吳作敏，于曉濤，王韻旨，寧 萌，王 瑞,2,3*

（1.漯河市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 漯河 462000；2.河南省中藥制劑與加工中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 漯河 462000；3.河南省中藥制劑現(xiàn)代化技術(shù)研發(fā)與臨床應(yīng)用工程研究中心，河南 漯河 462000）

紅黃丹方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由紅花、大黃等12味藥材組成，外用具有活血化瘀、消腫止痛的功效，臨床用于瘀血腫痛、跌打損傷等軟組織損傷的治療，療效確切。方中紅花活血化瘀，大黃涼血止痛，共為君藥?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)紅花中的羥基紅花黃色素A[1-2]和大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸等蒽醌類成分[3-5]均有抑制損傷組織中炎癥因子表達(dá)、減輕細(xì)胞損傷、改善血液流變學(xué)、提高損傷局部痛閾、減輕損傷局部組織病理學(xué)變化的作用。目前該方采用飲片打粉，使用時(shí)加入一定濃度乙醇調(diào)配外敷而用，存在質(zhì)量不易控制、透皮吸收差、使用不方便等缺點(diǎn)[6]。依據(jù)處方藥味理化性質(zhì)及臨床使用情況，擬將此方開發(fā)為外用酊劑，提高制劑質(zhì)量均一性及患者依從性。中藥酊劑系指采用一定濃度的乙醇將中藥飲片提取或溶解成澄清液體制劑，也可用浸流膏稀釋制成，因其療效顯著且給藥形式靈活，安全可靠性高被廣泛應(yīng)用于臨床[6-7]。本研究利用層次分析-基于指標(biāo)相關(guān)性混合加權(quán)法（AHPCRITIC）結(jié)合正交試驗(yàn)，以羥基紅花黃色素A、大黃游離蒽醌類成分的提取率及總固體物得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選紅黃丹酊的提取工藝，以期為該方的后續(xù)研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配置四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站（美國Agilent公司）；Milli-Q型純水機(jī)（美國Millipore公司）；AUW-120D型電子天平（日本島津公司）；5810R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；JA2003N型電子天平（上海精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

紅花（批號(hào)：200201），大黃（批號(hào)：210801），牡丹皮（批號(hào)：201001）等14味中藥飲片均購自河南鴻博藥業(yè)有限公司，經(jīng)河南省中藥制劑與加工中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任藥師于曉濤鑒定，質(zhì)量均符合2020年版《中國藥典》的要求；對照品羥基紅花黃色素A（批號(hào)：DSTDQ001701，含量：98.98 %），蘆薈大黃素（批號(hào)：DST190626-007，含量：98.00 %），大黃酸（批號(hào)：DST200819-029，含量：98.29 %），大黃素（批號(hào)：DST191112-030，含量：98.69 %），大黃酚（批號(hào)：DST200819-032，含量：98.67 %），大黃素甲醚（批號(hào)：DST200325-0312，含量：99.80%），均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸（色譜純，上海麥克林） ；乙醇（藥用輔料級(jí)別，新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的含量測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定。

2.1.1 色譜條件 Intertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2 %磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，18 %～31 %A；5～15 min，31 %～36 %A；15～20 min，36 %～56 %A；20～35 min，56 %～60 %A；35～50 min，60 %～74 %A；50～65 min，74 %～80 %A；65～85 min，80 %～85 %A） ；檢測波長403 nm（羥基紅花黃色素A，0～20 min），254 nm（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚，20～85 min）；流速1.0 ml/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量于量瓶中，加甲醇定容，得各對照品儲(chǔ)備液，分別取適量對照品溶液混勻成混合對照品溶液（羥基紅花黃色素A濃度2.34×10-2mg/ml，蘆薈大黃素濃度4.28×10-3mg/ml，大黃素濃度4.32×10-3mg/ml，大黃酸濃度6.89×10-3mg/ml，大黃酚濃度1.38×10-2mg/ml，大黃素甲醚濃度4.49×10-3mg/ml）。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取中藥飲片，除薄荷冰和冰片外，粉碎成粗粉，過2號(hào)篩，置有蓋玻璃容器中，加入適量規(guī)定濃度的乙醇，攪拌均勻后靜置，浸漬適當(dāng)時(shí)間，過濾收集醇提液，取適量該醇提液溶解處方量的薄荷冰和冰片后，再次并入上述醇提液中，攪拌均勻，靜置24 h，濾過，濾液添加原濃度的乙醇至規(guī)定量，分裝，即得紅黃丹方醇提液。精密量取紅黃丹方醇提液適量，加50 %乙醇稀釋10倍，12 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.2.3 陰性樣品溶液的制備 分別稱取缺紅花、大黃的處方量藥材各一份，按2.1.2.2項(xiàng)下方法制備兩份陰性樣品溶液。

2.1.3 專屬性考察 取混合對照品溶液、供試品溶液及兩種陰性樣品溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。由圖1可見，供試品溶液與對照品溶液在相應(yīng)位置有相同色譜峰，陰性樣品溶液在對照品峰相應(yīng)的位置上無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 紅黃丹方中6種有效成分HPLC圖譜

2.1.4 線性關(guān)系 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液2，4，6，8，10，15 μl，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y） ，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X） ，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。由表1可見，各成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性回歸方程

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示各指標(biāo)性成分峰面積的RSD值分別為0.34 %（羥基紅花黃色素A），0.63 %（蘆薈大黃素），1.27 %（大黃酸）和1.44 %（大黃素），0.59 %（大黃酚），1.49 %（大黃素甲醚），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察 取同一批次處方量藥材6份，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析。測得各指標(biāo)成分峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量RSD分別為0.99 %，1.68 %，1.74 %，0.91 %，1.13 %，1.45 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 樣品溶液穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣10 μl檢測，測得羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚面積RSD分別為1.86 %，1.68 %，1.45 %，0.84 %，0.75 %，1.27 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率考察 精密吸取一定量已知各指標(biāo)成分含量（羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量分別為141.06，15.19，64.76，6.76，19.04，8.94 μg/ml）的紅黃丹方醇提液，按2.1.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液。取供試品溶液1 ml，均精密加入2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液1 ml，平行操作6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果，羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均加樣回收率分別為100.91 %，98.78 %，99.34 %，100.50 %，97.64 %，98.93 %，RSD分別為1.79 %，1.93 %，2.41 %，2.09 %，1.98 %，2.71 %。

2.2 總固體得率測定

精密量取各編號(hào)的紅黃丹方醇提液3份，每份20 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，轉(zhuǎn)移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，按下式計(jì)算總固體得率及RSD值。

式中，W為20 ml紅黃丹方醇提液的總固體質(zhì)量，V為樣品溶液總體積，M為中藥飲片的質(zhì)量。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

參考文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道，并結(jié)合單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)要求，選取乙醇濃度（A）、加醇倍量（B）、浸漬時(shí)間（C）為考察因素，各因素水平見表2，以羥基紅花黃色素A提取率（羥基紅花黃色素A提取量/紅花飲片質(zhì)量）、大黃游離蒽醌提取率[（蘆薈大黃素提取量+大黃酸提取量+大黃素提取量+大黃酚提取量+大黃素甲醚提取量）/大黃飲片質(zhì)量]，及總固體得率綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4 指標(biāo)權(quán)重的確定

2.4.1 層次分析法（AHP） AHP將定性分析與定量分析相結(jié)合，通過層次分析的方法建立成對比較的優(yōu)先判斷矩陣，賦予各項(xiàng)指標(biāo)相對評(píng)分，并計(jì)算出各指標(biāo)的權(quán)重比例[10-11]。本研究根據(jù)復(fù)方組方規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)[12]，將羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌提取率、總固體得率3個(gè)指標(biāo)分為2個(gè)層次，確定指標(biāo)優(yōu)先順序?yàn)椋毫u基紅花黃色素A提取率=大黃游離蒽醌提取率>總固體得率，構(gòu)建優(yōu)先矩陣見表4，借助在線分析軟件SPSSAU軟件（https://www.spssau.com）進(jìn)行AHP層次分析，得出羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌提取率、總固體得率的權(quán)重系數(shù)分別是0.42857，0.42857，0.14286，CR（一致性比例因子）=0＜0.10，說明了權(quán)重系數(shù)的有效性。

表4 判斷矩陣評(píng)分

2.4.2 基于指標(biāo)相關(guān)性的權(quán)重確定法（CRITIC）CRITIC是通過指標(biāo)間相關(guān)性判斷各個(gè)指標(biāo)的重要性[13]，以評(píng)價(jià)指標(biāo)間的對比強(qiáng)度及沖突性為基礎(chǔ)來確定客觀權(quán)重系數(shù)，充分考慮到各指標(biāo)內(nèi)的變異性及指標(biāo)間的沖突性，由CRITIC法確定的權(quán)重系數(shù)與復(fù)方中各評(píng)價(jià)指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性和各樣本間數(shù)據(jù)變異性密切相關(guān)[14-15]。首先將各評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)按公式“指標(biāo)歸一化值=[（實(shí)測值-最小值）/（最大值-最小值）］×100 %”進(jìn)行歸一化處理，通過SPSSAU軟件進(jìn)行 CRITIC分析，得羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌提取率、總固體得率權(quán)重系數(shù)分別為0.3272，0.3886，0.2842，其中大黃游離蒽醌提取率的權(quán)重系數(shù)最大，羥基紅花黃色素A提取率次之。

2.4.3 AHP-CRITIC混合加權(quán)法 AHP法以主觀評(píng)價(jià)為基礎(chǔ)來確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，CRITIC法則更為客觀地反應(yīng)各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。為更加真實(shí)地評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，兼顧主客觀因素，本文將兩種權(quán)重系數(shù)確定方法加以結(jié)合，根據(jù)公式ωAHP-CRITIC=ωAHPij×ωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij[16]，計(jì)算得羥基紅花黃色素A、大黃游離蒽醌、總固體得率權(quán)重系數(shù)分別為0.4037，0.4794，0.1169。

2.4.4 權(quán)重評(píng)分的比較及確定 分別采用 AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC法對權(quán)重賦值后，對正交試驗(yàn)結(jié)果按以下公式計(jì)算綜合評(píng)分（S）。

其中ω為指標(biāo)權(quán)重，Y為指標(biāo)數(shù)值，具體結(jié)果見表5。

表5 3種方法評(píng)分結(jié)果

直觀分析可知3種評(píng)分方法給出的結(jié)果具有一致性，應(yīng)用SPSS軟件分別對綜合評(píng)分與權(quán)重系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。AHP法、CRITIC法與AHPCRITIC法綜合評(píng)分相關(guān)系數(shù)分別為0.998，0.994，AHP法與CRITIC法綜合評(píng)分相關(guān)系數(shù)為0.998，且相關(guān)性均極顯著（P<0.01），表明3種權(quán)重賦值法給出的評(píng)分結(jié)果具有一致性；AHP法與CRITIC法權(quán)重系數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.811（P>0.05），說明兩組相關(guān)系數(shù)相關(guān)性不顯著，表明AHP法與CRITIC法給出的信息疊加性較差。AHP-CRITIC法整合主觀與客觀兩方面因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，所展現(xiàn)的信息更加科學(xué)合理，因此選擇AHP-CRITIC法進(jìn)行綜合權(quán)重評(píng)分。

2.5 提取工藝的確定

采用AHP-CRITIC法確定權(quán)重系數(shù)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，并利用SPSS 19.0對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，直觀分析結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。根據(jù)直觀分析可知，3因素對綜合評(píng)分的影響順序?yàn)锳>C>B，即乙醇濃度對綜合評(píng)分影響最大，加醇倍量的影響最??；根據(jù)方差分析結(jié)果可知3個(gè)影響因素對指標(biāo)成分含量及總固體得率均無顯著影響，為節(jié)約工業(yè)生產(chǎn)時(shí)間與成本，選擇最佳工藝為A1B1C2，即應(yīng)用4倍量50 %乙醇浸漬10 d，其符合制劑生產(chǎn)方便、成本低等特點(diǎn)。

表6 直觀分析結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證紅黃丹酊制備工藝的合理性，稱取處方量藥材3份，按照最終確定的最佳工藝A1B1C2，進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表8，各指標(biāo)的RSD值均小于3 %，說明A1B1C2工藝穩(wěn)定可靠，可繼續(xù)開展下一步研究。

表8 工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)成分的選擇

紅黃丹方中的紅花、牡丹皮等藥材均含揮發(fā)性成分，加熱會(huì)導(dǎo)致其揮發(fā)性成分的逸散損失，且大黃中的蒽醌類成分穩(wěn)定性差，高溫易分解，因此不宜采用加熱的提取方式，且因大黃富含黏性成分（鞣質(zhì)）等，不適合滲漉法提取[17]，因此最終選擇浸漬法作為紅黃丹酊劑的提取方法。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取次數(shù)增加，指標(biāo)成分得率相對增加，但隨著溶劑量的增加，指標(biāo)成分濃度下降，且因復(fù)方中含揮發(fā)油成分及不穩(wěn)定性活性成分，不宜加熱濃縮以減少溶劑體積，為保證藥物療效，綜合考慮，確定紅黃丹方提取次數(shù)為1次。

中藥復(fù)方一般通過多組分、多靶點(diǎn)、多通路的方式從整體上調(diào)節(jié)機(jī)體功能[18]，為更科學(xué)地體現(xiàn)工藝研究的合理性，本研究采用多組分綜合評(píng)分的方法聯(lián)合正交設(shè)計(jì)篩選工藝參數(shù)。由于羥基紅花黃色素A、大黃游離蒽醌類成分分別為君藥紅花、大黃中具有化瘀止痛作用的主要藥效成分[5,19]，總固體得率常作為中藥酊劑研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]，因此本研究以羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌類成分提取率及總固體得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 權(quán)重系數(shù)的確定

權(quán)重系數(shù)的確定是采用多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分篩選相關(guān)參數(shù)時(shí)，能否科學(xué)合理進(jìn)行綜合評(píng)分的重要環(huán)節(jié)[21]。AHP法將各指標(biāo)按主觀經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行重要性排序并分層，其在一定程度上體現(xiàn)復(fù)方配伍規(guī)律，但缺乏與實(shí)際數(shù)據(jù)信息的結(jié)合；CRIRIC法則能客觀分析實(shí)際數(shù)據(jù)信息，但缺少與不同指標(biāo)間輕重關(guān)系的結(jié)合；AHP-CRIRIC混合加權(quán)法整合兩種賦權(quán)方法的特點(diǎn)，既考慮到復(fù)方配伍及藥效發(fā)揮特點(diǎn)，又客觀分析了實(shí)際數(shù)據(jù)信息。經(jīng)對比分析，本研究采用整合主觀與客觀因素為一體的AHP-CRIRIC混合加權(quán)法確定多指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，篩選出的最佳制備工藝為4倍量50 %乙醇浸漬10 d，且通過驗(yàn)證試驗(yàn)檢驗(yàn)了該工藝的穩(wěn)定可行性，為下一步研究提供數(shù)據(jù)支持。