王若桐，劉春潔

（ 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300 ）

大量研究證實(shí)，葡萄糖存在于人類[1]、獼猴[2]、水牛[3]、綿羊[4]、牛[5]、豬[6]、駱駝[7]和馬[8]的卵泡液中，主要作為顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)所需的能量。葡萄糖在卵泡液中的含量低于血清，不同種動(dòng)物的卵泡液、血清中葡萄糖的含量也各不相同。有研究發(fā)現(xiàn)，直徑大的卵泡中葡萄糖含量顯著高于直徑小的卵泡，且排卵前卵泡中葡萄糖的含量達(dá)到最高[4,9-10]，表明在同一生理?xiàng)l件下，不同卵泡在不同發(fā)育階段所需能量也存在差異。胰島素與胰島素受體（IR）的結(jié)合導(dǎo)致一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件，可調(diào)節(jié)多種生物過程，如葡萄糖和脂質(zhì)代謝、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和存活。

卵泡液是卵母細(xì)胞賴以生長(zhǎng)成熟的微環(huán)境，其中的胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟、排出以及受精后胚胎的形成具有重要的影響。葡萄糖受到胰島素信號(hào)、腺苷酸活性蛋白激酶（AMPK）和己糖胺途徑等胞內(nèi)多重機(jī)制感應(yīng)，是機(jī)體代謝最基本的能量底物。己糖胺合成途徑被認(rèn)為是能量狀態(tài)的“傳感器”，用于調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育功能[11]。本文綜述了胰島素-葡萄糖信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制，以期為哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域的相關(guān)研究提供參考。

1 葡萄糖調(diào)節(jié)卵泡代謝機(jī)制

正常卵泡發(fā)育過程中所需的能量主要依靠顆粒細(xì)胞，并通過其細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）攝取周圍組織中的葡萄糖完成[12]。葡萄糖在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中的主要代謝方式是糖酵解、戊糖磷酸化（PPP）和三羧酸循環(huán)，其在卵母細(xì)胞代謝中對(duì)體外卵母細(xì)胞成熟、受精以及后續(xù)胚胎發(fā)育潛能[13-17]均具有顯著影響。卵泡液中的乳酸含量隨著卵泡直徑和卵泡液增加而逐漸增加；葡萄糖的含量則與卵泡直徑呈負(fù)相關(guān)，一般卵泡直徑越大，葡萄糖含量越低。發(fā)育中的卵泡具有很高的糖酵解活性。有研究結(jié)果顯示，使用高濃度的葡萄糖、丙酮酸和乳酸聯(lián)合培養(yǎng)顆粒細(xì)胞可顯著提高其增殖能力[18]。

高濃度葡萄糖能夠抑制卵母細(xì)胞體外成熟，因此PPP或糖酵解在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中至關(guān)重要。但也有研究發(fā)現(xiàn)，奶牛、山羊和綿羊的卵泡中葡萄糖含量隨著卵泡直徑增加呈上升趨勢(shì)[19]。卵母細(xì)胞無(wú)法直接利用糖酵解供能，而顆粒細(xì)胞從原始卵泡開始即表現(xiàn)出較強(qiáng)的糖酵解活性[20]。此外，顆粒細(xì)胞中磷酸果糖激酶（PFK）及乳酸脫氫酶（LDH）的表達(dá)顯著高于其在卵母細(xì)胞中的表達(dá)，并且PFK 和LDH 在竇卵泡中的表達(dá)最強(qiáng)，其糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸和乳酸可作為卵母細(xì)胞的主要能量來(lái)源[21]。

2 胰島素調(diào)節(jié)體內(nèi)外卵泡機(jī)制

IGF-1與受體結(jié)合后可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和雌激素合成，并促進(jìn)卵泡進(jìn)一步發(fā)育。IGF-1具有增強(qiáng)促性腺激素促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用，可刺激雌激素合成增加以及氨基酸積蓄，同時(shí)還能夠誘使未成熟的卵母細(xì)胞自發(fā)成熟并進(jìn)行良好的分裂。已有研究表明，在卵巢的顆粒細(xì)胞區(qū)，IGF-1與促卵泡生成素（FSH）可相互促進(jìn)對(duì)方受體表達(dá)，從而增強(qiáng)相互的生物效應(yīng)，為卵泡發(fā)育提供更多能量。IGF-1與促性腺激素（LH）具有協(xié)同作用，可誘導(dǎo)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞LH受體表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞增殖。IGF-1滅活可導(dǎo)致卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育停滯，使用促性腺激素也無(wú)法使卵泡繼續(xù)發(fā)育[22]。

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBP）分子量最小的是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4（IGFBP-4），在所有生物體內(nèi)均以糖基化和非糖基化等兩種形式存在。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，IGFBP-4抑制了IGF-I與純化的IGF-1 R結(jié)合，作為IGF 的高效抑制劑對(duì)卵巢生理功能具有重要影響。在雄激素優(yōu)勢(shì)卵泡和生長(zhǎng)停滯卵泡的卵泡液中IGFBP-4的水平均較高[23]，但在人體內(nèi)IGFBP-4能夠抑制卵巢類固醇生成。有研究指出，IGFBP-4通過抑制卵巢IGF的功能進(jìn)而抑制卵泡發(fā)育；胰島素可影響卵泡在體內(nèi)的發(fā)育[24]。盡管大多數(shù)體內(nèi)研究數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這一結(jié)果，但體內(nèi)和體外的研究結(jié)果仍存在一些差異，主要區(qū)別是：顆粒細(xì)胞可能通過刺激雌二醇（E2）產(chǎn)生體外胰島素，而體內(nèi)胰島素卻能夠抑制卵巢內(nèi)E2分泌。有研究通過幼齡大鼠卵巢的灌注試驗(yàn)表明胰島素能夠促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂并且抑制E2的分泌。注射葡萄糖或生糖飲食均可提高血清中葡萄糖含量，增加卵泡數(shù)目和刺激胰島素分泌，而降低卵泡內(nèi)E2的含量和細(xì)胞色素P45019a1（CYP19a1）的轉(zhuǎn)錄水平[25-27]。有研究通過建立綿羊自體移植模型發(fā)現(xiàn)體內(nèi)灌注胰島素能夠增加外周血中葡萄糖的含量，無(wú)法促進(jìn)卵泡內(nèi)類固醇生成；灌注葡萄糖時(shí)，卵泡內(nèi)類固醇被抑制。體內(nèi)胰島素、類固醇生成需要攝取葡萄糖，并降低促分裂原活化蛋白激酶（Akt/ERK）和腺苷酸活性蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平。葡萄糖能夠刺激產(chǎn)后奶牛胰島素分泌，促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵巢周期恢復(fù)，但不利于胚胎存活[21,28]。此外，葡萄糖能夠刺激底物與FSH 或LH 受體結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)孕激素（P4）和E2分泌，同時(shí)也能夠誘導(dǎo)類固醇的生成[29]。

在大多數(shù)體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的應(yīng)答機(jī)制中，胰島素能夠刺激細(xì)胞增殖和類固醇生成。但也有研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞中高濃度胰島素不能刺激類固醇生成，是由于高濃度胰島素刺激P4和雄激素分泌的能力高于對(duì)E2的刺激。胰島素還可直接刺激顆粒細(xì)胞增殖、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、游離脂肪酸積累，并能夠促進(jìn)LH誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體表達(dá)。胰島素通過誘導(dǎo)人類和動(dòng)物膜細(xì)胞刺激雄激素分泌，為顆粒細(xì)胞E2合成提供底物[30-31]。在大鼠膜細(xì)胞中，胰島素不但能夠刺激細(xì)胞增殖，還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期激酶4（CDK4）蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。細(xì)胞周期蛋白D3 和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）均被雷帕霉素（mTOR）阻斷，表明激活的胰島素參與雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）信號(hào)通路的調(diào)控[32]。高濃度胰島素能夠刺激體外卵母細(xì)胞的分裂和成熟[33]，但體內(nèi)長(zhǎng)期存在高濃度胰島素會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育造成負(fù)調(diào)控。此外，在一項(xiàng)牛的研究中證實(shí)，高胰島素血癥與卵母細(xì)胞質(zhì)量受損程度相關(guān)。排卵前卵泡中胰島素的含量高于次級(jí)卵泡，由此推測(cè)卵泡中適量的胰島素能夠促進(jìn)體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟，胰島素濃度過高則對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育具有負(fù)影響。

3 胰島素-葡萄糖信號(hào)通路調(diào)控卵泡代謝機(jī)制

3.1 Akt信號(hào)通路

目前已鑒定哺乳動(dòng)物中至少存在11 個(gè)胰島素受體底物（IRS），包括胰島素受體底物Shc等。人體中檢測(cè)到額外的兩個(gè)IRS對(duì)接蛋白4和5涉及胰島素信號(hào)，但不參與激活磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）。肌肉和脂肪組織中的IRS-1是刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的底物，而肝臟中的IRS-1 和IRS-2 對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖代謝具有互補(bǔ)作用。細(xì)胞內(nèi)IR的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是PI3K/Akt 和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）[34]。PI3K 途徑的生物學(xué)效應(yīng)可能是通過磷脂磷酸酶負(fù)調(diào)控三磷酸化的脂酰磷酸肌醇PIP3水平，去磷酸化而失活，之后活化3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1），進(jìn)一步促使蛋白激酶B（Akt/PKB）發(fā)生磷酸化。綜上所述，哺乳動(dòng)物胰島素通過IR或IRS誘導(dǎo)PI3K/Akt和MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用。

Akt 包含3 種由基因單獨(dú)編碼的異構(gòu)體，也是胰島素信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵分支點(diǎn)。激活的Akt 直接發(fā)生磷酸化，同時(shí)伴隨結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2（TSC2）和糖原合成酶激酶-3（GSK3）失活，激活凋亡抑制因子（Bcl-2）相關(guān)死亡促進(jìn)者和叉頭型轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）。John等[35]研究表明，PI3K/AKT/FOXO3信號(hào)與卵巢功能密切相關(guān)。在卵泡發(fā)育過程中，PI3K/AKT 的激活導(dǎo)致叉頭型轉(zhuǎn)錄因子O3（FOXO3）磷酸化和核輸出，從而觸發(fā)原始卵泡激活。在原始卵泡發(fā)育過程中，F(xiàn)OXO3為非磷酸化并定位于細(xì)胞核，抑制原始卵泡激活。Li等[36]研究表明，卵母細(xì)胞中的組成型活性FOXO3能夠提高小鼠卵巢的生殖能力。

哺乳動(dòng)物的靶標(biāo)雷帕霉素（mTOR）包括mTOR復(fù)合物-1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物-2（mTORC2），是結(jié)構(gòu)和功能均不同的蛋白復(fù)合體。FOXO1發(fā)生磷酸化后直接負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性和上游因子TSC2，參與mTORC1合成。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 與調(diào)控mTOR 相關(guān)蛋白顯著相關(guān)，也是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子；其次，mTOR 與雷帕霉素不敏感mTOR 伴侶還具有促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞存活及細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程等功能。真核起始因子4E結(jié)合蛋白質(zhì)1（4E-BP1）和p70核糖體S6激酶1（S6K1）的主要功能是調(diào)控蛋白質(zhì)合成，是mTORC1下游的兩個(gè)最佳靶標(biāo)。Akt 對(duì)胰島素的應(yīng)答機(jī)制導(dǎo)致FOXO1從核中移出并發(fā)生磷酸化，從而阻止其在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）作用下發(fā)生轉(zhuǎn)錄。此外，Akt 也可通過磷酸化抑制劑發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。有研究指出，抑制PI3K/Akt 通路幾乎能夠阻止哺乳動(dòng)物體內(nèi)所有關(guān)于胰島素的代謝活動(dòng)，包括刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成和脂質(zhì)合成等[36]。

Das 等[37]試驗(yàn)結(jié)果顯示，胰島素可間接增加促性腺激素受體或LH 受體的數(shù)量。胰島素可與FSH 協(xié)同作用，促進(jìn)卵巢卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的分化和增殖。此外，Saltiel 等[33]研究表明，胰島素也可刺激培養(yǎng)顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的類固醇生成和細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可調(diào)節(jié)人類卵巢雄激素產(chǎn)生，提供了培養(yǎng)人卵泡膜細(xì)胞分泌雄激素的證據(jù)。上述研究表明，胰島素在早期卵泡的形成中起到促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的間接作用。然而，Pitetti等[38]研究表明，胰島素受體可能并非卵母細(xì)胞生長(zhǎng)必需，因?yàn)橐葝u素受體缺失并不影響卵母細(xì)胞發(fā)育或正常的發(fā)情周期。

3.2 GLUT促使葡萄糖的攝取

目前已報(bào)道了哺乳動(dòng)物中的13 種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT），其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUTs 1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUTs 4）在綿羊卵泡中均有表達(dá)；GLUTs 1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（GLUTs 3）及GLUTs 4 的mRNAs 在牛黃體期的卵泡中表達(dá)[39]；GLUTs 1、GLUTs 3 和GLUTs 4 的mRNAs 在大鼠卵巢中表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，GLUTs 1、GLUTs 3、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5（GLUTs 5）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8（GLUTs 8）的mRNAs 呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)。而多囊卵巢綜合征患者的顆粒細(xì)胞中不表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT 2）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7（GLUT 7）的mRNAs。GLUTs 4 的mRNAs 優(yōu)先在肌肉和脂肪組織中表達(dá)，還能夠刺激胰島素誘導(dǎo)葡萄糖攝取的信號(hào)應(yīng)答機(jī)制[40]。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素衍生的信號(hào)通路也可調(diào)控GLUTs 4 轉(zhuǎn)錄水平，包括PI3K、PDK1/2和非典型蛋白激酶C（PKC）的激活，推測(cè)可能是通過卵泡內(nèi)的因子（E2、IGF-1 和白細(xì)胞介素-1β、FSH 等）刺激GLUTs 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵泡成熟和排卵[40]。也有研究發(fā)現(xiàn)，牛卵泡液中葡萄糖含量與顆粒細(xì)胞中GLUTs 1 和GLUTs 3 的mRNA 表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。上述研究表明，卵泡中激素能夠誘導(dǎo)葡萄糖攝取。GLUTs在卵母細(xì)胞中處于非功能性狀態(tài)，卵母細(xì)胞通過卵丘細(xì)胞的空隙連接誘導(dǎo)GLUT轉(zhuǎn)運(yùn)，促使葡萄糖攝取[40]。

次級(jí)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟卵母細(xì)胞過程中涉及多個(gè)胰島素信號(hào)下游靶基因的調(diào)控，胰島素可誘導(dǎo)Atk 發(fā)生磷酸化，進(jìn)而調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸激酶。小鼠卵母細(xì)胞中，顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子可溶性試劑盒配體（KL）調(diào)控PI3k/Akt信號(hào)途徑，由于Akt1介導(dǎo)在絲氨酸21中的GSK3α或在絲氨酸9 中的GSK3β，進(jìn)而導(dǎo)致GSK3 的激活。牛卵巢中，GSK3 定位于顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，表達(dá)于整個(gè)卵泡中。GSK3 激酶位于卵母細(xì)胞中期-Ⅱ（MⅡ）與第一極體之間的區(qū)域。而使用特異性抑制劑影響GSK3β從MⅠ到MⅡ過渡調(diào)控功能，可能是由于Aurora A 激酶參與GSK3β激活[41]。

FOXO蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子并介導(dǎo)胰島素或IGF-1在其不同途徑中的關(guān)鍵功能存在的抑制作用[42]。作為對(duì)增加的胰島素或IGF-1 信號(hào)的響應(yīng)，F(xiàn)OXO 蛋白經(jīng)歷胰島素介導(dǎo)的磷酸化和從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的易位，導(dǎo)致靶基因表達(dá)抑制[41-43]。FOXO3 也是IκB 激酶的直接靶點(diǎn)，IκB 對(duì)FOXO3 的磷酸化可調(diào)節(jié)幾種細(xì)胞因子的依賴性途徑[44]。FOXO1 和FOXO3a 也可調(diào)控卵泡生成[45]。FOXO3a 在早期初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞核中表達(dá)，在原始卵泡的卵母細(xì)胞和生長(zhǎng)卵泡中的表達(dá)呈顯著性下調(diào)[46-47]。哺乳動(dòng)物中FSH-非依賴性卵泡主要介導(dǎo)FOXO3a，進(jìn)而負(fù)調(diào)控早期卵泡活性和卵泡發(fā)育，實(shí)際是抑制原始卵泡生長(zhǎng)和控制原始卵泡的存活率。小鼠敲除試驗(yàn)已證實(shí)，F(xiàn)OXO3a 并非由于GSK3作用于FSH-非依賴性激素促使卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，但FOXO3a失活后卻使卵泡生殖能力迅速下降，增加閉鎖卵泡數(shù)量及原始卵泡池的損耗。小鼠卵母細(xì)胞中FOXO1 mRNA的表達(dá)量不同發(fā)揮功能不同，但在沒有足夠數(shù)量代替FOXO3a的情況下不表達(dá)[35,48]。FOXO1和FOXO3a作為胰島素激活A(yù)KT的靶基因調(diào)控哺乳動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)或閉鎖，促使哺乳動(dòng)物卵泡形態(tài)和生理發(fā)生功能性變化。

4 結(jié)論

胰島素介導(dǎo)葡萄糖攝取對(duì)于哺乳動(dòng)物生產(chǎn)（奶牛、小反芻動(dòng)物和豬）以及一些人類生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究均具有極其重要的影響。卵泡功能受胰島素和胰島素-葡萄糖系統(tǒng)直接或間接調(diào)控。因此，在顆粒細(xì)胞中，胰島素信號(hào)通過Akt1、FOXO1 和FOXO3 傳導(dǎo)，能夠增強(qiáng)類固醇生成和卵巢發(fā)育。Akt1 增強(qiáng)胰島素通過己糖胺途徑刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，卻抑制類固醇生成。膜細(xì)胞研究中證實(shí)胰島素信號(hào)通過Akt1能刺激磷酸二酯酶（PDE）抑制cAMP降解，并因此增強(qiáng)雄激素生成，胰島素在Akt1/FOXO1 作用下可刺激類固醇生成，通過mTOR或ERK途徑能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成，并抑制細(xì)胞凋亡。

卵泡發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。大量試驗(yàn)揭示，胰島素/FOXO1 途徑似乎對(duì)卵泡階段性發(fā)育具有特異性效應(yīng)：小卵泡能夠刺激顆粒細(xì)胞增殖；中等大小的腔卵泡能夠刺激類固醇生成；排卵時(shí)閉鎖的卵泡受到刺激。但目前關(guān)于調(diào)控階段性、特定效應(yīng)的報(bào)道相對(duì)罕見，因而針對(duì)FOXO1調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究和完善。本文綜述了胰島素-葡萄糖信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制，挖掘胰島素-葡萄糖信號(hào)途徑影響哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育重要信息，以期為哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域的相關(guān)研究提供一定參考。