戴利銘，李嵐嵐，劉一賢，施玉萍，蔡志英

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所/云南省天然橡膠可持續(xù)利用研究重點(diǎn)實(shí)驗室（籌）/天然橡膠良種選育與栽培技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 景洪 666100）

根病是限制國內(nèi)橡膠單產(chǎn)提高的關(guān)鍵因子之一，在我國膠園發(fā)病率2%以上［1］。我國橡膠樹（Hevea brasiliensis）上發(fā)現(xiàn)的根病有7 種，分別為紅根病、褐根病、紫根病、臭根病、白根病、黑根病和黑紋根病，其中紅根病發(fā)病率最高［2］。紅根病是 由 橡 膠 樹 靈 芝 [Ganoderma pseudoferreum（Wakef.）Over. et Steinm]侵染引起的橡膠樹根部病害［3］，橡膠樹受到該病菌侵染后，頂端葉片變小，葉蓬蓬距縮短，呈傘狀，病樹中后期樹頭有條溝，常見棗紅色或紅黑色菌膜。病根表面平，附著一層泥沙，用水較易洗掉，洗凈后常見棗紅色革質(zhì)菌膜。病根木材濕腐、松軟，呈海綿狀，皮層和木質(zhì)部間有一層白色到深黃色腐竹狀菌膜［4］。

相關(guān)研究表明，病原菌侵染植物能夠改變植株根際土壤、莖稈以及葉際微生物群落結(jié)構(gòu)。劉海洋等［5］研究不同發(fā)病程度的黃萎病棉田土壤真菌群落，發(fā)現(xiàn)重病棉田土壤真菌OTU 數(shù)量、豐度均高于輕病或無病田，真菌多樣性卻較低。周凌云等［6］研究不同茶白星病病情等級下茶葉葉際細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)病等級茶樹葉片上的優(yōu)勢門類均為酸桿菌門、擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。羅路云等［7］研究不同白粉病病情等級下南瓜葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)病等級南瓜葉片上的優(yōu)勢門均是放線菌門、擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。

作物根部土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成變化能反映土壤生態(tài)現(xiàn)狀及變化趨勢，對作物健康十分重要。而根際代謝物是研究植物根系中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類、激素等，這些代謝物對植物的生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境起著重要的作用。根際內(nèi)源性小分子的變化能反映蛋白、生物基因、外環(huán)境等多因素作用下的綜合效應(yīng)［8］，對根際代謝物的分析有助于理解土壤生物之間化學(xué)信號交流的生物學(xué)過程。

宏基因組學(xué)是一門研究環(huán)境中全部遺傳物質(zhì)的學(xué)科，它為未培養(yǎng)微生物的發(fā)現(xiàn)、尋找新功能基因、活性物質(zhì)開發(fā)和微生物多樣性研究提供更全面的遺傳信息［9-14］。代謝組學(xué)是對生物體所有代謝物進(jìn)行定量分析［15-16］，根際代謝物的變化可為研究代謝通路、生物代謝標(biāo)志物、酶活性的變化等提供依據(jù)。本研究基于高通量測序和代謝組技術(shù)對采自云南省景洪市紅根病橡膠樹和健康橡膠樹根際土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝物進(jìn)行了研究，以期揭示橡膠樹感染紅根病后根際土壤中微生物和代謝物的變化情況，探尋該病害發(fā)生與危害的微生態(tài)機(jī)制，為采取生物技術(shù)措施確保橡膠林土壤健康提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2020年9月于云南省景洪市勐養(yǎng)榕樹1 組橡膠林（101°88′41″E，22°08′48″N）紅根病發(fā)生林地（1998年種植的‘GT1’）進(jìn)行樣品采集。隨機(jī)選取3 株感染紅根病的橡膠樹，鏟除表層土壤后收集須根1 cm 范圍的土壤，此即為感染紅根病的根際土壤組（M）樣品；在該地區(qū)未發(fā)病的橡膠樹中隨機(jī)選取3 株無明顯病癥的健康植株，采集根際土壤樣品，即為健康株根際土壤組（C）樣品。樣品采集后放入液氮中速凍低溫保藏，運(yùn)回實(shí)驗室后置于-80℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑和儀器

土壤樣品DNA 提取試劑盒，上海玉博生物科技有限公司；PCR 儀，Applied Biosystems 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 DNA 提取及宏基因組測序

稱取充分混勻的土壤樣品0.50 g，采用土壤樣品DNA 提取試劑盒提取DNA。利用NanoDrop 2000 檢測抽提DNA 的濃度和純度。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后送上海百趣公司進(jìn)行Hiseq 高通量測序（Illumina PE150）。

1.4 代謝組樣品制備及檢測

將采集后的樣本液氮速凍后送上海百趣公司進(jìn)行GC-TOF-Ms 代謝組學(xué)檢測。GC 分析條件:色譜柱Agilent DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；色譜柱升溫程序為初始溫度50℃，保持1 min，以10℃/min 升至310℃，并保持8 min；進(jìn)樣口溫度為280℃；載氣、輔助氣均為氦氣，載氣流速為1 mL/min（恒流），不分流進(jìn)樣。MS 分析條件為EI 離子源，電離電壓70 eV；離子源溫度為250℃；傳輸線溫度為280℃；全掃描質(zhì)譜，掃描范圍為50～500 m/z。

1.5 宏基因組測序的生物信息學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)使用Bowtie2 V2.2.4 軟件進(jìn)行質(zhì)控，過濾reads 尾部質(zhì)量值低于20 的堿基，然后去除質(zhì)控后50 bp 以下的reads 以及含N 堿基的reads。根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分樣品，調(diào)整序列方向，使用MEGAHIT 軟件進(jìn)行序列拼接。使用DIAMOND 軟件將Unigenes 與從NCBI 的NR 數(shù)據(jù)庫中抽提出的細(xì)菌、真菌、古菌和病毒序列進(jìn)行比對；采用KEGG［17］、eggNOG［18］、CAZy［19］數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果并繪制功能基因的分類柱狀圖。

1.6 代謝組數(shù)據(jù)分析

GC-MS 數(shù)據(jù)采用ChromaTOF 軟件（V 4.3x，LECO）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。并與Fiehn 數(shù)據(jù)庫比對，對相似度大于70%的化合物予以認(rèn)定，將已鑒定的物質(zhì)的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后導(dǎo)入統(tǒng)計軟件SIMCA-P 16.0.2 進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal to partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），通過載荷圖、模型的變量重要性因子（Variable importance factor，VIP）和方差分析（nalysis of variance，ANOVA）尋找在健康土壤和發(fā)病土壤間差異顯著的代謝物。

1.7 宏基因組與代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)分析

獲取宏基因組差異菌群和代謝組學(xué)差異代謝物的含量信息，利用Spearman 算法進(jìn)行相關(guān)性計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤宏基因組物種注釋分析

在門分類上，健康和發(fā)病土壤中共檢測到156個菌門，1 977 個屬，其中發(fā)病土壤特有159 個屬，健康組特有的屬122 個。從門分類層級的相對豐度表出發(fā)，選取各樣品中最大相對豐度排名前10的物種，并將其余的物種設(shè)置為Others，繪制出門水平的相對豐度柱形圖（圖1）。發(fā)現(xiàn)相對豐度最高的是酸桿菌門（Acidobacteria），在發(fā)病土壤和健康土壤中均占比30%以上，表明酸桿菌門為優(yōu)勢菌群，在各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位。其次是放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），相對豐度在14.00%～21.00%，綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度在3.4%～3.9%。其余芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、Candidatus Rokubacteria、裝甲菌門（Armatimonadetes）的相對豐度均小于3.00%。和健康土壤相比，發(fā)病土壤中酸桿菌門相對豐度高出5.11%，放線菌門和變形菌門相對豐度明顯減少，減少值分別為2.8%和5.3%。

圖1 組間物種相對豐度柱形圖（門）

從屬分類層級的相對豐度表出發(fā)，選取在各樣品中最大相對豐度排名前20 的物種，并將其余的物種設(shè)置為Others，繪制屬水平相對豐度柱形圖（圖2）。結(jié)果顯示健康土壤中相對豐度最高的是根瘤菌屬（Bradyrhizobium），為1.87%，其次為鏈霉菌屬（Streptomyces）和CandidatusSolibacter，分別為1.73%和1.23%；而發(fā)病土壤中相對豐度最高的是鏈霉菌，為1.63%，其次為CandidatusKoribacter和克特多桿菌（Ktedonobacter），分別為1.33%和1.35%。兩種土壤樣本中相對豐度排名前20 的屬相同，均為短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、克特多桿菌（Ktedonobacter）、鏈霉菌屬、CandidatusSolibacter、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、CandidatusKoribacter、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、脫氮單孢菌屬（Pedosphaera）、Edaphobacter、弗蘭克氏菌屬（Frankia）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、嗜熱菌屬（Thermogemmatispora）、鹽桿菌屬（Caulobacter）、擬無枝菌酸菌屬（Amycolatopsis）、Pseudonocardia、顆粒菌屬（Granulicella）、嗜酸鏈球菌屬（Streptacidiphilus）、小單孢菌屬（Micromonospora）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、非洲諾卡氏菌屬（Nonomuraea）。

圖2 組間物種相對豐度柱形圖（屬）

紅根病是由橡膠樹靈芝侵染引起的橡膠樹根部病害，而本次研究相對豐度排名前20 的屬物種均不包含靈芝屬。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在患病植株根際土壤和健康植株根際土壤中均有檢測到紅根病病原菌Ganoderma和褐根病病原菌Phellinus，說明云南省景洪市勐養(yǎng)榕樹1 組橡膠林地中無明顯病癥的植株根部健康已經(jīng)受到病原菌的威脅。

2.2 土壤宏基因組功能注釋分析

2.2.1 KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋

將測序結(jié)果與KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出注釋到碳水化合物代謝和氨基酸代謝相關(guān)的功能基因數(shù)目最多。發(fā)病土壤和健康土壤在碳水化合物代謝功能方面占比分別為5.0%和4.7%，在氨基酸代謝功能方面占比分別是4.5%和4.2%，兩者在生命活動相關(guān)的基本功能方面無明顯差異。

圖3 KEGG功能注釋相對豐度柱形圖

2.2.2 CAZY 數(shù)據(jù)庫注釋

將測序結(jié)果與CAZy 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析得到圖4，分析發(fā)現(xiàn)主要涵蓋6 大類：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl Transferases，GTs），多糖裂合酶（Polysaccharide Lyases，PLs），碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs），輔助氧化還原酶（Auxiliary Activities，AAs）和碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs）。大多數(shù)基因集中在糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶兩種功能中，這可能與微生物對能量的攝取和運(yùn)用有關(guān)，絕大多數(shù)細(xì)菌都是以糖作為碳源物質(zhì)。在碳水化合物代謝方面，發(fā)病土壤和健康土壤沒有顯著差異。

圖4 CAZy功能注釋相對豐度柱形圖

2.2.3 NOG 數(shù)據(jù)庫注釋

將測序結(jié)果與NOG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析得到圖5，其功能主要包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)，組蛋白激酶，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，脫氫酶，轉(zhuǎn)移酶，絲蘇氨酸蛋白激酶，氧化還原酶和乙醇脫氫酶。在這些功能中和轉(zhuǎn)、運(yùn)激酶、氧化還原相關(guān)的功能豐度很高，說明土壤微生物的活力比較高，處于比較活躍的狀態(tài)。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（通透酶）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在發(fā)病土壤中均高于正常土壤，其他功能均低于正常土壤。

圖5 eggNOG 功能注釋相對豐度柱形圖

2.3 差異代謝物篩選與層次聚類分析

從發(fā)病土壤對健康土壤的差異代謝物篩選獲得9 大差異代謝物，包括蠟酸（Cerotinic acid）、甘油磷酸酯（D-（glycerol 1-phosphate）、膽固醇（Cholesterol）、膽甾烷-3,5，6-三醇（Cholestane-3beta，5alpha，6beta-triol）、富馬酸（fumaric acid）、豆甾醇（Stigmasterol）、N-環(huán)己基甲酰氨（N-cyclohexylformamide）、花生四烯酸（Arachidonic acid）和N-乙?；?5-羥色胺（N-Acetyl-5-hydroxytryptamine）。

將差異代謝物進(jìn)行聚類熱圖分析得到圖6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)花生四烯酸和N-乙酰基-5-羥色胺從正常土壤到發(fā)病土壤含量為下降趨勢，蠟酸、甘油磷酸酯、膽固醇、膽甾烷-3，5，6-三醇、富馬酸、豆甾醇、N-環(huán)己基甲酰氨這7 個物質(zhì)從正常土壤到發(fā)病土壤含量呈上升趨勢。

圖6 發(fā)病土壤對健康土壤的層次聚類分析熱力圖

2.4 差異代謝物與差異菌屬的關(guān)聯(lián)分析

為明確土壤中代謝物的改變與土壤菌群改變之間的關(guān)系，進(jìn)一步對代謝組學(xué)獲得的差異代謝物和宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)獲得的菌群進(jìn)行了聯(lián)合分析（圖7）。結(jié)果顯示，土壤中差異代謝物含量與其土壤菌群中多種細(xì)菌豐度顯著相關(guān)。例如，在發(fā)病土壤中呈顯著性降低的代謝物花生四烯酸含量與Runella和Candidatus Symbiobacter屬豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，卻與Acidiphilium、Belnapia、CandidatusEndobugula、Haematobacter、Lentibacillus、Oerskovia、Skermanella、Thioflexothrix豐度呈顯著正相關(guān)。同時發(fā)病土壤中呈顯著性降低的代謝物N-乙酰基-5-羥色胺與Caldivirga、CandidatusSymbiobacter豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，卻與Xenophilus豐度呈顯著正相關(guān)。

圖7 差異代謝物與差異菌屬的相關(guān)性熱力圖

與健康土壤相比，發(fā)病土壤中的蠟酸、甘油磷酸酯、膽固醇、膽甾烷-3，5，6-三醇、富馬酸、豆甾醇、N-環(huán)己基甲酰氨等7 種代謝物的含量顯著增加，其中蠟酸、膽甾烷-3，5，6-三醇含量與Acidiphilium、Acidisphaera、Basidiobolus、Belnapia、Catenibacterium、Cohaesibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum、Skermanella豐度呈顯著正相關(guān)，卻與CandidatusProtochlamydia、Acinetobacter豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。膽固醇含量與Acidisphaera、Basidiobolus、Cohaesibacter、Granulibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，卻與Acinetobacter豐度呈顯著正相關(guān)。甘油磷酸酯含量與Belnapia、Basidiobolus、Granulibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum、Xenophilus豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，卻與Acinetobacter、Caldivirga呈顯著正相關(guān)。富馬酸含量與Basidiobolus、Cohaesibacter、Granulibacter、Magnetospirillum、Microterricola豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，卻與Acinetobacter 豐度呈顯著正相關(guān)。豆甾醇含量與Acetobacter、Acidisphaera、Basidiobolus、Catenibacterium、Cohaesibacter、Haematobacter、Thioflexothrix豐度呈顯著正相關(guān)。N-環(huán)己基甲酰氨含量與Acidiphilium、Acidisphaera、Belnapia、Catenibacterium、Cohaesibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum、Skermanella豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，卻與Runella、CandidatusProtochlamydia豐度呈顯著正相關(guān)。

3 小結(jié)與討論

本研究對小勐養(yǎng)植膠區(qū)紅根病發(fā)生林地的健康和發(fā)病的土壤進(jìn)行了調(diào)查取樣，通過宏基因組測序并分析了土壤宏基因組物種組成。在門分類上，健康和發(fā)病土壤中共檢測到156 個菌門，1 977 個屬，其中發(fā)病土壤特有的屬159 個，健康組特有的屬122 個。在門分類水平，酸桿菌門的微生物為發(fā)病土壤相對豐度最高的門，在土壤占比為30%以上，在各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位。發(fā)病土壤中的酸桿菌門微生物豐度比健康土壤中高5.11%，而放線菌門和變形菌門豐度低于健康土壤。在屬分類水平，健康土壤中相對豐度最高的是根瘤菌屬，其次為鏈霉菌屬，而發(fā)病土壤中相對豐度最高的為鏈霉菌屬。根瘤菌屬為有益菌，不僅與豆科植物共生結(jié)瘤固氮，促進(jìn)植物生長，還可增強(qiáng)植物抗病、抗逆性［20］。KEGG 功能注釋發(fā)現(xiàn)發(fā)病土壤和健康土壤在碳水化合物代謝、氨基酸代謝功能這兩個屬于生命活動的基本功能方面無明顯差異。NOG 數(shù)據(jù)庫注釋發(fā)現(xiàn)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶在發(fā)病土壤中均高于正常土壤。

利用GC-MS 非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對感病與健康根際土壤代謝成分進(jìn)行測定，與健康土壤相比，發(fā)病土壤中的蠟酸、甘油磷酸酯、膽固醇、膽甾烷-3，5，6-三醇、富馬酸、豆甾醇、N-環(huán)己基甲酰氨等7 種代謝物含量顯著增加；而花生四烯酸和N-乙?；?5-羥色胺等2 種代謝物含量顯著降低。值得注意的是，余鑫平研究發(fā)現(xiàn)小花假澤蘭中的豆甾醇具有抑菌活性［21］，而豆甾醇與Acetobacter、Acidisphaera、Basidiobolus、Catenibacterium、Cohaesibacter、Haematobacter、Thioflexothrix呈顯著正相關(guān)，推測植物患病會引起以上菌株豐度的改變。

本次研究中，紅根病和褐根病病原菌在患病植株根際土壤和健康植株根際土壤中都有發(fā)現(xiàn)，說明云南省景洪市勐養(yǎng)榕樹1 組橡膠林地中無明顯病癥的植株根部健康已經(jīng)受到病原菌的威脅，建議該地區(qū)重視，做好防治工作。