孫守江，馬馼，毛培勝，豆麗茹，賈志程，孫銘，王娟

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

端粒是一種特殊的核蛋白復(fù)合物，其功能在于保護(hù)真核生物染色體末端的完整性和穩(wěn)定性［1］。端粒結(jié)構(gòu)缺失會(huì)導(dǎo)致染色體的核溶解和端粒的融合，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［2］。在細(xì)胞連續(xù)幾輪分裂過程中，端粒DNA 逐漸損失，由于細(xì)胞在分裂中面臨DNA 末端復(fù)制問題，端粒是一種解決染色體DNA 序列缺失的特殊結(jié)構(gòu)［3］。

端粒酶是真核生物細(xì)胞中的一種特殊酶，不同于常見的生理生化反應(yīng)速率的調(diào)控酶，端粒酶是一種核糖核蛋白酶，主要由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和端粒酶RNA（telomerase RNA，TER）兩個(gè)亞單位組成［4］。端粒酶作為一種特殊的端粒相關(guān)蛋白，在端粒長度維持以及端粒損傷修復(fù)中扮演著重要的角色［5-6］。因此，研究植物在生長發(fā)育過程中端粒酶活性的變化規(guī)律有助于闡釋端粒長度的維持以及修復(fù)機(jī)制，進(jìn)一步探討植物端粒長度與衰老以及壽命之間的內(nèi)在關(guān)系。端粒酶活性的研究主要集中在動(dòng)物和人體上，在植物領(lǐng)域該方面的研究相對較少。

種子作為植物的一個(gè)主要器官，成熟離體后面臨老化，研究發(fā)現(xiàn)，在種子老化過程中端粒長度也呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，植物端粒DNA 是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，在分化和衰老過程中會(huì)縮短，端粒被認(rèn)為是種子老化的可靠標(biāo)志。Bucholc 等［7］證明了新鮮和儲(chǔ)存小麥（Triticum aestivum）種子之間端粒序列長度的顯著差異，盡管其在發(fā)芽率方面相似。小麥和黑麥（Secale cereale）種子的試驗(yàn)表明，端粒長度與種子老化呈負(fù)相關(guān)。Donà 等［8］報(bào)道了白玉草（Silene vulgaris）和蠅子草（Silene acaulis）的干燥和再水化種子的平均端粒長度存在顯著差異。復(fù)水后，端粒長度明顯增加，人工老化后，端粒長度明顯減少。從這些研究可以看出，在種子人工老化或者自然老化過程中，端粒長度呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，但是種子端粒長度與種子所處狀態(tài)也有很大的關(guān)系。端粒長度以及端粒酶活性的動(dòng)態(tài)變化與種子老化的關(guān)系尚不清楚?；诖耍狙芯烤C述了端粒和端粒結(jié)合蛋白在植物生物學(xué)中的作用，重點(diǎn)論述了端粒和端粒結(jié)合蛋白調(diào)控端粒長度以及端粒酶活性的模式，為后續(xù)解析植物衰老以及種子劣變機(jī)理提供理論參考依據(jù)。

1 端粒結(jié)構(gòu)及維持機(jī)制

1.1 端粒的組成及功能

端粒是染色體末端的重復(fù)DNA 序列，人類的通常由TTAGGG 重復(fù)單元組成［9］，植物也擁有端粒重復(fù)結(jié)構(gòu)，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的重復(fù)序列是TTTAGGG，這些重復(fù)單元形成了一個(gè)末端重復(fù)序列，其中一個(gè)單元序列朝向染色體內(nèi)部，另一個(gè)朝向染色體外部［10］。端粒通常由兩個(gè)主要部分組成：端粒DNA 和端粒結(jié)合蛋白。端粒DNA 是端粒的主要結(jié)構(gòu)組成部分，通常由數(shù)百至數(shù)千個(gè)重復(fù)單元組成。這些單元由G-四聯(lián)體核苷酸和單鏈DNA 結(jié)構(gòu)組成，它們在端粒末端之間形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1）［11］。端粒DNA 的主要功能是保護(hù)染色體末端免受DNA 降解和喪失的影響。端粒結(jié)合蛋白是一組與端粒DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要是幫助穩(wěn)定端粒結(jié)構(gòu)并保護(hù)端粒免受DNA 修復(fù)系統(tǒng)的干擾［12］。其次，還參與了基因表達(dá)、DNA 復(fù)制和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)等許多其他生物學(xué)過程。

圖1 端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of telomeres and telomerase

1.2 維持端粒完整和功能的調(diào)控機(jī)制

端粒長度的維持機(jī)制涉及多個(gè)分子和信號通路的協(xié)同作用：1）端粒酶：端粒酶是一種包含RNA 和蛋白質(zhì)的酶，能夠調(diào)控染色體末端新端粒序列合成［13］，對于端粒長度的維持至關(guān)重要，因?yàn)槎肆Ｔ诩?xì)胞分裂過程中會(huì)逐漸縮短，如果沒有端粒酶的參與，染色體末端的縮短會(huì)導(dǎo)致基因喪失或染色體重組（圖2）。2）轉(zhuǎn)錄因子：轉(zhuǎn)錄因子可以通過直接或間接調(diào)節(jié)端粒酶的表達(dá)來影響端粒長度的維持。例如，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、SP1 和CREB 等可以激活端粒酶基因的轉(zhuǎn)錄［14］。3）DNA 損傷反應(yīng)：DNA 損傷反應(yīng)的信號通路可以通過ATM、ATR 和p53 等分子激活端粒酶，從而維持端粒長度。當(dāng)染色體末端遭受到DNA 損傷時(shí)，端粒酶可以被招募到損傷部位進(jìn)行修復(fù)，以防止端粒縮短［15］。4）端粒結(jié)合蛋白：端粒結(jié)合蛋白是一組結(jié)合在端粒序列上的蛋白質(zhì)，能夠維持端粒的結(jié)構(gòu)和功能。例如，端粒蛋白TRF2 可以抑制端粒的融合和修復(fù)，從而維持端粒的完整性［16］。5）端粒剪切：在端粒酶合成新端粒序列的過程中，端粒剪切可以將已合成的端粒序列進(jìn)行修剪，從而控制端粒長度。例如，剪切因子CST 可以調(diào)節(jié)端粒剪切，影響端粒長度的維持［16］。

圖2 端粒長度及維持機(jī)制Fig.2 Telomere length and maintenance mechanism

2 端粒結(jié)合蛋白

2.1 端粒雙鏈DNA 結(jié)合蛋白

植物端粒結(jié)合蛋白（plant telomere binding protein，PTBP）是一種與植物端粒結(jié)合的蛋白質(zhì)，它的主要功能是保護(hù)端粒，防止DNA 末端的降解和損傷，并參與維持染色體的穩(wěn)定性和遺傳信息的傳遞［17］。植物端粒結(jié)合蛋白主要存在于植物的細(xì)胞核中，具有高度保守性。在不同植物中，PTBP 的序列和結(jié)構(gòu)略有不同，但它們都具有相似的功能和作用機(jī)制［18］。PTBP 通常結(jié)合在端粒的雙鏈DNA 上，并與其他蛋白質(zhì)一起形成端粒復(fù)合物。這些復(fù)合物可以幫助維持染色體的結(jié)構(gòu)和功能，防止染色體斷裂和損傷，從而確保正常的細(xì)胞分裂和遺傳信息的傳遞［19］。最近的研究表明，PTBP 在植物的免疫響應(yīng)和逆境適應(yīng)中也發(fā)揮了重要的作用。OsRTBP1、NgTRF1、AtTBP1 和AtTRB1-3 通過水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）和擬南芥中的Myb 結(jié)構(gòu)域與雙鏈端粒DNA 結(jié)合［20-23］。據(jù)報(bào)道，這些含有Myb 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與端粒的結(jié)合是維持染色體DNA 完整性所必需的［24］。此外，最近的一項(xiàng)研究表明，AtTRB 蛋白還具有染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑的功能［25］。AtTRB2 與組蛋白脫乙酰酶、HDT4 和HDA6 的直接相互作用調(diào)節(jié)擬南芥中的染色體末端（表1）。

表1 端粒雙鏈DNA 結(jié)合蛋白Table 1 Telomere double-stranded DNA binding protein

盡管CST 復(fù)合體最初被認(rèn)為只存在于酵母中，但現(xiàn)在已知它存在于各種有助于端粒維持的生物體中。在酵母中，CST 復(fù)合體包含Cdc13、Stn1 和Ten1，而哺乳動(dòng)物CST 復(fù)合體包含Ctc1、Stn1 和Ten1［26］。 所有3 個(gè)CST基因?qū)τ诙肆＞S持都是必不可少的［27］。在擬南芥中，任何CST 亞基的突變都可能導(dǎo)致嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)缺陷、端粒長度減少、染色體融合或單鏈G 懸垂延伸。CST 復(fù)合物控制端粒酶進(jìn)入端粒DNA、末端連接重組途徑以及擬南芥中ATR 依賴性DNA 損傷反應(yīng)的激活［28］。

2.2 端粒單鏈DNA 結(jié)合蛋白

2.2.1 有OB 結(jié)構(gòu)域的端粒單鏈DNA 結(jié)合蛋白 大多數(shù)單鏈端粒DNA 結(jié)合蛋白含有寡核苷酸/寡糖結(jié)合（OB）結(jié)構(gòu)域。包含OB 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在端粒維持、DNA 修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和其他DNA 代謝過程中發(fā)揮重要作用［29］。在植物中，端粒單鏈DNA 序列結(jié)合蛋白分為兩組：具有OB 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和沒有OB 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。第一組具有OB 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是POT1。POT1 蛋白是一種高度保守的核心單元，屬于人、酵母和植物等真核生物中極其保守的蛋白，是端粒保護(hù)蛋白的一員，在哺乳動(dòng)物和酵母中已經(jīng)得到了廣泛的研究。近年來，越來越多的研究表明，植物中POT1 蛋白在端粒保護(hù)、基因表達(dá)、逆境響應(yīng)等方面也發(fā)揮著重要作用［30］。研究表明，在擬南芥中POT1 蛋白對端粒長度和復(fù)制有重要的影響，同時(shí)參與了端粒末端的結(jié)構(gòu)和功能的維持。植物POT1 蛋白也參與調(diào)控基因表達(dá)。一些研究發(fā)現(xiàn)，POT1 蛋白能夠通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與基因的調(diào)控。例如，在番茄（Solanum lycopersicum）中，POT1 蛋白能夠調(diào)節(jié)番茄成熟相關(guān)基因的表達(dá)［31］。另有研究發(fā)現(xiàn)POT1 蛋白能夠響應(yīng)植物的逆境信號，參與植物的逆境響應(yīng)。例如，在擬南芥中，POT1 蛋白能夠調(diào)節(jié)銅離子在植物中的吸收和運(yùn)輸，并影響植物的抗氧化能力。在植物中分離出POT1 同系物，例如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的POT1a、POT1b 和POT1c，這些蛋白均以不同的模式與端粒DNA 單鏈結(jié)合，調(diào)控端粒的結(jié)構(gòu)和功能（表2）［32］。

表2 端粒單鏈DNA 結(jié)合蛋白Table 2 Telomere single-stranded DNA-binding proteins

2.2.2 無OB 結(jié)構(gòu)域的端粒單鏈DNA 結(jié)合蛋白 不具有OB 結(jié)構(gòu)域的端粒單鏈DNA 結(jié)合蛋白包含：WHY1、STEP1 和GTBP（表2）［33］。 WHY1 最初是作為單鏈DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分離出來，后來被發(fā)現(xiàn)還可以特異性地結(jié)合單鏈DNA 并與端粒酶相互作用［34］。STEP1 是葉綠體RNA 結(jié)合蛋白cp31 的可變剪接變體，專門定位于細(xì)胞核，與單鏈端粒和植物端粒酶相互作用，并阻止端粒酶介導(dǎo)的端粒延伸［34］。WHY1 和STEP1 對端粒酶活性的下調(diào)和上調(diào)分別表明它們在控制植物端粒穩(wěn)態(tài)方面的獨(dú)特作用［35-36］。MYB52 是一種額外的單鏈端粒結(jié)合蛋白，它也特異性結(jié)合植物端粒DNA 序列，但是其結(jié)合能力弱于WHY1 和STEP1［37］。GTBP 也是高度保守的端粒結(jié)合蛋白，在煙草中鑒定到3 個(gè)GTBP 蛋白，分別是NtGTBP1，NtGTBP2 和NtGTBP3，這3 種NtGTBP 均能在體外以相似的親和力特異性結(jié)合植物單鏈端粒重復(fù)序列元件。通過RNA 介導(dǎo)的基因敲除方法抑制NtGTBP1，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草植株發(fā)育缺陷，并伴有端粒延長、染色體外端粒環(huán)化和后期端粒結(jié)構(gòu)異常。這些結(jié)果均表明，NtGTBP1 的下調(diào)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，NtGTBP1 是維持端粒穩(wěn)定的重要因子之一［38］。

3 端粒酶

3.1 端粒酶活性調(diào)控模式

端粒長度由端粒酶維持，端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，除了其催化亞基TERT 外，它在延長端粒時(shí)攜帶自身的RNA 模板［39］。端粒酶對于植物生長發(fā)育至關(guān)重要，端粒酶功能障礙導(dǎo)致端粒逐漸縮短和細(xì)胞死亡，對擬南芥進(jìn)行相關(guān)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，T-DNA 破壞擬南芥中AtTERT基因后，每代端粒DNA 減少250～500 bp，導(dǎo)致從第6 代開始，擬南芥突變體發(fā)育異常，并且由于大量基因組不穩(wěn)定，第10 代后所有突變體全部死亡，這意味著端粒酶對于植物發(fā)育是必不可少的。POT1 蛋白AtPOT1a 與AtTERT 催化亞基的N 末端肽相互作用［40］，這些相互作用提供POT1 調(diào)節(jié)端粒酶活性的機(jī)制。此外，AtTRB 蛋白是具有Myb 結(jié)構(gòu)域的端粒雙鏈DNA 結(jié)合蛋白，也可以與端粒酶相互作用［41］。研究發(fā)現(xiàn)，植物中也存在替代端粒延長（alternative lengthening of telomeres，ALT）的途徑，ALT 機(jī)制顯然被激活以響應(yīng)端粒酶活性的喪失［42］，該結(jié)果暗示ALT 可能參與了正常的植物發(fā)育，AtKu70 抑制ALT 延長，而ATM 缺陷促進(jìn)了擬南芥中的ALT 途徑［43］。

單鏈DNA 結(jié)合蛋白Whirly1 （WHY1）最初作為轉(zhuǎn)錄因子被分離出來，后來發(fā)現(xiàn)與端粒酶相互作用并特異性結(jié)合ssDNA［44］。擬南芥中，AtWHY1 作為端粒酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子，敲除AtWHY1 突變體顯示端粒長度在幾代中穩(wěn)定增加。過表達(dá)AtWHY1 突變體表現(xiàn)出早期衰老，AtWHY1 在葉片衰老過程中與WRKY53 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合抑制基因表達(dá)上調(diào)，延緩葉片衰老（圖3Ⅰ）［44］。

圖3 單鏈結(jié)合蛋白與端粒DNA 相互作用的不同模式Fig.3 Different patterns of interaction between single-stranded binding proteins and telomere DNA

單鏈端粒結(jié)合蛋白STEP1 定位于細(xì)胞核，它是葉綠體RNA binding 蛋白cp31 的另一種剪接變體。擬南芥STEP1 與單鏈DNA 相互作用，這種結(jié)合是序列特異性的，體外驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，端粒延長被端粒酶介導(dǎo)抑制［45］，這表明AtSTEP1 是一種端粒末端結(jié)合蛋白，它通過覆蓋染色體末端和抑制植物中的端粒酶活性來增加端粒長度。AtSTEP1 包含一個(gè)部分RBD1 和完整RBD2 的RNA 結(jié)合域（RBD）［46］。每個(gè)RBD 結(jié)構(gòu)域不能與端粒DNA 序列結(jié)合；兩者都是必需的。這一發(fā)現(xiàn)與UP1 需要兩種RBD 才能與端粒DNA 結(jié)合的觀察結(jié)果一致。UP1-DNA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，UP1 以二聚體的形式與兩條DNA 鏈結(jié)合。其中一條鏈與RBD1 接觸，另一條鏈與RBD2接觸，與端粒酶相互作用，進(jìn)而調(diào)控端粒的結(jié)構(gòu)（圖3Ⅱ）［47］。

多種端粒結(jié)合蛋白在同一物種中表達(dá)，對端粒維持有不同的貢獻(xiàn)，起著消極和積極的作用，共同調(diào)節(jié)端粒長度和端粒酶活性［48］。擬南芥中的端粒結(jié)合蛋白主要包括STEP1、WHY1、MTB52 和POT1［49］。擬南芥編碼3 個(gè)全長POT1 蛋白：AtPOT1a、AtPOT1b 和AtPOT1c 蛋白［49-51］。全長AtPOT1a 和AtPOT1b 不存在單鏈DNA 結(jié)合。AtPOT1a 刺激端粒酶的重復(fù)添加過程（圖3Ⅲ），而AtPOT1b 與抑制端粒酶活性的調(diào)控IncRNA 相互作用（圖3Ⅳ）［52］。AtSTEP1 可能通過覆蓋染色體末端和抑制植物端粒酶活性來增加端粒長度。這些結(jié)果表明，端粒結(jié)合蛋白通過調(diào)節(jié)端粒長度和端粒酶活性共同維持端粒穩(wěn)態(tài)。在某種程度上，具有OB 結(jié)構(gòu)域的蛋白起著重要而積極的作用［53］。

3.2 端粒調(diào)控植物發(fā)育及衰老

最新研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶亞基參與線粒體功能以及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控［54-55］。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因TERT能夠誘導(dǎo)或者抑制促增殖和抗增殖基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，在這個(gè)過程中不依賴端粒延長，通過這種方式能使細(xì)胞在沒有有絲分裂刺激的情況下大量增殖［56］。最新研究發(fā)現(xiàn)，TERT 主要定位在細(xì)胞核中，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)也會(huì)快速響應(yīng)DNA 損傷，啟動(dòng)DNA 修復(fù)通路，同時(shí)TERT 能夠以依賴端?！懊弊印钡姆绞椒€(wěn)定端粒結(jié)構(gòu)，在不延長端粒長度的情況下延長細(xì)胞壽命［57-58］。TERT 也定位在線粒體中，增加細(xì)胞對促凋亡刺激的耐受性，阻斷線粒體死亡途徑，增加細(xì)胞的適應(yīng)性，提高線粒體活性和凋亡抗性［59］。因此將這些功能稱為端粒酶的非端粒功能（圖4）［60］。通過對端粒酶新功能的探索，有助于提高植物的抗逆性，從而延緩植物的衰老進(jìn)程，為提高作物產(chǎn)量提供一條新途徑。

圖4 端粒酶功能Fig.4 The function of telomerase

4 總結(jié)與展望

植物細(xì)胞染色體端粒包含特定的重復(fù)DNA 序列和結(jié)合蛋白，端粒的缺失或者功能異常會(huì)導(dǎo)致染色體末端融合和基因缺失，被認(rèn)為對基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。在植物中已鑒定出很多端粒結(jié)合蛋白，并且研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白對端粒維持非常重要。然而，植物端粒生物學(xué)的許多細(xì)節(jié)仍未知，例如，前期研究僅僅關(guān)注到單個(gè)端粒結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，端粒結(jié)合蛋白之間的作用關(guān)系尚未深入研究，通過闡明植物中端粒結(jié)合蛋白和端粒酶的調(diào)控機(jī)制，將極大地有助于理解保護(hù)和維持染色體末端的分子機(jī)制。

迄今為止，與動(dòng)物中的研究相比，植物中還有許多單鏈DNA 結(jié)合蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)，其功能在植物中也未見報(bào)道。自真核生物形成端粒以來，端粒復(fù)合結(jié)構(gòu)一直在進(jìn)化，從酵母到高等動(dòng)植物，單鏈復(fù)合物的組成和結(jié)構(gòu)存在差異。盡管在酵母、動(dòng)物中的端粒結(jié)合蛋白及其對端粒長度和端粒酶活性的調(diào)節(jié)方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但關(guān)于端粒結(jié)合蛋白如何與植物中的端粒DNA 結(jié)合的關(guān)鍵問題、保護(hù)和維持染色體末端的分子機(jī)制仍不明確。確定端粒結(jié)合蛋白如何影響植物染色體末端的功能和結(jié)構(gòu)是植物科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)挑戰(zhàn)。隨著對植物端粒和端粒結(jié)合蛋白的研究不斷深入，這些蛋白質(zhì)的研究領(lǐng)域和發(fā)展前景也越來越廣闊。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，研究植物端粒結(jié)合蛋白可以更好地理解植物細(xì)胞的老化和死亡機(jī)制，從而開發(fā)出植物衰老進(jìn)程調(diào)控措施等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)。