郭開通,胡驍飛,孫亞寧,邢云瑞,王成賓,吳佳蓓,王琳,宋乾召,楊海濤,王耀

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471003)2(河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室, 河南 鄭州,450002)3(河南宜測科技有限公司,河南 鄭州,451162)

食物過敏是一種對機體不利的免疫反應,在接觸特定的食物或相關成分后可重復發(fā)生,輕則可引起消化系統(tǒng)疾病和皮膚刺激,重則會導致休克甚至死亡[1]。食物過敏已成為全球性的健康問題,被世界衛(wèi)生組織認為是最重要的公共衛(wèi)生問題之一[2]。在發(fā)達國家中,約有10%的人會產(chǎn)生食物過敏,其中以兒童為主[3]。此外,在過去的10～20年里,食物過敏發(fā)病率有所上升[4-5]。目前,還沒有有效的方法可以徹底解決食物過敏問題,對于過敏人群來說,最好的防護措施是避免接觸過敏原[6]。因此,一些國家通過食品標簽向消費者提供產(chǎn)品有關致敏成分的信息,以達到保護過敏人群的目的。但這種方法有局限性,在原材料或最終產(chǎn)品的加工或儲存過程中,由于交叉干擾無意或有意添加而存在的過敏原使食品標簽可信度降低,甚至會導致更多食物過敏的發(fā)生[7]。

食物過敏原常用檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫層析(immunochromatographic assay,ICA)、實時聚合酶鏈式反應和質(zhì)譜儀檢測等,其中,免疫層析具有便于操作、耗時短、檢測成本低等優(yōu)點[8],非常適用于大規(guī)模樣品現(xiàn)場快速篩查。在實際應用中,可通過使用不同標記物標記抗體提高免疫層析的檢測性能,根據(jù)標記物材料可以分為:有色納米顆粒、磁性納米顆粒、熒光納米顆粒[9]。本文對主要食物過敏原及免疫層析檢測原理進行了簡要介紹,并對免疫層析在主要食物過敏原檢測中的應用進行歸納總結(jié)。

1 常見食物過敏原

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的統(tǒng)計,超過90%的食物過敏主要與8種食物有關,按來源可以分為植物源性食物(包括花生、大豆、小麥、樹生堅果類)和動物源性食物(牛奶、雞蛋、甲殼類和魚類)[10]。植物源性和動物源性食物中存在的過敏原主要是少數(shù)具有特殊結(jié)構的蛋白質(zhì)[11]。植物源性食物過敏原主要屬于Cupin超家族和醇溶蛋白超家族[12]。而動物源性食物過敏原的多樣性低于植物源性食物過敏原,它們可分為三大家族:鈣結(jié)合蛋白(小白蛋白)、原肌球蛋白(甲殼類動物和軟體動物)和酪蛋白[13]。常見食物主要過敏原如表1所示。

2 免疫層析檢測原理

免疫層析是以免疫技術、色譜層析技術、新材料及標記技術為基礎建立的一種免疫學快速檢測技術。如圖1所示,免疫層析試紙主要包含樣品墊、結(jié)合墊、吸收墊、硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜、檢測線和質(zhì)控線等,其原理是以待測物溶液為流動相,在毛細作用下,待測物溶液經(jīng)樣品墊向吸收墊方向移動,先溶解結(jié)合墊上的檢測抗體后與其相互反應,再與檢測線和質(zhì)控線上固定有的抗原或抗體發(fā)生特異性免疫反應,最后,通過檢測線和質(zhì)控線顏色判斷測試結(jié)果[24]。根據(jù)抗原抗體結(jié)合方式的差異,主要可以分為2種檢測模式:夾心法(如圖1-a)和競爭法(如圖1-b)。夾心法一般用于大分子物質(zhì)的檢測,在食品過敏原檢測中較為常用,而競爭法常用于小分子物質(zhì)的檢測。

表1 常見食物主要過敏原及致敏癥狀Table 1 Common food allergens and sensitization symptoms

a-夾心法;b-競爭法圖1 免疫層析技術檢測模式示意圖Fig.1 Schematic diagram of immunochromatographic assay detection mode

3 免疫層析在食物過敏原檢測中的應用

3.1 基于有色納米顆粒的免疫層析

有色納米顆粒包括:膠體金、納米銀、乳膠顆粒等,具有良好的光學特性,僅靠肉眼就可以判斷結(jié)果等優(yōu)點,在食品過敏原檢測過程中應用較為廣泛[25]。而膠體金因其生物相容性好且制作簡單,在ICA制備中有較多應用[26]。為快速檢測花生過敏原,吉坤美等[27]通過提取總花生過敏原,免疫小鼠制備出高效價多克隆抗體,并利用膠體金作為抗體標記物,開發(fā)了一種檢測花生過敏原的膠體金免疫層析試紙條,目測檢出限為50 ng/mL。然而,多克隆抗體的交叉反應,可能會導致免疫層析法出現(xiàn)假陽性結(jié)果,為此,WU等[28]將膠體金與檢測抗體進行偶聯(lián),制備出膠體金檢測探針,開發(fā)了一種基于雙位點單克隆抗體的膠體金免疫層析法,可用于β-LG的檢測,所制備的單克隆抗體可在一個小區(qū)域(β-LG的Glu-Asn)識別出2個相鄰的、單獨的表位,沒有交叉反應。該方法具有高特異性,可實現(xiàn)對β-LG的快速檢測,目測檢出限為0.2 ng/mL。WANG等[29-30]分別針對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白研制了夾心法膠體金免疫層析快速檢測試紙條,均基于高度特異性的鼠源單克隆抗體作為捕獲抗體,將兔源多克隆抗體作為檢測抗體并與膠體金進行偶聯(lián),建立了2種主要大豆過敏原的免疫層析試紙條,借助光密度儀掃描試紙條檢測線能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測,可用于奶粉中2種大豆過敏原的檢測,目測檢出限分別為0.69和1.66 mg/kg。在免疫層析中競爭法也可用于大分子過敏原檢測,王士峰等[31]通過制備β-LG單克隆抗體,利用競爭法檢測線上包備β-LG標準品,將膠體金與檢測抗體偶聯(lián),建立了一種競爭法膠體金免疫層析法,該方法與夾心法相比,節(jié)約了抗體的使用量,目測檢出限達50 μg/mL。MASIRI等[32]制備了一組針對杏仁、腰果、椰子、榛子和豆奶中存在的修飾蛋白的多克隆抗體,并同時利用夾心法和競爭法,研制了一種膠體金免疫層析試紙條,可以實現(xiàn)多靶標檢測。試紙條上設置有2條檢測線,檢測線T1運用夾心法模式,線上固定有特異性抗體,檢測線T2運用競爭法模式,線上包被有待測物標準品。當與試紙條讀卡儀配合使用時,可以在25 min內(nèi)獲得檢測結(jié)果,目測檢出限為1.0 μg/mL。膠體金不僅可以作為檢測探針,當ICA與其他檢測技術相結(jié)合時,還可以發(fā)揮更多作用,為提高檢測能力,XI等[33]將表面增強拉曼光譜技術與免疫層析技術結(jié)合,利用對氨基苯硫酚修飾的膠體金作為拉曼光譜增強信號,建立了一種以膠體金為活性基底的拉曼光譜增強免疫層析法,可實現(xiàn)對β-伴大豆蛋白的定量檢測,目測檢出限為1 μg/mL,儀器檢出限為32 ng/mL。YIN等[34]建立了一種條碼式的免疫層析法,用于檢測麥醇溶蛋白,該方法以膠體金為標記物,并與雞多克隆抗麥醇溶蛋白免疫球蛋白Y(immunoglobulin Y,IgY)抗體非共價結(jié)合,NC膜上設置有2條檢測線,測試線1的臨界值設置為10 mg/kg,測試線2的臨界值設置為50 mg/kg,該方法可通過試紙條上出現(xiàn)的檢測線數(shù)量與分析物濃度之間的關系來快速提供半定量結(jié)果,具有耗時短、低成本等優(yōu)點,目測檢出限為10 mg/kg。在多靶標檢測中,膠體金免疫層析檢測線顏色過于單一,區(qū)分度較低。ANFOSSI等[35]利用金和銀納米顆粒為標記物,建立了一種多色多重免疫層析法,用于多種過敏原檢測,該方法將針對卵清蛋白、酪蛋白和榛子過敏原的抗體分別與球形銀納米顆粒(argentum nanoparticles,AgNPs)、球形和沙漠玫瑰狀金納米顆粒(aurum nanoparticles,AuNPs)偶聯(lián),作為檢測探針,該方法靈敏度高,目測檢出限為0.1 mg/L,可產(chǎn)生3種不同顏色(青色/酪蛋白、黃色/卵清蛋白、紅色/榛子蛋白),在實際應用中,能夠根據(jù)探針的顏色輕松識別商品中的過敏原,具有簡單便捷、節(jié)約成本等優(yōu)點。GALAN-MALO等[36]建立了一種基于彩色乳膠顆粒的免疫層析法,可以對β-LG和酪蛋白進行同時檢測和獨立檢測。該方法將紅色和藍色羧基改性染色乳膠顆粒作為抗體標記物,與膠體金相比,由于乳膠微球具有良好的穩(wěn)定性,并且色彩艷麗,具有很好的視覺效果等優(yōu)點,可以有效提高試紙條檢測靈敏度,對β-LG目測檢出限為0.5 μg/mL,酪蛋白目測檢出限為2 μg/mL。雖然有色納米顆粒在食物過敏原檢測中應用較為廣泛,但檢測中往往存在一些背景干擾,易出現(xiàn)假陽性或者假陰性等問題。

3.2 基于磁性納米顆粒的免疫層析

磁性納米顆粒是指顆粒直徑在1～100 nm的磁性材料。根據(jù)納米標記物本身自帶的磁性,具有穩(wěn)定性好、檢測信號持續(xù)時間長等優(yōu)點,并且在應用過程中可以簡化操作、縮短檢測時間、提高檢測效率等,在免疫層析技術中具有廣闊的應用前景。常見的磁性納米顆粒有免疫磁性納米粒子(immunomagnetic nanoparticle,IMNP)[37]、超順磁性納米顆粒(superparamagnetic nanoparticle,SPMNP)[38]、Fe3O4/Au納米粒子[39]等。在食品檢測中,對食用油中可能殘存的花生過敏原進行檢測較為困難,YIN等[40]開發(fā)了一種基于IMNP的免疫層析法,該方法將IMNP與抗Ara h 2的多抗偶聯(lián)形成復合物IMNP-pAbs,并作為檢測探針,在外加磁場的作用下可以簡便地分離出食用油中的Ara h 2,很大程度上簡化了樣品處理,并且可以在試紙條上產(chǎn)生棕色信號。在食用油中的目測檢出限為0.1 mg/kg。在此基礎上,YIN等[41]運用IMNP為抗體標記物開發(fā)了一種用于檢測加工食品中Ara h 1的免疫層析試紙條,目測檢出限為0.01 μg/mL。SHI等[42]開發(fā)了一種基于超順磁性納米顆粒的免疫層析法用于檢測過敏原TM,與傳統(tǒng)的標記材料相比,SPMNPs受到食物基質(zhì)干擾的影響較小,信號不會在很長時間內(nèi)退化,而且在必要時可以重新檢查ICA試紙條,該方法檢測范圍為0.01～20 μg/mL,儀器檢出限為12.4 ng/mL。ZHENG等[43]利用SPMNPs作為抗體標記物,將抗PV的單抗固定在SPMNP表面,制備了PV特異性的SPMNP探針,建立了一種SPMNP探針標記的競爭形式免疫層析法,利用磁性分析閱讀器系統(tǒng)讀取磁信號來實現(xiàn)定量測量,目測檢出限為5 mg/mL,儀器檢出限為0.046 mg/mL。對29份食品提取物樣品分別進行了免疫層析法和Western Blot檢測,比較結(jié)果表明,2種方法的相對符合率為93.1%(27/29)。李夢銀[44]以Fe3O4為核心,膠體金為殼,制備了金磁(Fe3O4/Au))復合微粒,建立了一種基于金磁復合微粒的免疫層析法,用于高特異性檢測過敏原PV,目測檢出限為4 ng/mL,該方法與普通膠體金試紙條相比,可通過磁信號分析儀直接得到信號值,靈敏度高,彌補了膠體金免疫層析無法量化的缺陷,達到對PV的定量檢測。ZHANG等[45]建立了一種基于Fe3O4/Au的免疫層析法,用于檢測過敏原PV,利用Fe3O4/Au納米微粒具有超順磁性的性能,采用Fe3O4/Au標記抗體,進一步簡化了樣品處理,使用試紙條讀卡儀進行定量分析,目測檢出限為2 ng/mL,儀器檢出限達0.691 ng/mL。磁性納米顆粒作為ICA中新型標記材料,已經(jīng)引起廣泛關注,但在應用中往往需要磁性閱讀器輔助讀值才能得到檢測結(jié)果,降低了應用的便捷性。

3.3 基于熒光納米顆粒的免疫層析

熒光納米顆粒包括量子點(quantum dot,QD)[46]、熒光微球[47]、上轉(zhuǎn)換熒光微球[48]等,量子點是一種納米尺度的半導體材料,一般為球形或準球形,直徑<10 nm。主要由Ⅱ～Ⅵ族(如CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ～Ⅴ族(如In P、In As等)元素組成的納米顆粒,與傳統(tǒng)的標記物相比,量子點具有穩(wěn)定的熒光和亮度等優(yōu)異的熒光特性[49]。WANG等[50]建立了一種基于量子點的免疫層析法,將水溶性QD標記多克隆抗體(polyclonal antibodies,pAbs)形成QD-pAbs聚合物,并作為檢測探針,該方法通過試紙條讀卡儀可以實現(xiàn)定量檢測,目測檢出限為0.5 μg/mL,儀器檢出限為0.05 μg/mL。熒光微球因其構型穩(wěn)定、熒光強度高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點,越來越多地被用作免疫分析的檢測標記。楊亞杰等[51]利用表面羧基化修飾的熒光微球與抗體表面的氨基共價結(jié)合,形成熒光微球檢測探針,建立了一種熒光微球免疫層析法,可用于酪蛋白的檢測,由于熒光微球具有發(fā)光效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,靈敏度得到進一步提高,目測檢出限達100 ng/mL。雖然熒光納米顆粒可以通過不同的方法來實現(xiàn)高靈敏度檢測,但熒光信號易猝滅等問題導致其不能夠長期保存,不利于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)應用。

4 結(jié)語

免疫層析技術具有靈敏度高、操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點,目前,已在食物過敏原快速檢測方面有較廣泛的應用,然而,免疫層析技術在過敏原檢測中仍有很大發(fā)展空間。1)食物過敏原多靶標檢測。在復雜的食品基質(zhì)中,往往存在多種食物過敏原,目前,在對多種過敏原同時檢測的研究中,存在著靈敏度較低、穩(wěn)定性較差以及同時檢測的最大分析物數(shù)量存在固有的限制等問題。利用微陣列格式對檢測線進行改造及不同納米標記物的應用等,開發(fā)一種可商業(yè)化的、同時檢測食品中多種過敏原的免疫層析技術,將是未來發(fā)展的一個方向。2)實現(xiàn)定量分析。定量分析是免疫層析研究中的重點,單獨依靠免疫層析技術很難實現(xiàn)對目標物的定量分析,在食物過敏原檢測中,將智能手機等其他便攜式智能設備與免疫層析技術結(jié)合,開發(fā)可以對食物過敏原進行現(xiàn)場快速定量檢測方法是發(fā)展的趨勢。3)新型納米標記物的應用?？贵w標記物本身的性質(zhì)會很大程度上影響免疫層析技術檢測過敏原的靈敏度,然而,近年來,在過敏原檢測中仍以膠體金等傳統(tǒng)標記物的應用為主,表2簡要總結(jié)了近年來不同新型納米標記物的免疫層析技術在食物過敏原快速檢測中的應用。隨著新型納米標記物的出現(xiàn)及應用,將不斷推動免疫層析技術在過敏原檢測研究中的發(fā)展。4)加工食品中過敏原的致敏性變化。食物過敏原在生產(chǎn)加工過程中,會受到各種因素(高溫,高壓,輻照等)影響導致結(jié)構發(fā)生改變,其致敏性可能會發(fā)生變化,從而影響免疫層析技術的檢測結(jié)果,在研究中也是值得關注的一個重要問題。5)特異性抗體替代物的研究。適配體因其具有和抗體相似的功能,且穩(wěn)定性、重復性等方面具有一定優(yōu)勢,可作為抗體的良好替代物,但在眾多檢測食物過敏原的研究中,利用適配體作為過敏原的識別分子報道較少。因此,篩選食物過敏原的適配體,并將其用于層析檢測的識別元件,具有良好的發(fā)展前景。6)綠色環(huán)保免疫層析試紙條的研究。免疫層析試紙條作為一次性用品,在參與大規(guī)?，F(xiàn)場檢測過程中,會產(chǎn)生很多廢棄物,通過對使用的環(huán)保材料進行改進,例如用可回收或可生物降解的塑料作為試紙條塑料殼、用纖維素代替硝酸纖維素膜等,開發(fā)綠色環(huán)保的免疫層析試紙條將成為新的研究方向。

表2 不同納米標記物在食物過敏原免疫層析檢測中的應用Table 2 Application of different nanomarkers in ICA for food allergens