糖、雙糖、嘧啶、嘌呤、核酸、脂肪酸、脂質(zhì)等在內(nèi)的132 種小分子代謝物，該檢測由第三方檢測機(jī)構(gòu)執(zhí)行，其中需要特別注意的為4-羥基苯丙酮酸（參考范圍0～5 μmol/mol）和4-羥基苯乳酸（參考范圍0～20 μmol/mol）。

1.3.3 AFP 檢測 抽取患兒靜脈血2～3 mL，采用邁瑞-2000 化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，以及相應(yīng)配套的mindray試劑盒檢測血中AFP，操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說明，正常參考范圍1～7 ng/mL。

1.3.4 SLC25A13基因檢測 應(yīng)用乙二酸四乙酸鈉（EDTA）抗凝管采集患兒外周靜脈血2～3 mL，對于SLC25A13基因采用第二代測序進(jìn)行檢測，同時進(jìn)行Sanger驗(yàn)證，以及對相關(guān)致病基因突變進(jìn)行分析，對患兒父母基因組DNA相應(yīng)陽性位點(diǎn)檢測，明確該基因突變位點(diǎn)是否來源于父母，或?yàn)樾掳l(fā)基因突變位點(diǎn)。

1.4 治療方法 對于有臨床表現(xiàn)，高度懷疑肝內(nèi)膽汁淤積癥，常規(guī)治療效果欠佳且易反復(fù)的患兒，早期可嘗試性給予無乳糖特殊奶粉（藹兒舒/中鏈脂肪酸/牛百肽），嬰兒期添加輔食時囑少吃碳水化合物，注意補(bǔ)充維生素A、D、K、E等脂溶性維生素，必要時給予精氨酸、苯甲酸鈉等降血氨［1］治療，根據(jù)治療效果來篩選是否為肝內(nèi)膽汁淤積癥。

2 結(jié)果

2.1 初篩結(jié)果 初篩出可疑患兒13 例（患兒編號由A～M），蛋氨酸明顯升高患兒共8 例（患兒A～患兒H），由于初篩年齡不同，瓜氨酸數(shù)值也有所差異，中位數(shù)為 263.6 μmol/L，四分位間距為342.39 μmol/L。 患兒A 同時伴有蛋氨酸（99.63 μmol/L）升高，患兒B 與患兒G 的蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸均升高，患兒E 伴有苯丙氨酸（300 μmol/L）、酪氨酸（416 μmol/L）升高，患兒F蛋氨酸（73.97 μmol/L）、苯丙氨酸（133 μmol/L）略升高。其余初篩異?；純褐?，患兒I 僅進(jìn)行四病篩查，表現(xiàn)為苯丙氨酸（354 μmol/L）顯著升高，需召回復(fù)診?；純篔～患兒M 中蛋瓜氨酸數(shù)值略升高或位于正常范圍高限，伴或不伴有其他氨基酸水平的異常，其中瓜氨酸數(shù)值依次為34.18 μmol/L（患兒J）、32.82 μmol/L（患兒K）、44.88 μmol/L（患兒L）、41.1 μmol/L（患兒M），而患兒K伴有C14、C16、C16︰1的升高，患兒L 伴有精氨酸（212.7 μmol/L）升高。其他未描述患兒余氨基酸數(shù)值均在正常范圍內(nèi)。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果 患兒A 未及時復(fù)診，于28 d 死亡，患兒D 與患兒J 因“黃疸”于外院住院治療，均未檢測。患兒B 瓜氨酸（282.5 μmol/L→420 μmol/L）、精氨酸（85.94 μmol/L→254 μmol/L）較前明顯升高，蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸與初篩無明顯差異（仍升高）。而患兒G瓜氨酸較前無明顯變化，除精氨酸（80.78 μmol/L→132 μmol/L）升高外，蛋氨酸、苯丙氨酸恢復(fù)至正常?；純篍 瓜氨酸（244.7 μmol/L→477 μmol/L）升高，精氨酸由正常數(shù)值（48.31 μmol/L）升至134.5 μmol/L，苯丙氨酸、酪氨酸與初篩無明顯差異（仍升高）?；純篎的蛋氨酸（55.51 μmol/L）較前無明顯變化，苯丙氨酸（62.87 μmol/L）降至正常，取而代之的是酪氨酸（282 μmol/L→357.1 μmol/L） 、 精 氨 酸（62.59 μmol/L→165 μmol/L）升高?；純篒 復(fù)篩時進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢測時顯示瓜氨酸（596 μmol/L）、蛋氨酸（121 μmol/L）、苯丙氨酸（155.2 μmol/L）、精氨酸（140 μmol/L）均升高。 患兒C 精氨酸（38.96 μmol/L→139 μmol/L）較初篩值升高?；純篐 復(fù)篩除瓜氨酸（99.61 μmol/L→265 μmol/L）較前升高外，余氨基酸水平無明顯改變。患兒K、患兒L、患兒M 的瓜氨酸（依次為333 μmol/L、496 μmol/L、497 μmol/L）均顯著升高，患兒K 復(fù)篩時C14、C16、C16︰1 恢復(fù)正常，而精氨酸（475 μmol/L）升高?；純篖 精氨酸較前變化不大，患兒M 酪氨酸（123.66 μmol/L→354.1 μmol/L） 、精 氨 酸（20.19 μmol/L→141 μmol/L）升高。患兒N、患兒O、患兒P 串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)均未見異常（為漏篩病例），未進(jìn)行復(fù)篩，后期因“皮膚黏膜黃染并進(jìn)行性加重”住院治療時，復(fù)篩串聯(lián)質(zhì)譜等檢查，瓜氨酸均顯著升高，依次為541 μmol/L、267 μmol/L、150 μmol/L，患兒N 伴有蛋氨酸（95.85 μmol/L）升高，患兒O 伴有蛋氨酸（74.79 μmol/L）、精氨酸（71.56 μmol/L）略升高，患兒P余氨基酸水平正常。

2.2.2 氣相色譜質(zhì)譜結(jié)果 除患兒A、患兒D、患兒J 未檢測，余患兒（包括患兒N、患兒O、患兒P）4-羥基苯丙酮酸、4-羥基苯乳酸均顯著升高。4-羥基苯丙酮酸中位數(shù)為82.3 μmol/mol，四分位間距為342.39 μmol/L；4-羥基苯乳酸位數(shù)為645.1 μmol/mol，四分位間距為733.6 μmol/L。

2.2.3 血AFP 結(jié)果 除患兒A、患兒D、患兒J 未檢測，其他患兒（包括患兒N、患兒O、患兒P）AFP 數(shù)值均明顯升高，其中患兒B、患兒C、患兒E、患兒H、患兒I、患兒K 數(shù)值均超過測量范圍最高限（>80 000 ng/mL），余患兒中位數(shù)為47 882.5 ng/mL，四分位間距為5 8320 ng/mL。

2.2.4 SLC25A13 基因結(jié)果 除患兒A 和患兒B，其他患兒（共14 例）均進(jìn)行基因檢測，患兒F 為等位基因純和突變（突變位點(diǎn)c.852_855del，父母各攜帶一個），患兒L、患兒M、患兒O 只檢測出一個突變位點(diǎn)（但根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜、尿有機(jī)酸分析、甲胎蛋白、肝腎功能、臨床表現(xiàn)以及治療效果評估均可臨床確診），患兒O 提示突變來源于母親，患兒L 與患兒M 在父母基因中均未檢測到。余患（共10例）為雜合突變，且突變均來自于父母，無新發(fā)突變。共有11 個突變位點(diǎn)，其中錯義突變1 個：c. 1475G>A，移碼突變1個：c.1638_1660dup，插入突變1 個：IVS16ins3kb，整碼突變1 個：c. 852_855del，剪切位點(diǎn)突變3 個：c.615 + 5G>A、c.1177 + 1G>A、c.755-1G>C，無義突變3 個：c.742G>A、C.1078C>T、c.955C>T、c.889G>T。最常見的突變位點(diǎn)為c. 852_855del，占50%，第二常見突變位點(diǎn)為IVS16ins3kb，占33%。

2.3 治療結(jié)果評估 患兒治療后除患兒L失訪、患兒A死亡外，余患兒均定期監(jiān)測患兒體格發(fā)育、營養(yǎng)狀況，每1～3月檢測串聯(lián)質(zhì)譜、尿有機(jī)酸分析、甲胎蛋白、肝腎功能、血脂、血糖；每3～6月采用Gessell兒童發(fā)育量表測定發(fā)育商（DQ），各項(xiàng)異常指標(biāo)均較前明顯下降，并逐漸恢復(fù)正常，皮膚黏膜黃染明顯好轉(zhuǎn)。

3 討論

各地區(qū)新生兒篩查確診肝內(nèi)膽汁淤積癥有所差異。浙江省186 萬新生兒篩查中，篩查確診29例，檢出率為1/68 935，漏篩2例，患病率為1/64 138［8］。湖南省565 182 例新生兒篩查中，篩查確診6 例，檢出率（即患病率）為1/94 197［9］。廣州市124 250 例新生兒篩查對象中，篩查確診1 例，檢岀率為1/124 250，發(fā)現(xiàn)3 例假陰性，患病率1/31 062［10］。徐州地區(qū)共篩查新生兒461 494 例，最終明確13 例，檢出率（即患病率）1/36 038。LIN 等［6］的研究顯示，人群中肝內(nèi)膽汁淤積癥的患病率為1/26 403。本研究中，菏澤地區(qū)共篩查296 106 例新生兒，肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒16例，篩查確診13例，檢出率1/22 777，假陰性3 例，患病率1/18 506，明顯高于其他省市發(fā)病率，雖與LIN 等的研究相近，但也存在差異，這是否與樣本量少、統(tǒng)計(jì)年限短以及生活條件等因素相關(guān)，有待進(jìn)一步研究論證。

肝內(nèi)膽汁淤積癥是由SLC25A13 基因的雙等位基因突變引起的一種疾病，在東亞人群中相對常見。SLC25A13 基因位于染色體7q21.3，由18 個外顯子組成，轉(zhuǎn)錄翻譯成一種具有二聚體結(jié)構(gòu)位于線粒體內(nèi)膜的鈣結(jié)合性跨膜天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白（希特林蛋白），共有675個氨基酸［11］，主要參與蘋果酸—天冬氨酸的穿梭過程中谷氨酸—天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)，同時向線粒體內(nèi)提供一個質(zhì)子H +［12］。當(dāng)基因突變導(dǎo)致希特林蛋白功能障礙時，天冬氨酸無法從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)，胞質(zhì)中天冬氨酸不足，抑制精氨酸代琥珀酸合成酶，從而引起尿素循環(huán)障礙、蛋白質(zhì)合成受阻、肝細(xì)胞脂肪變性，導(dǎo)致血中瓜氨酸升高。同時機(jī)體可能通過其他氨基酸代償進(jìn)一步彌補(bǔ)尿素循環(huán)功能及能量代謝障礙，使其他氨基酸出現(xiàn)相應(yīng)的改變［13］，如蛋氨酸、苯丙氨酸等。本研究中患兒的串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果與之相對應(yīng)。本研究中SLC25A13 基因最常見的突變位點(diǎn)為c.852_855del，與陜西地區(qū)研究顯示最常見位點(diǎn)［14］相似。而另有研究［15］顯示，此突變位點(diǎn)在南方地區(qū)更常見且明顯多于北方地區(qū)。這種差異可能與數(shù)據(jù)偏倚以及樣本量較少有關(guān)。第二常見突變位點(diǎn)為IVS16ins3kb，這與CHEN 等的研究相呼應(yīng)［16］。 但少數(shù)患兒的SLC25A13 基因僅發(fā)現(xiàn)1 個突變位點(diǎn)，這可能與該地區(qū)經(jīng)濟(jì)條件所限，大部分患兒僅進(jìn)行SLC25A13 基因靶向測序，使位于內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)的基因突變不易檢出有關(guān)。而少數(shù)進(jìn)行全基因組外顯子檢測的患兒，當(dāng)基因存在大片堿基插入或堿基缺失突變時，傳統(tǒng)的基因檢測手段無法檢測，需結(jié)合cDNA 克隆或進(jìn)行功能分析［17］，這使檢測難度進(jìn)一步增加。雖然基因檢測未能明確診斷，但是根據(jù)臨床表現(xiàn)、生化結(jié)果以及給予無乳糖奶粉治療后效果顯著均提示為肝內(nèi)膽汁淤積癥。

值得注意的是，本文報(bào)道的患兒K 及患兒I，患兒K（3日齡時）初篩結(jié)果示瓜氨酸在正常范圍高值，但C14、C16以及C16︰1明顯升高，遂召回復(fù)篩，患兒復(fù)篩時為31日齡，查體示精神差，刺激反應(yīng)欠佳，皮膚黃染至腹部，肝臟未觸及明顯腫大，復(fù)篩結(jié)果示瓜氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸均顯著升高，同時查肝功未見明顯異常，腹部超聲僅表現(xiàn)為膽囊內(nèi)略強(qiáng)回聲。部分研究顯示隨著時間的推移，肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的長鏈酰基肉堿（包括C14、C16）可成逐步上升趨勢［18］，這可能與線粒體中脂肪酸的β-氧化（FAO）受到抑制相關(guān)［19］，肉堿作為長鏈脂肪酸的唯一載體，當(dāng)長鏈?；鈮A水平升高時，長鏈脂肪酸也相應(yīng)增多，長鏈脂肪酸以甘油三酯的形式儲存在脂肪組織中。該患兒SLC25A13 基因?yàn)閺?fù)合雜合突變（c.615 + 5G>A/c.742G>A），王彩虹等曾報(bào)道1例攜帶有c.615 + 5G>A 的復(fù)雜雜合突變的患兒，也伴有甘油三酯的升高，但同一報(bào)道中攜帶相同突變的另一患兒并未升高［20］，另一突變位點(diǎn)c. 742G>A 使位于第248 位的酸性氨基酸谷氨酸突變?yōu)閴A性氨基酸賴氨酸，其臨床意義未明確，有待進(jìn)一步的研究分析基因型與表型是否相關(guān)。而患兒I 僅進(jìn)行四病篩查，篩查時提示苯丙氨酸升高，遂召回復(fù)篩串聯(lián)并完善相關(guān)檢查后確診，再次提醒臨床兒科醫(yī)師，單純苯丙氨酸升高時，除排除常見的高苯丙氨酸血癥以外，也要注意與肝內(nèi)膽汁淤積癥鑒別以防漏診。

因肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒早期（3～7 日齡時）不伴有臨床癥狀時，瓜氨酸升高可不顯著，這導(dǎo)致僅基于串聯(lián)質(zhì)譜的新生兒篩查技術(shù)準(zhǔn)確診斷肝內(nèi)膽汁淤積癥具有挑戰(zhàn)性，當(dāng)肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒表現(xiàn)出典型的膽汁淤積時，血氨基酸譜也發(fā)生改變，以瓜氨酸升高為主要特點(diǎn)，可伴有蛋氨酸、鳥氨酸、酪氨酸等明顯升高［6，11］。但延期進(jìn)行足底血篩查的風(fēng)險更大，是否具有可行性有待于更進(jìn)一步。雖有研究顯示，iPLEX 檢測可顯著提高新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥的篩查陽性率，但基于經(jīng)濟(jì)等問題未應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，與新生兒篩查確診及時治療的患兒相比，在新生兒篩查中被漏診，后期發(fā)病確診的患兒，臨床癥狀更重、更急。這對于兒科醫(yī)師而言，早期確診顯得尤為重要，即使患兒初次串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果正常，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀（如常規(guī)治療后皮膚黏膜黃染進(jìn)行性加重、肝脾腫大、肝功能異常等），應(yīng)再次復(fù)篩串聯(lián)質(zhì)譜檢測，必要時結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜、血AFP 以及基因檢測，以盡早確診，提高診出率，降低假陰性的發(fā)生率。

總之，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是篩查肝內(nèi)膽汁淤積癥最常用檢測手段之一，部分早期瓜氨酸值改變不明顯患兒，伴或不伴有其他氨基酸（如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸）異常，復(fù)篩時聯(lián)合尿氣相色譜、血AFP、SLC25A13 基因檢測等可提高檢出率，基因檢測作為診斷肝內(nèi)膽汁淤積癥的金標(biāo)準(zhǔn)仍有局限性，即使未檢測出突變位點(diǎn)，根據(jù)化驗(yàn)檢測、臨床表現(xiàn)以及治療有效可臨床確診。需要特別注意的是，少部分患兒即使初次串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果正常，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀（如常規(guī)治療后皮膚黏膜黃染進(jìn)行性加重、肝脾腫大、肝功能異常等）時，應(yīng)即使給予復(fù)篩串聯(lián)質(zhì)譜檢測，以早期提高診出率。