黃 赫，趙文嘉，趙 磊，王若冰，包玉龍，范英蘭，張 瑜，張洪瀛，甘 雨，朱竟赫*

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，沈陽 110034；2. 遼寧省中醫(yī)藥研究院中藥藥理室，沈陽 110034；3. 遼寧省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，沈陽 110034）

TLR（Toll-like receptor）是識別細(xì)菌、病毒等病原體的關(guān)鍵受體[1-2]。TLR7 是TLR 家族中識別單鏈病毒RNA（ssRNA）的關(guān)鍵成員[1-3]。TLR7 通過MyD88 依賴的途徑激活NF-κB，觸發(fā)趨化因子和炎癥細(xì)胞因子，并激活TGF-β 活化激酶1（TAK1）、IL-1 受體相關(guān)激酶（IRAK）和TNF 受體相關(guān)因子6（TRAF6）[4]。TLR7/MyD88信號通路既參與免疫調(diào)節(jié)，又能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)睡眠功能。失眠屬于影響人類生理和心理健康的常見疾病，其病因可分為實(shí)證和虛證所致。中醫(yī)常采用實(shí)則瀉之，虛則補(bǔ)之的治則。射干具有瀉火、解毒、散血、消痰之功效，可對抗實(shí)證失眠。前期研究結(jié)果顯示，射干制劑具有戊巴比妥鈉協(xié)同作用等，然而其作用機(jī)制不十分明確。本研究從瀉火安神的角度，應(yīng)用分子生物學(xué)、行為學(xué)測量系統(tǒng)、腦電圖技術(shù)和數(shù)理統(tǒng)計等手段與方法探討射干制劑對PCPA 所致失眠癥的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，體質(zhì)量180 ～220 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。動物飼養(yǎng)于遼寧天一技術(shù)有限公司[動物使用許可證號：SYXK（遼）2020-0005]，環(huán)境溫度21 ～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物與試劑

射干提取物由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，每粒膠囊含內(nèi)容物0.30 g，1 g 內(nèi)容物相當(dāng)于0.33 g 提取物（批號：20200402）；朱砂安神丸由北京御生堂集團(tuán)石家莊制藥有限公司提供（批號：141007）；地西泮片由上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)（批號：1420060）。對氯苯丙氨酸（PCPA）由SIGMA 公司生產(chǎn)（批號：SHBD9168V）；動物組織總RNA 提取試劑盒（帶gDNA 清除柱）（貨號RE-03014）購自成都福際生物科技有限公司；羅氏SYBR GREEN 染料（貨號4913914001）購自羅氏公司。

1.3 儀器設(shè)備

EthoVision 大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)，由NOLUDS公司提供；JJ2000B 電子天平，由江蘇常熟雙杰電子天平有限公司生產(chǎn)；PL83-S 型天平，由梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；TD5A-WS 臺式離心機(jī)，由長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；羅氏LightCycler480 實(shí)時定量PCR儀，由Roche公司生產(chǎn)；Thermo Scientific 臺式高速冷凍離心機(jī)，由Thermo Scientific 公司生產(chǎn)。

1.4 射干提取物對大鼠自主活動的影響

各組在連續(xù)給藥7 d，末次給藥 1 h 后，放于自主活動箱內(nèi)，攝像頭記錄其10 min 內(nèi)自主活動錄像，用75%酒精消毒除去自主活動箱內(nèi)前1 個大鼠留下的氣味，使各組之間不相互干擾，屋內(nèi)保持安靜。應(yīng)用EthoVision 大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)比較空白組、模型對照組、射干低劑量組、射干中劑量組、射干高劑量組、朱砂安神丸組、地西泮組的實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)，包括移動距離、移動時間、中心區(qū)頻率等。

1.5 試劑盒提取大鼠腦組織mRNA

取新鮮組織每20 mg 左右加入500 μL Buffer RL1，使用玻璃勻漿器將組織研磨均勻；將研磨均勻的勻漿液轉(zhuǎn)移至DNA 清洗柱（DNA-cleaning column）中，12 000 r·min-1（13 400×g）離心 2 min。移除DNA-Cleaning Column，保留收集管內(nèi)上清液；向上述上清液（體積應(yīng)約為 500 μL）中加入1.6倍體積 Buffer RL2（使用前請確認(rèn)已按照說明加入無水乙醇），輕柔混勻；將700 μL 混合液轉(zhuǎn)移至RNA-only Column 中（純化柱放入收集管中），12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液；將純化柱放回收集管中，將剩余混合液全部加入純化柱中，12 000 r·min-1（13 400×g），離心1 min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入500 μL Buffer RW1，12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入700 μL Buffer RW2（使用前請確認(rèn)已按照說明加入無水乙醇），12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液，重復(fù)1 次；將純化柱放回收集管中，12 000 r·min-1（13 400×g）空管離心2 min，去掉離心柱中殘余的 Buffer RW2；將純化柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，向純化柱的膜中央滴加50 μL 已于65 ℃預(yù)熱的RNase-Free ddH2O（切勿將洗脫液添加到壓圈上，否則會損失較大體積的洗脫液），室溫放置2 min。12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，收集RNA 溶液。為提高RNA產(chǎn)量，可將離心得到的 RNA 溶液重新加至純化柱中，重復(fù)步驟1 次。

1.6 mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 反應(yīng)

5×PrimeScript Buffer（for Real Time）2.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL， Oligo dT Prime（50 μM）0.5 μL， Random 6 mers（100 μM）0.5 μL，Total RNA5 μL，RNase-Free ddH2O 1.5 μL，37℃15 min，85 ℃sec，4℃ +∞。

1.7 實(shí)時定量PCR 反應(yīng)

FastStart Universal SYBR Green Master 25 μL，上游引物（10 μM）1.5 μL，下游引物（10 μM）1.5 μL，ddH2O 17 μL，cDNA 5 μL；50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 cycles。利用各組目的基因的CT 值，以β-actin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT 法計算各組目的基因的相對表達(dá)量。引物序列：RAT TLR7F：GGAAACTGCCCTCGATGTT；RAT TLR7R：CCTGGAGGTTGCTCATGTT；RAT MYD88F：GAAGCGACTGATCCCTATCAAG；RAT MYD88R：CAAGTCAGCTCATCTTCCTCTC；RAT ACTINF：TCCCTGGAGAAGAGCTATGAG；RAT ACTINR：TCCATACCCAGGAAGGAAG。

1.8 射干制劑對PCPA 致失眠大鼠腦電波的影響

經(jīng)前期處理后的各組大鼠于第4 天開始給藥，其中空白對照組給予同體積蒸餾水，持續(xù)給藥7 d，在第6天經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉建立失眠大鼠模型。末次給藥后，無線電遙測系統(tǒng)技術(shù)記錄戊巴比妥鈉致失眠大鼠1 h 的腦電活動，應(yīng)用腦電信號分析睡眠時相并計算各組大鼠α 波百分比、β 波百分比、θ波百分比和δ 波百分比。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量結(jié)果符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時間點(diǎn)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 射干制劑對大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

見表1、圖1。

圖1 各組熱區(qū)圖圖像

表1 射干制劑對大鼠自主活動的影響（±s ，n = 10）

表1 射干制劑對大鼠自主活動的影響（±s ，n = 10）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別移動距離/cm移動速度/（cm·s-1）中心區(qū)頻率/次 中心區(qū)累計持續(xù)時間/s 中心區(qū)第一次潛伏期/s空白對照組1 958.27±849.37 3.26±1.39 3.47±2.9011.59±20.66 75.13±51.38模型對照組5 521.87±3 038.21## 9.18±5.11##23.88±12.79##12.12±15.23 37.36±28.18射干制劑低劑量組 3 810.76±1 787.42 6.43±3.0219.82±17.55 8.66±14.13 98.80±89.28射干制劑中劑量組 5 789.93±1 977.4310.02±3.9036.73±18.8715.88±17.83 86.91±92.87射干制劑高劑量組 3 272.63±793.58△ 5.42±1.59△12.39±6.02△20.53±24.16106.17±138.05朱砂安神丸組3 083.57±675.58△ 5.22±1.73△ 5.03±6.12△△10.05±16.02181.45±166.22△地西泮片組3 137.83±762.13△ 5.53±1.08△10.02±6.24△23.78±15.25 67.35±60.23

1.1 射干制劑對大鼠腦組織TLR7、MyD88 mRNA表達(dá)的影響

見表2。

表2 射干制劑對大鼠腦組織TLR7、MyD88 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 10）

表2 射干制劑對大鼠腦組織TLR7、MyD88 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 10）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

My D88 基因相對表達(dá)量空白對照組3.47±0.27 0.51±0.13模型對照組6.39±0.66 ##1.17±0.32 ##射干制劑低劑量組6.10±0.28△ 1.02±0.25△射干制劑中劑量組5.91±0.35△ 0.95±0.51△射干制劑高劑量組5.81±0.38△△0.83±0.18△△朱砂安神丸組4.11±0.62△△0.80±0.31△△地西泮片組3.84±0.16△△0.77±0.17△△組別TLR7 基因相對表達(dá)量

2.3 射干制劑對大鼠腦電波百分比的影響

見表3。

表3 射干制劑對大鼠腦電波百分比的影響（±s ，n = 10）

表3 射干制劑對大鼠腦電波百分比的影響（±s ，n = 10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05

組別時間點(diǎn)/minδ 波/%θ 波/%α 波/%β 波/%空白對照組600.59±0.700.38±0.240.88±0.481.51±0.74模型對照組600.65±0.36#0.62±0.301.51±0.603.10±1.59射干制劑低劑量組600.91±0.53△0.59±0.211.42±1.572.71±0.89射干制劑中劑量組601.09±0.79△0.65±0.301.42±0.693.13±1.58射干制劑高劑量組600.68±0.810.60±0.311.12±0.482.67±1.13朱砂安神丸組601.49±1.43△0.58±0.311.47±0.652.53±0.92地西泮片組601.25±0.89△0.71±1.431.88±1.103.81±2.75

3 討論

失眠的特征是難以開始睡眠、維持睡眠或清晨醒來，并伴有日間睡眠障礙。越來越多的證據(jù)[5-8]表明，失眠與一系列負(fù)面的健康后果相關(guān)，如精神障礙、心血管功能障礙、2型糖尿病和肥胖型等多因素相關(guān)。射干的散血、消痰之功效，可對抗實(shí)證失眠。本研究利用PCPA 誘導(dǎo)的大鼠模型，探討射干制劑對失眠的改善作用和分子機(jī)制。PCPA 造模后大鼠興奮度增高、白天活動量大，提示造模成功。Etho Vision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)詳細(xì)病理方面尚不清楚[9]。本次自主活動結(jié)果和熱區(qū)圖圖像結(jié)果顯示，射干制劑組、朱砂安神丸組及地西泮片組自主活動減少、興奮性受到抑制、睡眠/覺醒周期得到調(diào)節(jié)。朱砂安神丸組在中心區(qū)第一次潛伏期增多，與朱砂安神丸有顯著的安神效果相符合。

Toll樣受體（TLRs）是一種重要的模式識別受體，它可以識別病原體特定分子群中的高階結(jié)構(gòu)模式。除了免疫之外，不同的TLR 和TLR 相關(guān)信號分子被認(rèn)為有助于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性[10]。MyD88 是一種在細(xì)胞內(nèi)傳遞或橋接TLR介導(dǎo)的信號的適配器分子。MyD88 對于TLRs 配體觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要，它釋放促炎細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-1β 和其他促炎因子，如一氧化氮、環(huán)氧合酶、前列腺素E2 和三磷酸腺苷，其中大多數(shù)已被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)睡眠/覺醒周期時間[11]。據(jù)報道[1]，有些中藥通過調(diào)節(jié)TLR7/MyD88 信號通路抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮對流感病毒引起的急性肺損傷的體內(nèi)保護(hù)作用。此外，TLR7/MyD88 信號通路也由于其免疫調(diào)節(jié)作用而作為SLE 的治療靶點(diǎn)[12]。敲除多個TLRs 和信號因子的實(shí)驗(yàn)[13]證明了TLR7 在SARSCoV-2 感染誘導(dǎo)的炎癥信號中至關(guān)重要。TLR7/MyD88 信號通路在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。綜上所述，TLR7/MyD88 信號通路可能在調(diào)節(jié)失眠大鼠睡眠/覺醒周期方面有著重要意義。

本研究實(shí)時定量PCR 結(jié)果顯示，模型對照組與空白對照組相比，腦組織TLR7、My D88 相對表達(dá)量顯著升高，說明造模成功；同模型對照組相比，射干制劑低劑量組、射干制劑中劑量組TLR7、MyD88 mRNA 表達(dá)量均降低（P＜0.05），其中射干制劑高劑量組TLR7、 MyD88 的mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），推測無論是射干制劑、朱砂安神丸還是地西泮可能通過調(diào)節(jié)TLR7、MyD88 mRNA 表達(dá)從而改善睡眠，其中射干制劑高劑量組改善大鼠睡眠的改善最明顯。大鼠腦電圖結(jié)果顯示，低中劑量的射干制劑、朱砂安神丸和地西泮片可能是通過增加腦電圖δ 波百分比以改善大鼠睡眠。

綜上所述，射干制劑可調(diào)節(jié)失眠大鼠的睡眠/覺醒周期和增加腦電圖δ 波百分比來改善睡眠；且此作用可能是通過調(diào)節(jié)腦組織TLR7、MyD88 基因的表達(dá)發(fā)揮作用，其中射干制劑高劑量組療效最好。探討射干制劑的抗失眠藥效作用機(jī)制可初步闡明其所調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，以期找到明確藥效對應(yīng)的作用靶點(diǎn)，為抗失眠新藥研發(fā)提供支撐。