王曉晨 夏文龍 楊政 柴謙*

1 山東省食品藥品審評查驗中心 （山東 濟南 250014）

2 江蘇海智生物醫(yī)藥有限公司 （江蘇 南京 211500）

內(nèi)容提要： 重組膠原蛋白基于基因優(yōu)化修飾后的功能特點可制備成第二類重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料醫(yī)療器械產(chǎn)品，廣泛用于創(chuàng)面護理等生物組織工程領(lǐng)域。根據(jù)《重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊審查指導(dǎo)原則》，結(jié)合技術(shù)審評經(jīng)驗和部分審評案例，從產(chǎn)品不可吸收方法選擇和模型設(shè)計、物理阻隔層測試方法和效果評價、有效成分鑒別分析、有效成分含量測定的四方面梳理重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料的關(guān)鍵性能指標，介紹目前常采用的檢驗方法，提供一些證明重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料安全有效性能的設(shè)計方案，歸納分析不同鑒別含量測試方法的優(yōu)勢和缺點。以期為注冊申請人提供申報參考，開拓研究思路，為統(tǒng)一各省技術(shù)審評人員對重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料的審評標準和尺度提供幫助，促進第二類重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料產(chǎn)品的高質(zhì)量健康發(fā)展。

重組膠原蛋白是利用基因工程編輯技術(shù)，將含有人膠原特定類型基因編碼序列（至少含螺旋域的全長或部分序列）、不同類型膠原蛋白基因編碼的部分序列或人工設(shè)計的基因編碼作為模板，經(jīng)過拼裝剪輯、優(yōu)化組合等修飾過程重組表達得到的生物材料[1,2]。因能達到與動物組織提取的膠原蛋白相似的生物相容性和物理化學(xué)性能，重組膠原蛋白具有很強的親水性及吸液性，可以吸收組織滲出物，并為表皮細胞的遷移、增殖鋪墊支架[3]。基于編輯后的功能特點，重組膠原蛋白制備成液體、膏狀、凝膠、纖維、海綿等型式的第二類醫(yī)療器械產(chǎn)品廣泛用于創(chuàng)面護理、吸液止血、婦科黏膜修復(fù)等生物組織工程領(lǐng)域，尤其是重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料可用于意外傷害、手術(shù)、潰瘍等不同原因?qū)е碌恼嫫\層及其以上的淺表性小創(chuàng)傷、擦傷，為創(chuàng)面愈合提供良好的營養(yǎng)基礎(chǔ)，生物可降解性能更為突出，臨床應(yīng)用前景較傳統(tǒng)敷料更具潛力。

山東省食品藥品審評查驗中心承擔(dān)了國家藥品監(jiān)督管理局指導(dǎo)原則課題的研究工作，編制完成了《重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊審查指導(dǎo)原則》[4]（以下簡稱導(dǎo)則），2023年5月國家藥品監(jiān)督管理局面向公眾正式發(fā)布了該導(dǎo)則，明確了按第二類醫(yī)療器械管理的重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料，產(chǎn)品中所含成分不具有藥理學(xué)作用，不可被人體吸收，適用于非慢性創(chuàng)面及其周圍皮膚的護理。導(dǎo)則對重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料相關(guān)產(chǎn)品的技術(shù)審評、研發(fā)設(shè)計和注冊申報具有一定的指導(dǎo)規(guī)范作用。目前，重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料已成為眾多醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的熱點產(chǎn)品之一，部分企業(yè)對重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料的研發(fā)經(jīng)驗不足，對導(dǎo)則中要求的關(guān)鍵性能指標理解不到位或把握不準，找不到適用的檢驗方法，以至于在注冊申報過程中進度緩慢或面臨較大的困難。

本文以導(dǎo)則為主線，結(jié)合技術(shù)審評經(jīng)驗，匯總了導(dǎo)則中重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料產(chǎn)品專屬性較強的關(guān)鍵性能指標，對目前常采用的檢驗方法或設(shè)計方案展開對比分析，以期為醫(yī)療器械技術(shù)審評人員、醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊申報人員開闊思路、提供參考。

1.不可吸收試驗

導(dǎo)則明確要求重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊申報的非臨床資料應(yīng)提供產(chǎn)品不可被人體吸收的相關(guān)研究資料，如選擇或設(shè)計可以模擬臨床使用方式的試驗，用以證明產(chǎn)品的安全性和有效性。

1.1 試驗方式

目前國內(nèi)外皮膚修復(fù)愈合研究多采用體外試驗和體內(nèi)試驗兩種方式對醫(yī)療器械產(chǎn)品有效性進行研究。體外試驗通常以設(shè)計3D細胞模型試驗為典型代表，能展現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性和條件可控性，但試驗結(jié)果與體內(nèi)修復(fù)愈合效果之間缺乏相關(guān)性和說服力。體內(nèi)試驗則考慮到不同種屬、品系的動物，甚至同一動物不同解剖部位的皮膚結(jié)構(gòu)均不相同，皮膚通透性不同，根據(jù)急性、慢性和瘢痕性等不同研究類型構(gòu)建不同的實驗動物模型進行研究[5-7]。例如急性創(chuàng)傷修復(fù)模型具有創(chuàng)傷急、愈合快、有明確致病因素等特點，主要包括皮膚切線傷模型、皮膚切除傷模型、斷層皮創(chuàng)面愈合模型、燒（燙）傷創(chuàng)面愈合模型等[8]。因此體內(nèi)試驗與臨床預(yù)期用途創(chuàng)面有較好的一致性，更能貼合臨床使用需求合理評價醫(yī)療器械產(chǎn)品的有效性。

1.2 動物模型構(gòu)建

通常采用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、巴馬香豬、恒河猴等動物制作的新鮮離體皮膚，模擬重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料臨床使用的非慢性創(chuàng)面，分別建立急性創(chuàng)傷修復(fù)模型開展體外試驗研究[5-7]。出于動物權(quán)益保護的考慮，本方法為后續(xù)體外測試方法的建立和適用性，提供研究思路。

1.2.1 擦傷模型

家兔經(jīng)麻醉剃毛、常規(guī)消毒后，取綁裹砂紙的小木棒，在背部脫毛部位用反復(fù)摩擦，制造的創(chuàng)面盡量控制在（長×寬）3cm×3cm以內(nèi)，以紅腫或輕微滲血為宜，剔除皮下脂肪及組織沖凈備用[9]。

1.2.2 切割傷模型

巴馬香豬經(jīng)麻醉剃毛、常規(guī)消毒后，在背部脫毛部位用無菌針頭或手術(shù)刀片劃切，制備類似“井”字形（長×寬）3cm×3cm創(chuàng)面，以滲血為宜，剔除皮下脂肪及組織沖凈備用[10-12]。新鮮離體巴馬香豬創(chuàng)面模型見圖1。

圖1.新鮮離體巴馬香豬創(chuàng)面模型

1.2.3 化學(xué)試劑灼傷模型

大鼠剪去背部的毛，用浸滿8%硫化鈉的紗布敷于大鼠背部皮膚5min，除去背部絨毛，以潔凈紗布擦凈皮膚表面殘余硫化鈉，剝?nèi)”巢科つw[13,14]。

1.3 透皮吸收試驗結(jié)果

重組膠原蛋白的透皮吸收量，結(jié)合具體產(chǎn)品成分和配比，采用適宜方法，如可以選用高效液相色譜（或2，2'-聯(lián)喹啉二羧酸（BCA）法）利用累積透過量方程進行計算。例如測定10min、20min、40min、80min、160min等，得到不同時間點的累積通過量，結(jié)果顯示160min累積通過30.8%。建議結(jié)合產(chǎn)品臨床預(yù)期用途和使用方法，考察一定時間內(nèi)、質(zhì)量濃度及透皮吸收劑對重組膠原蛋白透皮吸收性的影響[14]。

2.物理阻隔層測試

導(dǎo)則明確重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊申報的非臨床資料如宣稱形成物理阻隔的保護層或具有成膜效果，應(yīng)提供適用于申報產(chǎn)品的成膜性研究測試資料。

2.1 物理阻隔層的形式

重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料因組成成分和配比不同，可以形成明顯揭除的膜和不可揭除的膜兩種形式的物理阻隔層，分別設(shè)計不同的試驗驗證醫(yī)療器械產(chǎn)品的有效性。

2.2 成膜可揭除的設(shè)計與評價

以包裝于鋁塑管的膏狀重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料為例，進行物理阻隔層評價。

示例（方法不限于此）：在（25±2）°C條件下，模擬臨床使用方式，將重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料從鋁塑管中擠到消毒的創(chuàng)面表面（參考1.2的方法創(chuàng)建新鮮離體模型），用清潔指腹均勻涂抹，晾干盡量無大幅度動作活動，按固定使用量及涂抹面積進行記錄成膜時間和流動狀態(tài)，例如揭下來的膜應(yīng)較完整且無肉眼可見的孔洞、涂抹后應(yīng)無創(chuàng)面敷料向四周流淌等。用掃描電子顯微鏡，放大固定倍數(shù)觀察膜的孔隙形貌特征。試驗方法：取產(chǎn)品溶液倒入培養(yǎng)皿，控制厚度待干燥成膜。用掃描電子顯微鏡觀察放大倍率400倍，可以觀察膜的孔隙形貌特征（見圖2）。

圖2.重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料成膜后掃描電子顯微鏡圖（×400）

2.3 成膜不可揭除的設(shè)計與評價

以包裝于聚乙烯推注器的液體重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料為例，進行物理阻隔層評價。

示例（方法不限于此）：（25±2）°C條件下，分別在家兔背部2個擦傷處涂抹碘伏，選其中1處再將敷料3～5滴均勻涂布碘伏上，待敷料晾干。同時以另外1處不涂覆敷料僅涂碘伏的傷口作對照。用流動的水沖洗兩處碘伏標記的傷口區(qū)域，對比兩處的碘伏狀態(tài)并記錄。例如可觀察到涂覆敷料處的碘伏在傷口保存完好，對照組碘伏沖洗殆盡等。

3.有效成分鑒別分析

導(dǎo)則明確重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊申報的技術(shù)要求制定有效成分鑒別的性能指標，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品實際情況，采用適宜的方法，以重組膠原蛋白為有效成分進行鑒別。

3.1 凝膠電泳法（SDS-PAGE）

性能指標示例描述（不限于此）為產(chǎn)品中重組膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖應(yīng)在**KDa以上有條帶；或是產(chǎn)品中重組膠原蛋白相對遷移率應(yīng)與**對照品（需就對照品的選擇提供合理性依據(jù)）相對遷移率一致，相對遷移率偏差應(yīng)不得過**%。參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）[15]四部通則0541電泳法中第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE法）作為測試依據(jù)。

3.2 顯色沉淀法

在重組膠原蛋白原材料按照YY/T1849-2022《重組膠原蛋白》[16]末端氨基酸序列法進行蛋白鑒別檢測并提供檢測報告，保證原材料質(zhì)量可控的前提下，可采用顯色沉淀法進行產(chǎn)品中重組膠原蛋白鑒別的測試。

性能指標示例描述（不限于此）為產(chǎn)品制成測試液加檢驗試劑，應(yīng)產(chǎn)生橘黃色絮狀沉淀、發(fā)生渾濁、有氨臭味實驗現(xiàn)象。參考《中華人民共和國藥典》[15]（2020年版）四部膠囊用明膠法作為測試依據(jù)。

3.3 傅里葉紅外（IR）特征峰測定法

在重組膠原蛋白原材料按照YY/T1849-2022《重組膠原蛋白》[16]末端氨基酸序列法進行蛋白鑒別檢測并提供檢測報告，保證原材料質(zhì)量可控的前提下，也可采用特征峰測定法研究產(chǎn)品中重組膠原蛋白的鑒別指標（建議結(jié)合具體產(chǎn)品，充分排除其他高分子組分干擾，考慮采用適宜的方法，并驗證試驗方法的可靠性）。

性能指標示例描述（不限于此）為酰胺A帶、B帶出現(xiàn)在3500～3000cm-1處；酰胺Ⅰ帶約出現(xiàn)在1680～1630cm-1處；酰胺Ⅱ帶約出現(xiàn)在1640～1500cm-1處；酰胺Ⅲ帶約出現(xiàn)在1300～1200cm-1處。參考《中華人民共和國藥典》[15]（2020年版）四部0402紅外分光光度法，37°C干燥48h測定。

3.4 其他測試法

根據(jù)產(chǎn)品組成成分和配比情況，還可以采用高效液相色譜法或其他適當(dāng)?shù)陌被峤M成分析技術(shù)，N-末端測序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段的方法進行重組膠原蛋白的鑒別[4]。

4.有效成分含量測定

導(dǎo)則明確重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊申報的技術(shù)要求測定有效成分的含量，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品實際情況，采用適宜的方法，以重組膠原蛋白為有效成分進行含量測試，可以用質(zhì)量/重量、質(zhì)量/體積、百分比等表示。

4.1 凱氏定氮法

性能示例（不限于此）描述為重組膠原蛋白含量應(yīng)≥0.5mg/g或mg/mL。參考《中華人民共和國藥典》[15]（2020年版）四部0731蛋白質(zhì)含量測定法第一法凱氏定氮法作為測試依據(jù)。

4.1.1 常規(guī)凱氏定氮法

該方法直接適用于在創(chuàng)面敷料產(chǎn)品原料中除重組膠原蛋白外，不含其他非蛋白類含氮物質(zhì)。細分為常量法和定氮儀法。凱氏定氮法屬于常規(guī)型凱氏定氮法檢測，方法成熟度高。檢測數(shù)據(jù)準確率高。但如果樣品中油性成分比例較大，消化過程需要較長時間，消化溫度需要梯度升溫。例如180°C之前的梯度溫度必須保持至少2h。

4.1.2 改良凱氏定氮法

該方法適用于創(chuàng)面敷料產(chǎn)品原料中除重組膠原蛋白外，還含有其他非蛋白類含氮物質(zhì)。需要考慮以總氮量減去非蛋白氮量即為創(chuàng)面敷料的含氮量。此種情況下，凱氏定氮法的缺點較為明顯，即極易受供試品中復(fù)雜輔料成分的影響，導(dǎo)致非蛋白氮提取失敗。

4.2 2，2'-聯(lián)喹啉二羧酸（Bicinchoninic Acid Method，BCA）法

該方法適用于在創(chuàng)面敷料原料中除重組膠原蛋白外，含有其他非蛋白類含氮物質(zhì)，不具備凱氏定氮法試驗條件或者提取非蛋白氮失敗的創(chuàng)面敷料產(chǎn)品。

該試驗方法在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+。BCA特異的與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的藍紫色復(fù)合物，在562nm處有最大的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可以根據(jù)吸收值測定蛋白質(zhì)濃度。

BCA工作液總體積=（標準曲線測定點數(shù)+樣品數(shù)）×重復(fù)次數(shù)×每個樣品所需的BCA工作液體積。該方法是已知的最靈敏的總蛋白質(zhì)含量的檢測方法之一，檢測下限到0.5μg/mL。而且操作簡單易上手，一次可以測定多個樣品，具有快速、穩(wěn)定、靈敏、效率高等優(yōu)點。但是該方法的線性關(guān)系會隨著蛋白質(zhì)含量的增加而越來越偏差，在含有Cu2+的螯合劑、還原性試劑中結(jié)果影響較大，在含有大量高分子物質(zhì)時也容易被包裹而降低回收率。

4.3 福林酚（Folin-Phenol）法

該方法的測試原理為重組膠原蛋白中的肽鍵和Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物。同時酚試劑被蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物上的芳香族氨基酸殘基還原，生成深藍色的化合物。在一定的條件下，化合物顏色的深淺取決于重組膠原蛋白的濃度。可根據(jù)蛋白質(zhì)溶液的吸光度，定量測定測得樣品中重組膠原蛋白的含量。

福林酚法廣泛應(yīng)用于測定水溶性蛋白質(zhì)的含量，適用于20～250μg微量蛋白質(zhì)的測定，最低可達5μg/mL。但是福林酚試劑配制繁瑣耗，且會受到檸檬酸、甘氨酸、Tris緩沖液、甘油、還原劑（1,4-二硫代蘇糖醇、巰基乙醇）、EDTA和尿素等物質(zhì)的干擾。同時福林酚的反應(yīng)在進行中需要嚴格控制反應(yīng)時間，標準曲線不是嚴格意義上的直線，專一性較差。對于不同種類的蛋白質(zhì)，所含酪氨酸的量不同，即使相同濃度下受其他肽類物質(zhì)干擾，其顯色深淺也有所差異。

5.小結(jié)與展望

安全性和有效性是重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊上市環(huán)節(jié)最重要的兩個考量指標，本文結(jié)合技術(shù)審評經(jīng)驗和部分審評案例，從產(chǎn)品不可吸收方法選擇和模型設(shè)計、物理阻隔層測試方法和效果評價、有效成分鑒別分析、有效成分含量測定的四方面梳理了重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料的關(guān)鍵性能指標，介紹了目前常采用的檢驗方法，提供了一些證明重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料安全有效性能的設(shè)計方案，歸納分析了不同鑒別含量測試方法的優(yōu)勢和缺點。為注冊申請人提供了申報參考、開拓了研究思路，也有利于統(tǒng)一各省技術(shù)審評人員對重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料的審評標準和尺度。除此之外，注冊申請人和技術(shù)審評人員還應(yīng)充分評價重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料的生物相容性、選擇適用的臨床評價路徑，提高對醫(yī)療器械全生命周期的安全有效性的整體認識和風(fēng)險把控，從而促進第二類重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料產(chǎn)品的高質(zhì)量健康發(fā)展。