周慧丹 李孟娟 吳睿 李平平 張芮豪 呂俊恒 鄧明華

摘要? ［目的］探究涮辣與昆明皺皮椒3-氧酰基［?；d體蛋白］還原酶（3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］synthase，Kas）的差異。［方法］特異性擴(kuò)增了Kas，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。利用熒光定量 PCR 及酶活性測定方法測定了不同發(fā)育時(shí)期、不同環(huán)境及6種外源因子處理下 Kas 表達(dá)量及酶活性。［結(jié)果］擴(kuò)增得到的涮辣和昆明皺皮椒 Kas 基因均為 1 467 bp，編碼 488個(gè)氨基酸。Kas為脂溶性、親水性的穩(wěn)定蛋白，無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)，主要定位于質(zhì)膜。在不同發(fā)育階段，2種辣椒 Kas 表達(dá)水平與酶活性的趨勢均為先升高后急劇降低，且在大部分發(fā)育階段均表現(xiàn)為露地栽培高于大棚栽培；同一環(huán)境條件下，涮辣 Kas 表達(dá)與酶活性整體高于昆明皺皮椒；且不同外源物質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)可影響涮辣 Kas 的表達(dá)，其中MeJA和SA處理對Kas表達(dá)量影響較大。［結(jié)論］涮辣與昆明皺皮椒 Kas 基因和蛋白特性相似，但存在差異，在辣椒生長發(fā)育、環(huán)境和外源物質(zhì)響應(yīng)方面有重要功能。

關(guān)鍵詞? 涮辣；昆明皺皮椒；3-氧酰基［?；d體蛋白］還原酶（Kas）；生物信息學(xué)

中圖分類號? Q943.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）01-0090-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Bioinformatics and Expression Analysis of 3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］Synthase （Kas） from Capsicum chinense and C. annuum

ZHOU Hui-dan， LI Meng-juan， WU Rui et al

（College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract? ［Objective］To investigate the difference of 3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］synthase （Kas） between Capsicum chinense and C. annuum

. ［Method］Kas was specifically amplified and bioinformatic analysis was performed.Kas expression and enzyme activity were determined by quantitative PCR and enzyme activity assay under different development stages， different environments and six exogenous factors. ［Result］The Kas gene of Capsicum chinense and C. annuum was 1 467 bp， encoding 488 amino acids. Kas is a lipopolysaccharide， hydrophilic and stable protein with no signal peptide and transmembrane structure， which is mainly located in the plasma membrane. At different developmental stages， Kas expression level and enzyme activity of both kinds of capsicum were increased first and then decreased sharply， and in most developmental stages， they were higher in open field than in greenhouse cultivation. Under the same environmental conditions， Kas expression and enzyme activity in Capsicum chinense were higher than those in C.annuum. In addition， different exogenous substances could affect Kas expression in Capsicum chinense in a certain period of time， among which MeJA and SA treatments had a greater effect on Kas expression. ［Conclusion］The Kas gene and protein characteristics were similar but different between Capsicum chinense and C. annuum，which had important functions in pepper growth and development， environment and foreign substance response.

Key words? Capsicum chinense;C.annuum;3-oxoacyl-［Acyl-carrier-protein］synthase （Kas）;Bioinformatics

基金項(xiàng)目? 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160708）；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（202102AE090005，202205AR070001）。

作者簡介? 周慧丹（1998—），女，云南昆明人，碩士研究生，研究方向：蔬菜遺傳育種。

*通信作者，教授，博士，從事園藝植物生物學(xué)研究。

收稿日期? 2023-02-06

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科辣椒屬的一年生或者有限多年生的草本植物。辣椒在全世界種植廣泛，我國是辣椒的生產(chǎn)大國，種植歷史已有300余年。辣椒是維生素和色素的來源之一，常被用作蔬菜、香料［1］。涮辣是云南省特有的種質(zhì)資源，主要分布于云南省的德宏、保山和西雙版納等地，喜溫耐熱，成熟果實(shí)色澤艷麗鮮紅，最主要的是其辣度可與墨西哥的魔鬼椒以及印度的斷魂椒相媲美，做菜時(shí)可在湯里涮涮，整鍋湯就會(huì)有辣味，故取名為“涮辣”［2-4］。辣椒的特點(diǎn)是味道辛辣，這是由于存在一組被稱為辣椒素的化合物，該類物質(zhì)主要在辣椒屬果實(shí)的胎盤中特異合成［5］。這些次生代謝物具有一系列的生物活性和工業(yè)應(yīng)用，例如，辣椒素對于植物保護(hù)抵御一些食草動(dòng)物、昆蟲和微生物是重要的，并且可以作為鳥類傳播種子的選擇劑［6-7］。辣椒素類物質(zhì)具有多種藥理作用，已被用于制造個(gè)人化學(xué)防御裝置以及用于緩解關(guān)節(jié)炎、皰疹或腫瘤切除術(shù)后疼痛的護(hù)墊和乳膏等［8-12］。辣椒素類物質(zhì)只在辣椒屬中合成和積累，研究辣椒中辣椒素的形成機(jī)制，對于提高辣椒素產(chǎn)量具有重要意義。

辣椒素主要在辣椒果實(shí)的胎盤組織中合成［13］，并在開花后10～20 d開始積累，20～40 d增加，達(dá)到最大值后遞減［14］。辣椒素是通過源自類苯丙酸途徑的香草胺及源自支鏈脂肪酸途徑的一系列支鏈脂肪酸部分縮合而成的。苯丙氨酸是苯丙素生物合成的主要前體，而纈氨酸或亮氨酸是支鏈脂肪酸合成的前體底物，最終用于辣椒素生物合成［15］。由于植物的遺傳組成不同，辣椒果實(shí)可以表現(xiàn)出不同程度的辣味，但是辣味也依賴于果實(shí)的發(fā)育階段和辣椒生長的環(huán)境條件［16-17］。在辣椒素生物合成途徑中，3-氧?；；d體蛋白）還原酶（Kas）位于脂肪酸合成支鏈上。Kas 與?；D(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶（Acl）和 ACP-酰基硫酯酶（FatA）組成了脂肪酸合酶（FAS）復(fù)合體，催化脂肪鏈的延伸［18］。Aluru等［19］從辛辣型辣椒品種Habanero果實(shí)的胎座中篩選到8個(gè)編碼辣椒素生物合成活性物質(zhì)的cDNA克隆，并發(fā)現(xiàn)其中3-酮酯酰-ACP合成酶基因（Kas）、依賴磷酸吡哆醛的轉(zhuǎn)氨酶基因（pAmt），乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因（4A1）是胎座特異表達(dá)基因。Del等［20］基于基因沉默（VIGS）法沉默Comt、pAmt和Kas基因，發(fā)現(xiàn)沉默后的辣椒果實(shí)中辣椒素積累減少，由此證實(shí)了辣椒素的積累與Kas等基因的表達(dá)相關(guān)。利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)研究了Comt、pAmt 和Kas基因表達(dá)水平與辣椒素的積累量關(guān)系。任何一個(gè)基因Comt、pAmt 和 Kas的沉默都會(huì)導(dǎo)致辣椒素含量的急劇下降。雷建軍等［21］獲得了5個(gè)辣椒轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)利用基因沉默等技術(shù)解釋了pAMT、Kas等基因?qū)苯匪睾康恼蛑笇?dǎo)作用。辣椒素的合成積累與環(huán)境條件也密切相關(guān)，有研究表明，在干旱、高溫、光照條件下辣椒素類物質(zhì)的積累增加［22-25］。Medina-Lara等［26］研究表明，氮肥顯著增加了辣椒的生長和果實(shí)產(chǎn)量，同時(shí)辣椒素含量也維持在較高水平。Tewksbury等［27］在對野生辣椒調(diào)查中指出，總辣椒素含量隨著海拔的升高而顯著增加。大量研究表明，一定濃度的外源激素處理能顯著提高辣椒果實(shí)中辣椒素類物質(zhì)的積累。較低濃度的水楊酸和茉莉酸甲酯噴施有利于辣椒素和二氫辣椒素的積累［28］，脫落酸處理能顯著提高辣椒素的含量，并在各時(shí)期都與對照有顯著差異［29］。

涮辣的辣椒素含量極高，達(dá)19.814 8 mg/g，二氫辣椒素含量6.107 4 mg/g，辣度級別超過10級，且涮辣辣度為昆明皺皮椒的42.4倍［30］。筆者選取辣椒素積累差異較大的2個(gè)云南本地特色品種：涮辣和昆明皺皮椒作為試驗(yàn)材料，研究辣椒素的合成。鑒于Kas在辣椒素生物合成方面的重要作用，且目前國內(nèi)關(guān)于涮辣辣椒素合成與Kas酶的研究較少，為進(jìn)一步探究涮辣辣椒素積累高的原因，以昆明皺皮椒為參照，從涮辣和皺皮椒中分離并鑒定了2條Kas基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析Kas特性；利用qPCR方法測定了不同發(fā)育時(shí)期、環(huán)境條件下Kas表達(dá)水平，旨在探究涮辣與昆明皺皮椒Kas基因和酶的差異，與不同發(fā)育時(shí)期、環(huán)境條件和外源物質(zhì)處理下Kas表達(dá)規(guī)律，并為解釋Kas在云南特色涮辣辣椒素積累方面提供理論借鑒與參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

涮辣和昆明皺皮椒都來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園

藝學(xué)院番茄辣椒實(shí)驗(yàn)室，在后山露天和大棚2種環(huán)境條件下栽培。以花后每10 d為1個(gè)發(fā)育時(shí)期，選擇7個(gè)發(fā)育時(shí)期的辣椒果實(shí)為試驗(yàn)材料，分別提取2種辣椒的RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行Kas基因克隆，以下Kas 1為涮辣Kas，Kas 2為昆明皺皮椒Kas。

1.2? 方法

1.2.1? Kas基因的分離與鑒定。

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載已有的CaKas基因序列，并根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物（表1），委托北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。使用北京華越洋生物技術(shù)有限公司的RNA提取試劑盒提取涮辣和昆明皺皮椒的總RNA，利用YEASEN公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，凝膠電泳檢測后回收特異性PCR產(chǎn)物送北京擎科生物有限公司測序，得到目的片段序列。

1.2.2? 涮辣和昆明皺皮椒的Kas基因特性及蛋白特性分析。

按照表2所列方法對涮辣及昆明皺皮椒的Kas基因、蛋白特性進(jìn)行分析。

1.2.3? 不同發(fā)育時(shí)期涮辣與昆明皺皮椒的 Kas 表達(dá)水平測定。

利用 Primer 6 設(shè)計(jì) qRT-PCR 引物（表 1），對大棚和露天種植的涮辣和昆明皺皮椒以 10 d 為 1 個(gè)發(fā)育時(shí)期，共對果實(shí) 7 個(gè)發(fā)育時(shí)期的 Kas 表達(dá)水平進(jìn)行測定，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用上述方法合成 cDNA。熒光定量 PCR 反應(yīng)總體系 20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，10.0 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，在 Eppendorf 熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)。試驗(yàn)采用相對定量的方法，以 ACTIN 基因?yàn)閮?nèi)參，使用 2-△△CT方法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.4? 不同發(fā)育時(shí)期涮辣與昆明皺皮椒的Kas酶活性測定。使用植物（Plant）3-氧?；??；d體蛋白還原酶（3-ACPR）ELISA檢測試劑盒進(jìn)行測定，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5? 6種不同外源因子處理涮辣及其Kas表達(dá)水平測定。

采集涮辣花后 30 d 果實(shí)，用脫落酸（ABA，0.5 mmol/L）、赤霉素（GA3，0.5 mmol/L）、過氧化氫（H2O2，30%水溶液）、茉莉酸甲酯（MeJA，0.1 mmol/L）、水楊酸（SA，0.1 mmol/L）和褪黑素（MT，0.1 mmol/L）6 種外源物質(zhì)分別對果實(shí)胎座進(jìn)行不同時(shí)間處理（0、3、6、12、15 h），其中 0 h 為未處理樣品，以內(nèi)參基因 ACTIN作為校正，測定 Kas 表達(dá)水平。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 涮辣和昆明皺皮椒的Kas基因特性

2.1.1? Kas基因堿基序列對比。

以涮辣、昆明皺皮椒cDNA為模板進(jìn)行Kas基因RT-PCR特異性擴(kuò)增，對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證后測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST驗(yàn)證，涮辣Kas與NCBI 數(shù)據(jù)庫中Kas（GeneID：107864098）基因序列同一性為 98.91%，皺皮椒Kas高達(dá)99.39%。開放閱讀框預(yù)測顯示：涮辣和昆明皺皮椒Kas基因均由1 467 個(gè)堿基組成，編碼488個(gè)氨基酸殘基。與昆明皺皮椒相比，涮辣Kas存在7個(gè)SNP位點(diǎn)：68（T to G），192（T to C），571（A to G），745（G to T），774（G to T），975（G to A），1 221（T to C）。如圖1，氨基酸序列上存在3個(gè)SNP位點(diǎn) 23（V to G），191（T to A），249（A to S），其他堿基突變?yōu)橥x突變。利用NCBI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，涮辣和昆明皺皮椒Kas基因的氨基酸序列在27～488這一位置上均有一段相同的結(jié)構(gòu)域。

2.1.2? 辣椒及其他常見茄科植物Kas上游順式元件預(yù)測。

選擇包含辣椒在內(nèi)共5種茄科植物Kas基因進(jìn)行上游順式元件預(yù)測，對預(yù)測到的順式元件進(jìn)行篩選后，共得到 584 個(gè)順式元件，其中辣椒（Capsicum annuum）93 個(gè)，番茄（Solanum lycopersicum）109 個(gè)，野生二倍體煙草（Nicotiana attenuate）83 個(gè)，煙草（Nicotiana tabacum）153 個(gè)，馬鈴薯（Solanum tuberosum）146 個(gè)（圖 2）。預(yù)測到的順勢元件按類型可分為核心元件：-30轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)；植物激素響應(yīng)元件：MeJA、GA、ABA、SA、Auxin響應(yīng)元件；環(huán)境因子響應(yīng)元件：光、低溫、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件；MYB結(jié)合位點(diǎn)：干旱誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)和MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。在辣椒中除核心元件外，還有32個(gè)其他元件。包括環(huán)境因子響應(yīng)元件：12個(gè)光響應(yīng)元件，6個(gè)厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，3個(gè)低溫響應(yīng)元件；植物激素響應(yīng)元件：MeJA、GA響應(yīng)元件各2個(gè)，SA、ABA響應(yīng)元件各1個(gè)；MYB結(jié)合位點(diǎn)：4個(gè)干旱誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。

2.2? 涮辣與昆明皺皮椒Kas的蛋白特性

2.2.1? 不同物種 Kas 蛋白保守結(jié)構(gòu)。

選取包括茄科、十字花科、豆科、旋花科、錦葵科、茜草科和薔薇科7科共 45 條 Kas 氨基酸序列進(jìn)行保守 motif 分析，結(jié)果（圖 3）顯示：共得到 19 個(gè)顯著保守的motif，其中，包括涮辣與昆明皺皮椒在內(nèi)的所有植物都含有10、6、4、7、1、9、14、3、11、5、15、8、2不同保守motif。由此可推測，以上13個(gè)保守motif是Kas蛋白結(jié)構(gòu)的重要組成部分，且是保證不同物種之間Kas功能相似的決定性結(jié)構(gòu)。

2.2.2? 涮辣與昆明皺皮椒 Kas 理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測。

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示：涮辣與昆明皺皮椒Kas蛋白分子式分別為C2302H3666N644O704S22和C2306H3674N644O704S22，相對分子量分別為52 333.64和52 389.75，理論等電點(diǎn)（PI）均為7.98，均為脂溶性、親水性的穩(wěn)定蛋白。 BUSCA 預(yù)測結(jié)果顯示，涮辣與昆明皺皮椒 Kas 定位在質(zhì)膜上的確定性為 0.700。

2.2.3? 涮辣與昆明皺皮椒的 Kas 蛋白二級結(jié)構(gòu)。

對2種辣椒Kas蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示：涮辣和昆明皺皮椒Kas蛋白均含有α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4種二級結(jié)構(gòu)，其中α螺旋和無規(guī)卷曲占主要部分（涮辣77.05%；昆明皺皮椒76.84%），涮辣Kas蛋白中無規(guī)卷曲和延伸鏈多于昆明皺皮椒，而α螺旋和β轉(zhuǎn)角少于昆明皺皮椒（圖4）。

2.2.4? 涮辣與昆明皺皮椒Kas蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

利用 I-TASSER 預(yù)測 pAMT 三級結(jié)構(gòu)模型，其中C 值代表模型置信度，范圍為-5～2 ，得分越高代表模型越可靠。涮辣共構(gòu)建出5個(gè)模型，其中C值最高為-0.83（圖5A）；昆明皺皮椒也構(gòu)建出5個(gè)模型，其中最高得分為-0.53（圖5D）。同時(shí)對Kas配體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，其中C值為預(yù)測置信度，范圍在0～1，C值越大代表準(zhǔn)確度越高。涮辣Kas預(yù)測C值為0.43，配體名稱為CER，結(jié)合位點(diǎn)殘基為183、184、238、239、273、277、278、379、415、472、473、474（圖5B）；昆明皺皮椒配體結(jié)合位點(diǎn)得分為0.51，配體名稱也為CER，結(jié)合位點(diǎn)殘基為183、184、238、239、274、277、278、379、415、472、473、474（圖5E）。然后對Kas Enzyme Commission numbers（EC）和酶活性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，其 CscoreEC值在 0～1，值越大代表 EC 值置信度越高。涮辣Kas CscoreEC最高為0.314，EC號為2.3.1.86，無活性位點(diǎn)殘基（圖5C）；昆明皺皮椒CscoreEC最高為0.414，EC號為2.3.1.41，活性位點(diǎn)殘基為473、475、477（圖5F）。

2.2.5? 涮辣與昆明皺皮椒 Kas 蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)與磷酸化位點(diǎn)預(yù)測。

SignalP-5.0與TMHMM Server v.2.0預(yù)測結(jié)果顯示，涮辣和昆明皺皮椒的Kas均無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。運(yùn)用NetPhos 3.1 Server對涮辣與昆明皺皮椒Kas蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，同時(shí)對預(yù)測位點(diǎn)在0～1進(jìn)行打分，預(yù)測位點(diǎn)可信度隨得分從0.5到1.0增加而增大，涮辣Kas評分≥0.5的磷酸化位點(diǎn)有63個(gè)，昆明皺皮椒有67個(gè)。以不同磷酸化類型來分，涮辣與昆明皺皮椒Kas都有13種Y型，而S型和T型存在差異，其中涮辣有36個(gè)S型，14個(gè)T型；昆明皺皮椒有39個(gè)S型，15個(gè)T型（圖6）。

2.2.6? 不同物種Kas系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

以選取的包括涮辣和昆明皺皮椒在內(nèi)共45條Kas序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖7），結(jié)果表明：不同Kas序列在系統(tǒng)發(fā)育上按照茄科、十字花科、豆科、旋花科、錦葵科、茜草科和薔薇科7個(gè)不同的科聚為四大類群。其中，茄科植物中Kas又分出眾多亞支。涮辣和昆明皺皮椒Kas與同科同屬的C.chinense（AAC78479.1）和C.annuum（KAF3663893.1）在系統(tǒng)發(fā)育上親緣關(guān)系最近，與C.baccatum（PHT57835.1）最遠(yuǎn)；不同屬中，與茄屬的親緣關(guān)系最近；不同科中，與茜草科最近，與豆科親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3? 涮辣與昆明皺皮椒Kas基因表達(dá)及酶活性

2.3.1  不同環(huán)境條件下涮辣與昆明皺皮椒Kas基因表達(dá)。

Kas基因的表達(dá)在材料和環(huán)境間的差異十分顯著。Kas基因在涮辣和昆明皺皮椒果實(shí)發(fā)育過程中的變化趨勢基本一致，都是在果實(shí)發(fā)育前期（1～20 d）維持在一個(gè)較低的表達(dá)水平，但不斷升高；在果實(shí)發(fā)育中期（30～50 d）維持在一個(gè)非常高的水平，其中在50 d達(dá)到最高值，是0 d的130倍左右；在果實(shí)發(fā)育的后期（60～70 d）維持在一個(gè)較低水平，且不斷下降，但表達(dá)水平顯著高于果實(shí)發(fā)育前期。在同一環(huán)境條件下，涮辣的表達(dá)水平要高于昆明皺皮椒；在同一材料中，大棚表達(dá)水平要顯著低于露地表達(dá)水平（圖8）。

2.3.2? 在果實(shí)不同發(fā)育階段和環(huán)境條件下Kas酶活性差異。

Kas酶活性在涮辣和昆明皺皮椒果實(shí)發(fā)育過程中的變化趨勢基本一致，即在果實(shí)發(fā)育前期（0～20 d）維持在較低水平；在果實(shí)發(fā)育中期（30～50 d）維持在較高水平，并在花后50 d達(dá)到最高值；在果實(shí)發(fā)育后期（60～70 d），維持在較低水平，且不斷下降。對同一材料果實(shí)同一發(fā)育階段而言，大棚環(huán)境下Kas酶活性要低于露地環(huán)境。Kas 酶活性在不同材料間差異顯著。在果實(shí)發(fā)育初期，涮辣和昆明皺皮椒Kas酶活性均處于較低水平，但涮辣Kas酶活性要高于昆明皺皮椒；在果實(shí)發(fā)育中期，涮辣Kas酶活性要顯著高于昆明皺皮椒，且在花后40 d差異達(dá)到最大；在果實(shí)發(fā)育后期，涮辣Kas酶活性仍高于昆明皺皮椒（圖9）。

2.4? 不同外源物質(zhì)處理對涮辣Kas基因表達(dá)的影響

整體上看，Kas基因的表達(dá)量對MeJA和SA處理的反應(yīng)最為明顯。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，Kas基因的表達(dá)量在ABA處理下隨處理時(shí)長的變化而變化，整體呈上升趨勢，在3 h略微下降，6 h迅速上升，隨后在12 h急速下降，15 h又上升；GA3處理下隨處理時(shí)間的延長呈上升—下降—升高的變化趨勢，其中15 h的表達(dá)水平最高；在H2O2處理下呈先下降后上升的變化趨勢，其中15 h的表達(dá)水平最高，在3～6 h持續(xù)下降，12～15 h上升；MeJA處理下呈上升—下降—上升的趨勢，其中3 h表達(dá)水平最高，于6 h迅速下降，于12 h繼續(xù)上升，15 h變化趨于平緩；在SA處理下隨處理時(shí)間的延長呈先上升后下降趨勢，其中3 h表達(dá)水平最高，從6 h開始持續(xù)下降；在MT處理下隨處理時(shí)間的延長呈下降—上升—下降的趨勢，在3 h下降，6～12 h上升，在12 h的表達(dá)水平最高，于15 h再次下降（圖10）。

3? 討論

3.1? 2種辣椒的pAMT基因及蛋白結(jié)構(gòu)差異影響辣椒素合成

辣椒素生物合成經(jīng)過由苯丙氨酸途徑形成香草胺或經(jīng)支鏈脂肪酸途徑，由纈氨酸或亮氨酸形成支鏈脂肪酸，最終香草胺和支鏈脂肪酸合成辣椒素，而Kas催化脂肪鏈的延伸。阮文淵等［31］擴(kuò)增得到辣椒Kas基因DNA序列，研究結(jié)果表明，Kas主要在胎座上表達(dá)并影響辣椒素的合成。該研究利用基因克隆方法，從涮辣與昆明皺皮椒中分離并鑒定了二者的Kas基因。2種辣椒的Kas長度為1 467 bp，各自編碼488個(gè)氨基酸殘基。以昆明皺皮椒作為參考，發(fā)現(xiàn)盡管二者序列大小相同，但在涮辣Kas中存在7個(gè)SNP位點(diǎn)，最終導(dǎo)致形成3個(gè)氨基酸殘基SNP位點(diǎn)。因此，涮辣Kas的突變可能是其產(chǎn)生高含量辣椒素的正向突變。

通過對不同物種Kas氨基酸序列保守motif分析，在一定程度上反映了Kas有較高的保守性，但部分物種Kas包含特有motif，也說明不同物種對Kas蛋白功能的需求存在差異。同時(shí)，不同辣椒Kas蛋白保守結(jié)構(gòu)間的差異可能是辣椒素生物合成產(chǎn)生差異的重要原因。涮辣Kas基因的突變導(dǎo)致二者蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。相對于昆明皺皮椒二級結(jié)構(gòu)，涮辣Kas蛋白含較少的β轉(zhuǎn)角和α螺旋以及較多的無規(guī)卷曲、延伸鏈。預(yù)測的涮辣和昆明皺皮椒Kas的三級結(jié)構(gòu)模型結(jié)果顯示，2種辣椒的Kas配體名稱均為CER，但二者配體結(jié)合位點(diǎn)存在不同，涮辣配體結(jié)合位點(diǎn)殘基為183、184、238、239、273、277、278、379、415、472、473、474；昆明皺皮椒結(jié)合位點(diǎn)殘基為183、184、238、239、274、277、278、379、415、472、473、474。同時(shí)預(yù)測的涮辣EC號為2.3.1.86，無活性位點(diǎn)殘基；昆明皺皮椒EC號為2.3.1.41，活性位點(diǎn)殘基為473、475、477。Kas活性位點(diǎn)的差異，可能導(dǎo)致了涮辣和昆明皺皮椒Kas在底物和反應(yīng)特性的不同，進(jìn)而影響辣椒素的合成。總而言之，Kas基因突變引起的蛋白結(jié)構(gòu)差異是影響涮辣與昆明皺皮椒辣椒素含量的重要原因。

3.2? Kas參與環(huán)境、外源因子對辣椒的調(diào)控，且影響辣椒素積累

通過NCBI公共數(shù)據(jù)庫，下載了包括辣椒在內(nèi)的5條茄科植物Kas上游2 500 bp序列，并對其順式元件進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果表明，辣椒Kas基因的表達(dá)調(diào)控受到SA、MeJA等植物激素、光及低溫的調(diào)控。通過對涮辣果實(shí)胎座進(jìn)行6種外源植物激素處理后發(fā)現(xiàn)，SA、MeJA等外源物質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)影響涮辣Kas基因表達(dá)，同時(shí)這些結(jié)果在前人報(bào)道中也得了驗(yàn)證［32-34］。基于qPCR技術(shù)對涮辣和昆明皺皮椒Kas表達(dá)水平進(jìn)行了測定和分析，結(jié)果表明，Kas基因的表達(dá)在不同環(huán)境和材料間差異顯著，均呈先升高再急劇下降趨勢。許多研究也發(fā)現(xiàn)，辣椒素含量隨果實(shí)發(fā)育階段呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且辣味程度與Kas表達(dá)呈正相關(guān)［35-39］。進(jìn)一步解釋了辣椒發(fā)育過程中辣椒素積累與Kas的關(guān)系。該研究中，對同一材料果實(shí)同一發(fā)育階段而言，大棚環(huán)境下Kas酶活性和表達(dá)均低于露地環(huán)境，故推測露地與大棚2種不同的栽培條件下環(huán)境因子的差異對Kas酶活性及表達(dá)有影響，如低溫等因素可能誘導(dǎo)辣椒Kas較高表達(dá)，以產(chǎn)生較多次生代謝物質(zhì)來抵御環(huán)境脅迫。因此，環(huán)境因素、發(fā)育時(shí)期和外源因子可通過調(diào)控Kas的表達(dá)來影響辣椒中辣椒素的積累。在同一栽培環(huán)境下，涮辣Kas的酶活性和表達(dá)均高于昆明皺皮椒，推測涮辣Kas基因的高表達(dá)可能是其辣椒素含量極高的原因之一。

4? 結(jié)論

特異性擴(kuò)增得到涮辣和昆明皺皮椒Kas基因，生物信息學(xué)分析表明，涮辣與昆明皺皮椒Kas基因和Kas蛋白存在差異，在進(jìn)化關(guān)系上具有保守性。同時(shí)Kas在涮辣和昆明皺皮椒生長發(fā)育過程中有重要功能，并且參與外源物質(zhì)的調(diào)控。

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