王 偉, 邱志楠, 李 爽, 白向東,劉桂豐,姜 靜

(林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)),黑龍江 哈爾濱 150040)

CRISPR/Cas9技術(shù)是繼鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、TALEN核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALENs)之后的第3代基因編輯技術(shù)[1-2],該技術(shù)與ZFNs/TALENs技術(shù)比較,其操作方法簡(jiǎn)便,敲除基因效率更高,編輯更精準(zhǔn),大大降低了編輯脫靶機(jī)率。目前已成功地在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianabenthamiana)、棉花(Gossypiumhirsutum)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、蘋果品種(Malusprunifolia‘Seishi’ ×M.pumilavar.paradisiaca‘M.9’)和葡萄(Vitisvinifera)等植物基因組定點(diǎn)編輯研究中廣泛應(yīng)用。大量研究表明該技術(shù)是作物品質(zhì)改良、提高產(chǎn)量及抗逆性的強(qiáng)大工具[3-7]。通常CRISPR/Cas9技術(shù)主要采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在T-DNA的驅(qū)動(dòng)下,將Cas9蛋白-gRNA-核糖核蛋白以及選擇標(biāo)記基因?qū)胧荏w細(xì)胞,進(jìn)而通過選擇培養(yǎng)將非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死,而轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于獲得標(biāo)記基因的抗性而成活下來,最終獲得基因組編輯植物。此類方法在獲得基因組編輯的植物基因組中仍含有插入的T-DNA(包括載體及標(biāo)記基因)序列等[3],篩選標(biāo)記基因雖為轉(zhuǎn)化植株的篩選提供了方便,但一旦完成篩選得到所需要的轉(zhuǎn)化植株之后,選擇標(biāo)記基因就變成多余的,甚至有潛在危害[8]。近年來,科研人員開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)的無(wú)外源基因整合的基因編輯系統(tǒng),即在體外將Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)行預(yù)組裝形成復(fù)合物,然后通過微彈轟擊轉(zhuǎn)化方式直接導(dǎo)入受體細(xì)胞核中,進(jìn)而完成對(duì)靶基因的定點(diǎn)突變[9]。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是避免了外源基因及選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因插入的干擾。目前,已在擬南芥、煙草和水稻等植物中實(shí)現(xiàn)了無(wú)T-DNA插入的定向基因編輯,獲得的基因編輯突變體與天然存在的遺傳變異毫無(wú)區(qū)別[10]。因此,探究無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)之一。

確定適合標(biāo)記靶基因是探究無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的第一步。廣泛存在于植物中的GLK轉(zhuǎn)錄因子屬于GARP超家族中的一員,在調(diào)控葉綠體發(fā)育等方面起著十分關(guān)鍵的作用[11]。該轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控核定位的葉綠體蛋白以及與光合作用相關(guān)基因的表達(dá)[12],研究證明,白樺glk缺失突變株、白樺BpGLK1干擾表達(dá)及銀中楊PaGLK1干擾表達(dá)株系的葉色均為鮮艷的黃綠色[13-14],不僅表明GLKs基因在調(diào)控植物葉綠素合成進(jìn)而影響葉色方面至關(guān)重要,同時(shí)也可以BpGLK1作為靶基因,其功能失活后可提供一個(gè)易于肉眼觀察的明顯葉色變化。因此,本研究以白樺為受體,利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)的無(wú)外源基因整合的基因編輯系統(tǒng),進(jìn)行BpGLK1特定靶點(diǎn)的定向編輯,研究結(jié)果可為創(chuàng)制林木無(wú)T-DNA插入突變體提供嶄新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白樺(Betulaplatyphylla×B.pendula)種子采自東北林業(yè)大學(xué)白樺強(qiáng)化種子園內(nèi)自由授粉的優(yōu)樹,將采收的種子晾干,去除苞片等雜質(zhì)后,塑料袋塑封后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR純化試劑盒(QIAGEN 28206),膠回收試劑盒(QIAGEN 28706),T7快速高產(chǎn)RNA合成試劑盒(NEB E2050S),BstEII(NEB R0162V),Cas9蛋白(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)由林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))姜立泉教授團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng),pAbAi質(zhì)粒(4 894 bp)由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種研究團(tuán)隊(duì)保存,金粒(Biorad)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1BpGLK1第1外顯子的克隆及重組載體的構(gòu)建

根據(jù)白樺BpGLK1(Bpev01.c0167.g0013.m0001)基因序列,在BpGLK1第1外顯子BpGLK1-E1(946 bp)序列前后設(shè)計(jì)上下游引物BpGLK1-E1-F.5′-CGGGGTACCGCTCACGAGCTGCCACT-3′;BpGLK1-E1-R.5′-ACGCGTCGACAGCTGCTCCACAGCTTGC-3′。以白樺DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得BpGLK-E1片段。用KpnI和SalI分別雙酶切pAbAi質(zhì)粒及BpGLK1-E1片段,酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接后并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),并送往擎科生物有限公司測(cè)序,獲得pAbAi-BpGLK1-E1重組質(zhì)粒。

1.2.2 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及gRNA的合成

利用CRISPR-direct網(wǎng)頁(yè)(http://crispr.dbcls.jp/)篩選特異靶點(diǎn)。在BpGLK1第1外顯子BpGLK1-E1(圖1)選定1個(gè)靶點(diǎn)序列,根據(jù)靶點(diǎn)序列合成BpGLK1-gRNA引物(表1),采用PCR技術(shù)合成gRNA的雙鏈DNA模板。反應(yīng)體系為:rTaq1 μL、10×PCR Buffer(Roche)5 μL (5 U/μL)、BpGLK1-gRNA引物2 μL(0.4 μmol/L)、BS6 2 μL(500 mmol/L)、T25-long 5 μL(10 μmol/L)、BS7 10 μL(10 μmol/L)、dNTP Mix 2 μL(2.5 mmol/L),加ddH2O補(bǔ)足體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性10 s,59℃退火10 s,72℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán),72 ℃ 30 s,16 ℃保溫,反應(yīng)結(jié)束即可獲得gRNA雙鏈DNA。隨后用T7快速RNA合成試劑盒合成gRNA,反應(yīng)體系中分別加入:NTP Buffer Mix 7.5 μL、BpGLK1-gRNA雙鏈DNA 8 μL、T7 RNA聚合酶1.5 μL,加水至總體積20 μL,充分混勻后37 ℃反應(yīng)4 h,即可獲得BpGLK1-gRNA。

表1 gRNA靶序列合成相關(guān)引物

下劃線序列為靶位點(diǎn)序列 The underlined sequence is the target site sequence。圖1 BpGLK1第1外顯子序列Fig. 1 BpGLK1 exon 1 sequence

1.2.3 CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)體外活性檢測(cè)

以pAbAi-BpGLK1-E1質(zhì)粒(長(zhǎng)度為5 840 bp)為模板(圖2),用BstEⅡ酶切后獲得線性化質(zhì)粒,隨后進(jìn)行體外活性檢測(cè)?；钚詸z測(cè)反應(yīng)體系:2 μL Cas9蛋白、2 μL gRNA、12 μL線性化的pAbAi-BpGLK1-E1質(zhì)粒、0.8 μL 1 mol/L(pH 7.5)磷酸緩沖液、1 μL(100 mmol/L) MgCl2、0.02 μL(1 mol/L)dDTT充分混勻,37 ℃下孵育1 h,1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)線性化pAbAi-BpGLK1-E1質(zhì)粒能否被剪切成兩條譜帶(其中1條譜帶長(zhǎng)度為BpGLK1-gRNA靶點(diǎn)到BstEII限制酶切位點(diǎn)約1 155 bp左右,另1條線性化質(zhì)粒為剩余部分約為4 685 bp),判斷Cas9蛋白活性及gRNA的精準(zhǔn)性。

圖2 pAbAi-BpGLK1-E1載體簡(jiǎn)圖Fig. 2 pAbAi-BpGLK1-E1 vector diagram

1.2.4 基因槍微彈的制備及轟擊白樺愈傷組織

將白樺種子用流水沖泡72 h后,在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒,隨后縱向切割種子,剝?nèi)シN皮,將其接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)中置于無(wú)光照條件下培養(yǎng),20 d左右即可獲得幼嫩的愈傷組織,用于基因槍法轟擊受體。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15]取30 mg金粉加入Eppendorf管,加入1 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))酒精,充分渦旋,靜置15 min,1 500 r/min離心5 min。棄上清,加入1 mL無(wú)菌水,渦旋充分,1 500 r/min離心5 min,進(jìn)行3次重復(fù)。加入1 mL的50%甘油,此時(shí)終濃度達(dá)到了60 mg/mL,4 ℃保存。CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein(RNP)的包裹,渦旋金粉母液5 min以打碎成團(tuán)的微粒。需要注意的是,微粒很容易下沉,每一槍吸取的時(shí)候都要重新振蕩重懸微粒。取50 μL 金粉懸液于1.5 mL Eppendorf管。依次加入CRISPR/Cas9 RNP復(fù)合物,在室溫(25 ℃)下將5 μL Cas9蛋白和5 μL gRNA(gRNA體外驗(yàn)證已獲得)混合,總體積為10 μL,50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亞精胺(現(xiàn)用現(xiàn)配,邊渦旋邊加入,每加完一樣試劑,振蕩2～3 s)。上述混好的樣品,渦旋1 min,冰上靜置1 min,重復(fù)3次。靜置10 min,10 000 r/min離心10 s,去上清。200 μL無(wú)菌水沖洗沉淀2次,10 000 r/min離心10 s,去上清。后用40 μL無(wú)菌水重懸微粒。制備包被Cas9蛋白+gRNA的基因槍微彈,采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Rad, 美國(guó)),爆破壓力為7 584.5 kPa,轟擊距離為12 cm,進(jìn)行白樺愈傷組織的轟擊。轟擊結(jié)束后將愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基(WPM +1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3)中,置于無(wú)光照條件下3～5 d后,隨后在1 500～2 000 lx條件下培養(yǎng)25 d左右,待愈傷組織產(chǎn)生不定芽后轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基(WPM +1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA),3 000～4 000 lx條件下培養(yǎng)25 d左右,每25 d更換繼代培養(yǎng)基。剪取高為1 cm左右的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(WPM+0.4 mg/L IBA)中進(jìn)行生根培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基中均添加200 g/L蔗糖及5.5 g/L瓊脂,培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃。

1.2.5 基因編輯株系的分子檢測(cè)

分別提取基因編輯株系組培生根苗的DNA, 以基因編輯株系葉片總DNA為模板,用特異引物BpGLK1-gRNA-F.CTCTCCAGTCTTCCTTCCGAT,BpGLK1-gRNA-R.CTGAAGGTGGCTGGCTATGT進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),并送往擎科生物有限公司測(cè)序,通過Bioedit軟件將測(cè)序結(jié)果與基因組序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pAbAi- BpGLK1-E1重組載體的獲得

以白樺基因組DNA為模板,用BpGLK1-E1兩端特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示,在1 000 bp處可見擴(kuò)增譜帶(圖3a),與預(yù)期的BpGLK1第1外顯子946 bp長(zhǎng)度吻合。進(jìn)而采用雙酶切技術(shù)分別對(duì)上述擴(kuò)增片段及pAbAi質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,經(jīng)T4酶連接后并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè),凝膠電泳結(jié)果顯示,在1 000 bp處可見擴(kuò)增譜帶,與預(yù)期的946 bp長(zhǎng)度吻合(圖3b),將pAbAi-BpGLK1-E1重組質(zhì)粒送往擎科生物公司測(cè)序,經(jīng)Bioedit比對(duì)后顯示BpGLK1-E1序列正確,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

a. BpGLK1-E1靶序列擴(kuò)增電泳圖electrophoretogram of BpGLK1-E1 target sequence amplification;M.Marker DL2000;1.水water;2. BpGLK1-E1序列 BpGLK1-E1 sequence;b.重組質(zhì)粒檢測(cè)PCR擴(kuò)增電泳圖譜 electropherogram of recombinant plasmid PCR detection;M.Marker DL2000;1. BpGLK1質(zhì)粒 BpGLK1plasmid;2.水water;3. pAbAi-BpGLK1-E1質(zhì)粒 pAbAi-BpGLK1-E1 plasmid。圖3 pAbAi-BpGLK1-E1重組載體獲得Fig. 3 Acquisition of pAbAi-BpGLK1-E1 recombinant vector

2.2 Cas9蛋白的核酸酶活性

以pAbAi-BpGLK1-E1質(zhì)粒載體為模板,采用BstEⅡ限制酶酶切得到線性化重組質(zhì)粒。進(jìn)而以線性pAbAi-BpGLK1-E1重組質(zhì)粒為模板(含有BpGLK1靶序列),在含Cas9蛋白及gRNA的緩沖液中反應(yīng)后(同時(shí)設(shè)置3組陰性對(duì)照:不加Cas9蛋白、不加gRNA、空載體),瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖4。

M.DL10000;1. gRNA-Cas9蛋白復(fù)合物 gRNA-Cas9 protein complex; 2. 無(wú)Cas9蛋白對(duì)照 no Cas9 protein;3. 空載(陰性對(duì)照)empty (negative control);4. 無(wú)gRNA對(duì)照no gRNA control。圖4 CRISPPR/Cas9靶位點(diǎn)活性檢測(cè)Fig. 4 Activity detection of CRISPPR/Cas9 target site

由圖4可知,1 155 bp左右可檢測(cè)到電泳譜帶,而3個(gè)對(duì)照組在1 155 bp左右則未見電泳譜帶,表明Cas9蛋白及gRNA復(fù)合體具有裂解活性。

2.3 白樺glkc基因編輯株系的獲得

以白樺成熟胚為材料,在無(wú)光照條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),25 d左右即可用于基因槍轟擊的受體。在基因槍參數(shù)設(shè)置為7 584.5 kPa爆破壓力,轟擊距離12 cm的條件下,用包被Cas9蛋白與gRNA(RNP)金粒轟擊白樺幼嫩愈傷組織,在分化培養(yǎng)過程中愈傷組織漸漸膨大(圖5a),隨后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d左右時(shí),可見長(zhǎng)高的不定芽。在繼代培養(yǎng)的不定芽中明顯可見葉色呈現(xiàn)黃綠色的編輯株系(命名為glkc)(圖5b),待30～40 d時(shí)與野生型白樺呈現(xiàn)明顯差異(圖5c、5d)。

a.愈傷組織callus;b.繼代培養(yǎng)的 glkc株系differentiated cultured glkc line;c.野生型白樺wild type;d. glkc株系glkc line。圖5 白樺glkc基因編輯株系的獲得Fig. 5 Acquisition of glkc gene editing line

2.4 glkc株系的分子檢測(cè)

以glkc株系的10株組培生根苗葉片總DNA為模板,用BpGLK1-gRNA-F、BpGLK1-gRNA-F特異引物對(duì)BpGLK1-E1片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示:glkc株系在900 bp左右有擴(kuò)增譜帶(圖6a),進(jìn)而將擴(kuò)增譜帶回收后對(duì)其中5株進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過Bioedit軟件比對(duì),發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果一致,glkc編輯株系在BpGLK1基因的315～332 bp處有18個(gè)堿基缺失的純合突變(圖6b),結(jié)果說明,獲得的glkc株系為BpGLK1缺失突變株。

a.BpGLK1-E1序列擴(kuò)增電泳圖譜electrophoretogram of BpGLK1-E1 target sequence amplification;M.Marker DL2000; 1—10. glkc株系組培生根苗 rooted seedling of glkc line by tissue culture; b.glkc基因編輯株系測(cè)序比對(duì)結(jié)果sequencing comparison result of glkc gene editing line。圖6 白樺glkc株系的分子檢測(cè)Fig. 6 Molecular detection of glkc line

3 討 論

近年來興起的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由于能夠精準(zhǔn)進(jìn)行基因編輯,已在基因工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。以往人們主要采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或直接轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA及gRNA等方法將Cas9蛋白和gRNA導(dǎo)入細(xì)胞,其中,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可能導(dǎo)致外源基因(T-DNA或抗性基因)的插入[10];而直接轉(zhuǎn)染Cas9 mRNA 和gRNA的方式雖然避免了外源基因插入的發(fā)生,但存在著RNA易降解等問題[16]。RNP技術(shù)是近年興起的直接將Cas9蛋白和gRNA復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞的新技術(shù),即Cas9蛋白與gRNA在試管中孵育,通過靜電互作組裝形成Cas9/gRNA復(fù)合物(RNP)[17],導(dǎo)入細(xì)胞后即可發(fā)揮其基因編輯功能。RNP技術(shù)中體外表達(dá)的Cas9蛋白的活性和gRNA的精準(zhǔn)性非常重要,因此,通常在進(jìn)行基因編輯前需要對(duì)其進(jìn)行活性檢測(cè)。本研究檢測(cè)顯示,體外表達(dá)的Cas9蛋白具有活性,gRNA也具有定點(diǎn)編輯功能。

植物中主要采用微粒轟擊或聚乙二醇(PEG)將Cas9/gRNA 復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞,例如,Woo等[10]通過轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9 RNPs進(jìn)入原生質(zhì)體,獲得了基因組修飾的萵苣(Lactucasativa)。在擬南芥、煙草、矮牽牛(Petuniahybrid)、葡萄藤和蘋果的原生質(zhì)體中也獲得了基因編輯突變體,但沒有再生突變植株[18-19]。白樺作為樹木,相對(duì)模式植物及農(nóng)作物而言,研究比較滯后,從原生質(zhì)體再生植物仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。另外,對(duì)于一些大粒種子的小麥(Triticumaestivum)、玉米等作物通常以未成熟胚為受體,利用微粒轟擊將CRISPR/Cas的核糖蛋白R(shí)NP導(dǎo)入植物組織細(xì)胞中[9, 20]。按前人經(jīng)驗(yàn)采用種子胚是一條有效途徑,而白樺種粒較小(長(zhǎng)寬僅為1.5和1 mm),去除種皮操作過程較費(fèi)時(shí),故此,本研究通過將少量的種子胚在暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行愈傷誘導(dǎo),培養(yǎng)獲得大量的松散愈傷組織,以此愈傷組織為受體利用基因槍將CRISPR/Cas核糖蛋白(RNP)微粒導(dǎo)入白樺細(xì)胞中,經(jīng)過分化培養(yǎng),即可獲得白樺glkc編輯株系。本研究利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白的無(wú)外源基因整合的基因編輯系統(tǒng),以白樺合子胚誘導(dǎo)的愈傷組織為受體,采用微粒轟擊技術(shù)進(jìn)行BpGLK1定向誘變,獲得了glkc編輯突變株,為創(chuàng)制林木無(wú)T-DNA插入突變體提供了新線索。該項(xiàng)研究?jī)?yōu)勢(shì)在于這種無(wú)T-DNA插入的無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化方法,不需要經(jīng)過有性雜交和自交將轉(zhuǎn)入的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和編輯的靶位點(diǎn)編輯基因從個(gè)體中分開,可以在T0代中生成不含外源DNA的經(jīng)過編輯的基因編輯株系。

研究證明,GLK基因家族成員在調(diào)控植物的葉綠體發(fā)育及葉綠素合成等方面至關(guān)重要,例如,擬南芥AtGLK1和AtGLK2雙突變體葉片表現(xiàn)為葉綠素含量降低,呈現(xiàn)黃色[21],在番茄(Solanumlycopersicum)中SIGLK1抑制表達(dá)株系其葉色呈現(xiàn)黃綠色,其葉綠素含量較對(duì)照株系降低[22]。對(duì)白樺、銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)的研究也顯示,BpGLK1基因的缺失及干擾表達(dá)可通過影響葉綠體發(fā)育進(jìn)而導(dǎo)致葉片葉綠素含量降低,葉片呈現(xiàn)鮮艷黃綠色[12-13, 23]。glkc突變株則不同,該株系通過CRISPR/Cas9編輯后,在BpGLK1基因的315～332 bp處有18個(gè)堿基的缺失,是由于堿基的缺失而導(dǎo)致BpGLK1基因編碼蛋白功能發(fā)生改變,該基因缺失突變產(chǎn)生新的未知蛋白,但從獲得的glkc編輯株系生長(zhǎng)來看,這種突變是不利突變,glkc突變株的組培無(wú)根苗在生根培養(yǎng)基中生根能力較弱,不定根數(shù)量較少,在生根過程中苗木葉片漸漸變?yōu)榘咨?最后葉片干枯后衰老死亡。BpGLK1基因序列分析顯示,該基因共有6個(gè)外顯子,本實(shí)驗(yàn)是在第1外顯子處設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn),后續(xù)還需在其他5個(gè)外顯子處設(shè)計(jì)靶位點(diǎn),找到不影響白樺突變株系生長(zhǎng)的編輯靶位點(diǎn)。