王永芳, 陳其勇, 俞子萱, 李淑靜

(天津海關(guān)動植物與食品檢測中心,天津 300461)

苯并烯氟菌唑(benzovindiflupyr),是吡唑酰胺類殺菌劑,具有新型作用機(jī)制的琥珀酸脫氫酶抑制劑[1],通過抑制病原菌的琥珀酸脫氫酶活性,導(dǎo)致病原菌的死亡,從而達(dá)到防治病害的效果[2,3]。苯并烯氟菌唑廣譜、高效、持效期長,可廣泛應(yīng)用于葉面病害和土壤病原菌的防治,對大豆、小麥、玉米、花生常見作物的小斑病及灰霉病具有良好的防效[4],巴西、美國等多個(gè)大豆出口國進(jìn)行了苯并烯氟菌唑的藥劑登記使用[5-8]。

苯并烯氟菌唑與現(xiàn)有殺菌劑無交互抗性,是一個(gè)極具潛力的殺菌劑,也是重要的抗性管理工具[9,10]。苯并烯氟菌唑分子式為C18H15Cl2F2N3O,熔點(diǎn)為148.4 ℃,水中溶解度為0.98 mg/L(25 ℃),為弱極性化合物。該殺菌劑對植物無風(fēng)險(xiǎn),對虹鱒魚和海洋無脊椎動物高毒,在土壤中相當(dāng)穩(wěn)定,不易水解、光解[11]。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[12]中只明確了苯并烯氟菌唑在大豆中的最大殘留限量0.08 mg/kg,并未制定檢測標(biāo)準(zhǔn),目前我國沒有檢測苯并烯氟菌唑的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。巴西對豆類中苯并烯氟菌唑的限量要求為0.05 mg/kg,美國對大豆中苯并烯氟菌唑的限量要求為0.07 mg/kg,歐盟對大豆中苯并烯氟菌唑的限量要求為0.2 mg/kg。目前檢測苯并烯氟菌唑的文章資料有隋程程等[13]發(fā)表的動物源性食品中苯并烯氟菌唑的檢測,姜宜飛等[14]發(fā)表了苯并烯氟菌唑原藥高效液相色譜分析方法研究,鮮有發(fā)表大豆中苯并烯氟菌唑的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。

我國是目前世界最大的大豆進(jìn)口國,根據(jù)海關(guān)數(shù)據(jù),2021年進(jìn)口大豆占全國總需求的85.5%[15]。大豆主要用來壓榨制作大豆油,豆粕用作飼料,大豆中的苯并烯氟菌唑殘留容易轉(zhuǎn)移到大豆油中,殘留到豆粕中。經(jīng)查閱文獻(xiàn),苯并烯氟菌唑?yàn)橹卸绢愞r(nóng)藥, 為了保障進(jìn)口食品的質(zhì)量安全,保障大眾餐桌上的安全,本研究建立了一種由QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)進(jìn)行樣品提取、凈化,LC-MS/MS進(jìn)行檢測的快速高效的方法,為相關(guān)執(zhí)法部門提供技術(shù)支撐,同時(shí)為制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

大豆:來源于超市和菜市場。

苯并烯氟菌唑:純度>98.0%;乙腈;甲醇;乙酸銨(>98.0%),氯化鈉(>99.5%);無水硫酸鎂;甲酸:色譜純,乙酸:色譜純;乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA):40～60 μm;十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18):40～60 μm;陶瓷均質(zhì)子。

1290- 6460液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,AL204-IC型電子天平,Promax-2020型水平往復(fù)振蕩器,XH-D型渦旋混合器,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,離心機(jī),純水儀,1000-Y型高速多功能粉碎機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈溶解,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃冰箱進(jìn)行保存。根據(jù)檢測需要,用乙腈逐級稀釋至所需濃度。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制:選擇空白大豆基質(zhì),將上述儲備液逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.002、0.004、0.010、0.02、0.04、0.10、0.20 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

流動相配制: 0.1%甲酸-水溶液: 1 L高純水中, 加入1 mL 甲酸,搖勻,常溫保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。10 mmol乙酸銨-0.1%甲酸-水溶液:稱取乙酸銨0.78 g,溶解于1 L高純水中,再加入1 mL 甲酸,搖勻,常溫保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 色譜條件

色譜柱:Eclipse C18,100 mm×2.1 mm,1.7 μm; 流速:0.3 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動相:流動相A:乙腈;流動相B:0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫程序:0～1 min,10%A;1～7 min,100%A;7～8 min,10%A。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧離子源,負(fù)離子模式掃描; 檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式;電噴霧電壓:3 500 V;霧化氣壓力:45 psi;離子源溫度:350 ℃;其他參數(shù)見表1。

表1 苯并烯氟菌唑質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 樣品前處理

提取:取2 g大豆均質(zhì)試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入5 mL水渦旋混勻,靜置15 min, 加入含1%乙酸乙腈10 mL,加入2 g氯化鈉,劇烈震蕩1 min,8 000 r/min離心5 min,上清液待凈化。

凈化:吸取4 mL上清液于15 mL 離心管中,加入200 mg C18粉末,200 mg PSA粉末,渦旋混勻1 min。8 000 r/min離心5 min,吸取上清液過微孔濾膜,用于測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的確定

隨著大眾對食品質(zhì)量安全要求的不斷提升,對實(shí)驗(yàn)室檢測水平及能力也提出了更高的要求,不但檢得準(zhǔn),檢得全,還要檢得快。目前市場上的商品琳瑯滿目,這就造成檢測種類多,檢測基質(zhì)復(fù)雜等問題,常規(guī)的農(nóng)藥殘留檢測分析過程包括:勻漿、萃取、濃縮、凈化和分析,在整個(gè)過程中樣品前處理是最繁瑣,最花費(fèi)時(shí)間的步驟,同時(shí)也是影響分析結(jié)果的精確度和準(zhǔn)確度的重要步驟。其中容易造成目標(biāo)物損失的是濃縮和凈化步驟,為提升整個(gè)實(shí)驗(yàn)的檢測效率,Schenck等[16]開發(fā)了QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法, 自2003年以來,各國研究者都有所研究,建立了很多改進(jìn)的方法[17-20]。目前經(jīng)過改良的QuEChERS前處理方法很受青睞。

本方法采用改良的QuEChERS方法進(jìn)行前處理,結(jié)合大豆基質(zhì)特點(diǎn),含有大量油脂,乙腈在提取過程中,加入1%乙酸并采用冷凍離心,能很好的減少脂肪和其他雜質(zhì)的溶出,能減少基質(zhì)對苯并烯氟菌唑目標(biāo)物的干擾。由于大豆比較干燥,在乙腈提取前加入適量水浸泡,能更好的提取目標(biāo)物。QuEChERS方法常用的凈化劑有 PSA、C18、GCB等, PSA主要去除有機(jī)酸和色素,C18主要去除脂肪,GCB主要去除色素。本研究比較了3種不同凈化劑(PSA,C18,GCB各100 mg)對純?nèi)軇┲斜讲⑾┓虻奈叫Ч?。結(jié)果表明GCB對苯并烯氟菌唑有較強(qiáng)的吸附,回收不到50%,PSA和C18對目標(biāo)物沒有吸附,因此本研究選擇PSA,C18作為凈化劑。為了考察PSA和C18凈化效果,本研究對大豆樣品提取液進(jìn)行凈化,用量及組合見表2。PSA和C18各100 mg時(shí)回收率為68.2%,PSA,C18各200 mg,回收率提升,PSA,C18各300 mg時(shí),回收率變化不大,PSA200 mg和C18各200 mg組合使用時(shí),回收率最高97.6%,滿足實(shí)驗(yàn)的要求。最終選擇PSA和C18各200 mg作為凈化劑進(jìn)行凈化。

表2 不同凈化劑對大豆中苯并烯氟菌唑的凈化效果

表3 方法的平均回收率和精密度(n=6)

2.2 儀器方法的確定

考慮到樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾,為使目標(biāo)化合物獲得較好的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度,降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾,對下列幾種流動相進(jìn)行比較:A乙腈-10 mmol/L 乙酸銨水溶液 ;B甲醇-1%甲酸水;C乙腈-1%甲酸水,見圖1。通過對流動相的考察,發(fā)現(xiàn)乙腈-10 mmol/L 乙酸銨水溶液(A)和甲醇-水(B)這兩種流動相的色譜圖中出現(xiàn)雜質(zhì)峰。通過響應(yīng)強(qiáng)度比較,乙腈-水(C)流動相中苯并烯氟菌唑的響應(yīng)強(qiáng)度最高,峰型更好,乙腈-水(C)出峰時(shí)間比乙腈-10 mmol/L 乙酸銨水溶液(A) 和 甲醇-1%甲酸水(B)出峰時(shí)間稍晚,綜合峰形和響應(yīng)強(qiáng)度情況,最終選擇乙腈-1%甲酸水作為流動相。

注:a乙腈-10 mmol/L 乙酸銨水溶液;b甲醇-1%甲酸水;c乙腈-1%甲酸水。圖1 3種不同流動相苯并烯氟菌唑的色譜圖

苯并烯氟菌唑分子式中含有2個(gè)氟、2個(gè)氯的鹵代基,在電離過程中,分子中易失去氫質(zhì)子,形成負(fù)離子,所以本方法在電噴霧離子源(ESI)下采用負(fù)離子模式進(jìn)行掃描,選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行分析。首先對目標(biāo)物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析,確定目標(biāo)物的母離子,在MS2 SIM掃描模式下優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓(Fragmentor)參數(shù),按照優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,通過Product Ion掃描模式進(jìn)行分析,選取信號最強(qiáng)的兩個(gè)子離子,通過MRM掃描模式進(jìn)一步優(yōu)化,確定為各自的定量參數(shù)(見表1)。按照上述優(yōu)化的前處理參數(shù)和儀器參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 方法性能學(xué)考察

3.1 基質(zhì)效應(yīng)

在選用質(zhì)譜進(jìn)行樣品分析時(shí),會存在基質(zhì)效應(yīng)(ME)問題。空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相比,當(dāng)比值大于1,表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),當(dāng)比值小于1,表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)[21]。通常采用同一樣品的空白基質(zhì)配制曲線進(jìn)行校正定量,或者選用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法等方法減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾[22]。本方法選擇空白大豆基質(zhì),用該空白基質(zhì)溶液和純試劑乙腈分別配制一定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,斜率比值為0.74,說明苯并烯氟菌唑在大豆基質(zhì)中存在抑制效應(yīng),本研究為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,選用相應(yīng)的大豆空白基質(zhì)配制曲線。

3.2 方法的線性關(guān)系及靈敏度

在空白大豆基質(zhì)中,分別添加10、20、50、100、200 μg/kg梯度水平制作基質(zhì)曲線,苯并烯氟菌唑曲線的線性關(guān)系良好,R2大于0.99,以3倍信噪比定為苯并烯氟菌唑的檢出限,檢出限為4 μg/kg,以10倍信噪比定為苯并烯氟菌唑的定量限,定量限為10 μg/kg, 在10～200 μg/kg范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,線性方程為Y=4 360 822X-2 704、相關(guān)系數(shù)R2為0.998 9。

3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在空白大豆樣品,分別添加10 、20 、50 μg/kg 3個(gè)濃度水平,每個(gè)濃度進(jìn)行6個(gè)平行實(shí)驗(yàn),苯并烯氟菌唑的回收率在73.6%～91.7%范圍內(nèi),變異系數(shù)在4.7%～10.9%范圍內(nèi)。檢測結(jié)果見表4,其結(jié)果符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的相關(guān)要求。

3.4 實(shí)際樣品分析

為了解市場大豆中苯并烯氟菌唑殘留情況,從5個(gè)超市,6個(gè)菜市場購買30批次大豆樣品,按照本研究建立的檢測方法進(jìn)行樣品處理檢測,該30批次大豆樣品中均未檢測出(低于定量限)苯并烯氟菌唑。

4 結(jié)論

本研究采用QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法進(jìn)行樣品提取、凈化,經(jīng)C18色譜柱分離,以乙腈和0.1%甲酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫,選擇負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測,優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜參數(shù),外標(biāo)法定量,建立了LC-MS/MS法測定大豆中苯并烯氟菌唑的測定方法。該方法的回收率、精密度、線性、測定低限等均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求,適用于大豆中苯并烯氟菌唑的快速檢測。該研究方法優(yōu)點(diǎn)是QuEChERS方法檢測效率高,酸性乙腈提取效率高,LC-MS/MS檢測靈敏度高,便于對大批量大豆中苯并烯氟菌唑進(jìn)行定量檢測。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021中規(guī)定了大豆的限量值,但沒有相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn),該方法的建立可以為建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)參考,同時(shí)也可以為相關(guān)執(zhí)法部門提供技術(shù)支撐,從而保障進(jìn)出口大豆的質(zhì)量安全。