賈興,黃凱,李紅園★,耿智霞,瞿紅穎,劉靜,宋婷婷,鄧彥宏
(1.河北遠征藥業(yè)有限公司,河北石家莊 050041;2.河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心,河北石家莊 050041;3.石家莊市獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心,河北石家莊 050041;4.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林長春 130000)
近年來, 喹諾酮藥物長期使用導(dǎo)致動物產(chǎn)生耐藥性[1-3]。 馬波沙星是動物專用的氟喹諾酮類抗菌藥,在歐盟、新西蘭等國家應(yīng)用廣泛,用于治療豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)以及牛的呼吸道感染和由大腸桿菌引起的乳腺炎[4]。馬波沙星在體內(nèi)吸收迅速,分布廣泛,生物利用度高,具有抗菌譜廣、活性強等諸多優(yōu)點,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及支原體都具有很強的抗菌活性[5]。 國內(nèi)批準的馬波沙星注射液可用于豬的臨床疾病的治療,僅有法國詩華進口注冊的馬波沙星注射液課用于靶動物牛。 本試驗建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定馬波沙星的檢測方法,可用于牛組織中馬波沙星殘留量的檢測。
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(島津,LCMS-8045);電子天平(賽多利斯,QUINTIX125D-1CN);高速組織均質(zhì)機 (安徽博進化工機械有限公司,BRS500);臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司,H1850R);旋渦混合器(其林貝爾,XW-80A);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮,RE-52AA)。
馬波沙星標準物質(zhì)(批號H0801511,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所);乙腈(色譜純,F(xiàn)isher 公司);甲醇(色譜純,F(xiàn)isher 公司);甲酸(色譜純,Merck);水(GB/T 6682 規(guī)定的一級水);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
2.3.1 標準儲備溶液 取馬波沙星標準品10毫克,精密稱定,用乙腈溶解并定容于50 毫升棕色容量瓶中,置冰箱中避光保存。
2.3.2 標準中間溶液 精密量取馬波沙星儲備溶液5 毫升于100 毫升棕色容量瓶中, 用乙腈溶液溶解并定容至刻度,置冰箱中避光保存。
2.3.3 樣品溶解液 乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液。
2.3.4 空白樣品基質(zhì)溶液 采用不含待測組分的空白樣品制備。
2.4.1 樣品前處理
取組織樣品約20 克,完全切碎后經(jīng)高速均質(zhì)機搗碎,用四分法縮分出適量試樣,稱取2 克試樣(冷凍試樣應(yīng)解凍至室溫),加乙腈-10%三氯乙酸溶液10 毫升,10000 轉(zhuǎn)/分鐘勻漿3 分鐘, 用樣品提取液5 毫升洗刀頭和勻漿杯,合并樣液,漩渦30 秒,4℃條件下10000 轉(zhuǎn)/分離心6 分鐘,上清液用10 毫升水稀釋備用。
SPE 柱經(jīng)甲醇3 毫升活化, 水3 毫升平衡。將備用液過柱,樣液過柱速度約為1 毫升/分鐘。經(jīng)10%甲醇3 毫升淋洗,負壓抽干,甲醇3 毫升洗脫,抽干。洗脫液于60℃氮氣流吹干,用1.0 毫升乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解殘渣, 混勻,4℃條件下12000 轉(zhuǎn)/分離心6 分鐘, 取適量溶液經(jīng)0.22 微米濾膜過濾至樣品瓶中,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
2.4.2 液相色譜條件
色譜柱為C18(125×2.0 毫米,3.0 微米);流動相:0.1%甲酸/乙腈溶液+0.1%甲酸/水溶液,梯度洗脫(梯度洗脫時間表見表1); 流速:0.3 毫升/分;柱溫:30℃;進樣量:20 微升。
表1 液相色譜梯度洗脫條件
2.4.3 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描; 檢測方式: 多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM);DL 溫度:350℃; 檢測器電壓:2.0 千伏; 加熱器流量:600升/小時;霧化氣流量:500 升/小時;干燥氣流量:500 升/小時;MRM 參數(shù)(見表2)。
表2 MRM 參數(shù)列表
2.5.1 特異性
分析不同來源空白牛組織(牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)樣品(n=20),觀察在藥峰出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾信號。
2.5.2 標準曲線
分別設(shè)置6 個不同濃度的標準工作溶液,依次為5、10、20、50、100 和200 納克/毫升,依據(jù)設(shè)定濃度加入標準品,將所得峰面積為縱坐標,以相應(yīng)的濃度為橫坐標繪制基質(zhì)標準曲線,得到相應(yīng)的基質(zhì)標準曲線方程與相關(guān)系數(shù)。
2.5.3 方法的準確度與精密度
通過添加回收試驗驗證方法的準確度與精密度,分別用回收率和變異系數(shù)表示準確度和精密度。 選擇以10、50、100 納克/毫升進行添加回收。每批3 個不同濃度,每個濃度5 個平行樣品,重復(fù)3 批,分別計算回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。
在上述色譜工作條件下, 分析不同來源的空白牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織樣品,目標化合物的保留時間附近沒有雜質(zhì)干擾,馬波沙星的色譜峰保留時間為4.0 分鐘左右。
選擇10 納克/毫升濃度做重復(fù)性實驗,每個組織樣品重復(fù)測6 次。 得到牛肌肉組織中馬波沙星含量測定重復(fù)性保留時間RSD 值為1.265%,峰面積的RSD 值為2.290%;牛肝臟組織中馬波沙星含量測定重復(fù)性保留時間RSD 值為0.264%,峰面積的RSD 值為0.806%;牛腎臟組織中馬波沙星含量測定重復(fù)性保留時間RSD值為0.138%,峰面積的RSD 值為0.658%;牛脂肪組織中馬波沙星含量測定重復(fù)性保留時間RSD 值為0.117%,峰面積的RSD 值為2.279%。均小于5%。 系統(tǒng)適應(yīng)性良好。
測得牛奶中馬波沙星的測定低限為10.0 微克/千克。
在10~200 納克/毫升的濃度范圍內(nèi),方法的線性關(guān)系良好,牛肌肉組織、肝臟組織、腎臟組織、 脂肪組織基質(zhì)標準曲線的相關(guān)系數(shù) (R)≥0.999,標準曲線回歸方程如表3 所示。
表3 基質(zhì)標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)
馬波沙星的添加回收率和精密度見表4 和表5。 從表4、表5 中可得出,牛肌肉組織中在10、50、100 納克/毫升濃度的回收率在77.1%~101.4%;批內(nèi)變異系數(shù)均小于2.16%,批間變異系數(shù)均小于9.77%;牛肝臟組織中在10、50、100納克/毫升濃度的回收率在81.2%~100.3%;批內(nèi)變異系數(shù)均小于2.01%, 批間變異系數(shù)均小于2.29%;牛腎臟組織中在10、50、100 納克/毫升濃度的回收率在83.8%~97.0%;批內(nèi)變異系數(shù)均小于1.41%,批間變異系數(shù)均小于3.80%;牛脂肪組織中在10、50、100 納克/毫升濃度的回收率在80.3%~107.6%;批內(nèi)變異系數(shù)均小于5.63%,批間變異系數(shù)均小于11.53%。
表4 不同批次牛肌肉、肝臟組織樣品中添加馬波沙星的回收率和變異系數(shù)
表5 不同批次牛腎臟、脂肪組織樣品中添加馬波沙星的回收率和變異系數(shù)
近年來,隨著氟喹諾酮類藥物的普遍使用,其殘留檢測技術(shù)已被國內(nèi)外廣泛研究,目前的檢測方法主要包括高效液相色譜法、 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫法等[6]。 本實驗建立了牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織中馬波沙星殘留液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法,方法專屬性良好,空白基質(zhì)中目標化合物的保留時間附近沒有雜質(zhì)干擾。 方法在牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織中的測定低限可設(shè)定為10.0 微克/千克;基質(zhì)標準曲線范圍為10~200 納克/毫升, 相關(guān)系數(shù)>0.998;在牛的肌肉、肝臟、腎臟及脂肪組織樣品中, 馬波沙星在10、50、100 納克/毫升濃度的平均回收率在70%~120%, 批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10% , 批間變異系數(shù) CV ≤15%。 結(jié)果表明該方法的重復(fù)性、 靈敏度、線性范圍、準確度、精密度能夠滿足殘留檢測要求。
本研究針對新獸藥馬波沙星注射液應(yīng)用后在牛組織中的殘量檢測,建立了高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法。 該方法可用于檢測牛肌肉、 肝臟、腎臟及脂肪等多種組織中馬波沙星藥物的殘留量,并且經(jīng)試驗研究驗證,該方法的靈敏度、準確度與精密度均良好。
(支持項目: 河北省省級科技計劃資助(21322601D))