施遠(yuǎn)國(guó)，蔣永青，梁 彤，陳昌毅，李穎鑫，李 繁，柯艷坤，吳寒光，劉國(guó)華，何雪玉

(1.深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518000；2.深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518172)

布魯菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱布病，是一種重要的人畜共患傳染病，在全國(guó)各地廣為流行，會(huì)嚴(yán)重影響畜牧生產(chǎn)與人民群眾的身體健康。妊娠母畜感染該病后，臨床上典型的癥狀是流產(chǎn)，主要發(fā)生在懷孕后期，且主要發(fā)生于頭胎母畜。公畜感染該病后會(huì)發(fā)生睪丸炎和附睪炎。布魯菌病一年四季均可發(fā)生，其傳染源主要為發(fā)病畜和帶菌畜。該病主要在家畜間傳播，以牛和羊?yàn)橹?。?dāng)發(fā)病或帶菌母畜流產(chǎn)、分娩時(shí)，布魯菌會(huì)隨著流產(chǎn)胎兒、胎衣、羊水和子宮分泌物一起大量排出，成為致病性最強(qiáng)的傳染源[1]。一頭流產(chǎn)或正在分娩的發(fā)病母牛能夠向環(huán)境排放109～1013個(gè)布魯菌，這些細(xì)菌可感染60 000～600 000 頭懷孕動(dòng)物。此外，發(fā)病畜或帶菌畜還會(huì)通過乳汁、糞便和尿液排出布魯菌，污染草場(chǎng)、畜舍、飲水、飼料、排水溝等，導(dǎo)致病原菌擴(kuò)散[2]。這些傳染源長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，導(dǎo)致布魯菌病防控難度加大，長(zhǎng)期無法消滅，而且有愈演愈烈之勢(shì)。因此，對(duì)布魯菌病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，及時(shí)切斷傳染源，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

目前，我國(guó)對(duì)布魯菌病防控使用的檢疫方法主要是抗體檢測(cè)[3]，但該方法的局限性在于難以判斷單頭畜體是否帶菌、排泄物是否含布魯菌。而布魯菌抗原檢測(cè)能方便、快速、準(zhǔn)確地判定流產(chǎn)胎兒、分娩羊水、胎衣與母畜陰道分泌物是否存在布魯菌，對(duì)布魯菌病的防控具有巨大的促進(jìn)作用。

因此，本研究利用抗布魯菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 的O 鏈C 抗 原的單抗16C5，建立并開發(fā)膠體金免疫層析法，研制出針對(duì)布魯菌病的檢測(cè)卡，以期用于布魯菌的快速檢測(cè)。該方法對(duì)被檢樣本量需求少、操作方便、反應(yīng)時(shí)間短，適合于廣大基層單位、養(yǎng)殖場(chǎng)及大量檢測(cè)樣本的快速初篩，對(duì)布魯菌病的防控和凈化具有巨大的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9 全菌體，沙門菌O45-2(D 群)、C500(C1 群)和AE616(B 群)，大腸桿菌O157，均由深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司制備并提供。

1.2 主要試劑

布魯菌單克隆抗體16C5 由深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司制備并保存，氯金酸購(gòu)自Sigma 公司，硝酸纖維素(nitrocellulose，NC) 膜購(gòu)自Sartrious 科學(xué)儀器(北京) 公司，玻璃纖維購(gòu)自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)板購(gòu)自南通浩杰特貿(mào)易有限公司，樣本滴管購(gòu)自滄州盛豐塑膠制品有限公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 購(gòu) 自Roche公司，吸水紙購(gòu)自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，稀釋液購(gòu)自深圳市金燦華實(shí)業(yè)有限公司，布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒、布魯菌M5-90 疫苗株購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司。

1.3 膠體金溶液的制備

取1 mL 1%氯金酸溶液，加入裝有99 mL超純水的錐形瓶中，制成0.01%氯金酸溶液，搖勻后放入智能加熱套內(nèi)加熱至沸騰，迅速加入1.6 mL 的1%檸檬酸三鈉溶液，搖勻，繼續(xù)加熱10 min 左右，直至溶液呈透亮的酒紅色。停止加熱，冷卻至室溫，用超純水恢復(fù)至原體積，分裝到棕色試劑瓶中，置于2～8 ℃下避光保存。

1.4 膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳pH 的測(cè)定

取1.5 mL 的透明離心管，采用pH 梯度法，分別加入1 mL 金溶液，再緩慢加入0.2 mol/L的碳酸鉀溶液，將膠體金溶液的pH 依次調(diào)為2.0、3.0、3.5、4.0、4.5 和5.0。隨后，每管分別加入等量的10 μg 布魯菌單抗16C5，調(diào)節(jié)每管單克隆抗體終濃度為10 μg/mL，振蕩混勻，室溫下靜置標(biāo)記20 min；當(dāng)膠體金顏色未出現(xiàn)變化，且碳酸鉀劑量最少時(shí)，即為膠體金和抗體16C5 結(jié)合的最佳pH。

1.5 金墊的制備

用金墊處理液浸泡玻璃纖維30 min，取出晾干，隨后置于相對(duì)濕度為10%～30%的室溫干燥房中烘干12～16 h。

1.6 噴金

將制備的金標(biāo)布魯菌抗體16C5 注入噴金儀中，調(diào)節(jié)噴金儀的參數(shù)為2.0 μL/cm，將膠體金溶液噴于處理好的玻璃纖維上。

1.7 樣本墊的制備

用樣本墊溶液浸泡玻璃纖維30 min，取出晾干，隨后置于相對(duì)濕度為10%～30%的室溫干燥房中烘干12～16 h。

1.8 膠體金試紙卡的制備

將反應(yīng)膜、金墊、樣本墊和吸水墊依次按順序粘貼在PVC 底板上；樣本墊的末端與金墊的始端相連，金墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，且金墊和吸水墊與反應(yīng)膜都有2 mm 的重疊，樣本墊與金墊有2 mm 的重疊。樣本墊的始端與用作底板的PVC 板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與用作底板的PVC 板的末端對(duì)齊；其中，反應(yīng)膜上有檢測(cè)線(T 線) 和質(zhì)控線(C 線)，T 線和C 線的劃線方向均為與長(zhǎng)條狀試紙卡的長(zhǎng)端相垂直的條狀帶；T 線位于靠近樣本墊末端的一側(cè)；C線位于靠近吸水墊首端的一側(cè)；組裝好的試紙卡如圖1 所示，將試紙卡用機(jī)器切成2.8 mm寬的小條，裝在特制的密封袋中，4～30 ℃環(huán)境中保存。

1.9 判定標(biāo)準(zhǔn)

陽性(+)：C、T 線均顯色，表示樣本含有布魯菌(圖2A)；陰性(-)：T 線不顯色，僅C線顯色，表示樣本不含有布魯菌，或其含量低于檢測(cè)閾值(圖2B)；無效：C 線不顯色，表明操作不正確，或檢測(cè)卡已失效(圖2C、2D)。

1.10 敏感性檢驗(yàn)

將布魯菌M5-90 疫苗株用稀釋液進(jìn)行10 倍系列稀釋，布魯菌含量為105、106、107、108、109CFU/mL，用制備好的布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡進(jìn)行檢測(cè)，以肉眼能觀察到T 線處有紅色沉淀線的最低布魯菌含量作為布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡的敏感性。

1.11 特異性試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡分別檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9 全菌體，沙門菌O45-2(D群)、C500(C1 群)、AE616(B 群)，大腸桿菌O157 和布魯菌M5-90 疫苗株，來評(píng)價(jià)布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡的特異性。

1.12 重復(fù)性試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡對(duì)布魯菌陽性樣本及陰性樣本分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣本重復(fù)8 次，比較不同批次間及批次內(nèi)的重復(fù)性結(jié)果。

1.13 符合率試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡檢測(cè)臨床采集的18 份樣本，同時(shí)用布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，并比較檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)兩種方法的符合率。

1.14 臨床樣本的檢測(cè)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡檢測(cè)某地區(qū)送檢的72 份臨床樣本，確診送檢樣本是否含有布魯菌，分析布魯菌的陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳pH 的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳的pH為4.5(圖3)。

2.2 敏感性試驗(yàn)

當(dāng)布魯菌M5-90 疫苗株稀釋為105CFU/mL時(shí)，檢測(cè)線處仍呈現(xiàn)肉眼可見的清晰的紅色沉淀線(圖4)，說明本研究制備的試紙卡對(duì)布魯菌抗原有較高的敏感性。

圖3 膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳pH 結(jié)果

圖4 布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)顯示，布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡對(duì)布魯菌M5-90 疫苗株檢測(cè)為陽性(T 線顯色)，而對(duì)沙門菌O45-2(D 群)、C500(C1 群)、AE616(B 群)、大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)均為陰性(T 線不顯色)，結(jié)果表明該試紙卡特異性較好(圖5)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡對(duì)布魯菌陽性樣本和陰性樣本分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，針對(duì)同一份樣本，無論批間還是批內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果均一致，重復(fù)性為100%，圖6 為批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果。因此，本研究建立的布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡具有良好的重復(fù)性。

圖5 布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡特異性檢測(cè)結(jié)果

圖6 布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.5 符合率試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡臨床檢測(cè)18 份樣本，同時(shí)用布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，比較檢測(cè)結(jié)果(表1)。結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法的符合率為94.4%[(12+5)/18]，敏感性為83.3%(5/6)，特異性為100%[(0+12)/12]，表明兩種方法有很高的符合率。

2.6 臨床樣本的檢測(cè)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡檢測(cè)某地區(qū)送檢的72 份臨床樣本。結(jié)果顯示，布魯菌陽性樣本2 份，陰性樣本70 份；布魯菌的陽性檢出率為2.8%，表明養(yǎng)殖戶對(duì)布魯菌的防控具有很高的認(rèn)知。

3 討論

布魯菌病是一種由布魯菌引起的人畜共患傳染病，遍布全球各地，對(duì)畜牧業(yè)和人類公共衛(wèi)生造成了巨大的威脅[4]。目前，在布魯菌病的一般檢測(cè)診斷方法中，細(xì)菌分離等方法是檢測(cè)布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是耗時(shí)長(zhǎng)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和一些分子生物學(xué)方法要求有專業(yè)實(shí)驗(yàn)室作為進(jìn)行病原診斷的保障[5-7]。隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，人民物質(zhì)生活的不斷豐富，高速的發(fā)展導(dǎo)致進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫額度不斷增加。這要求研究人員開發(fā)一些新技術(shù)去解決敏感性低、易發(fā)生交叉反應(yīng)、耗時(shí)長(zhǎng)、不易操作等問題。

本研究利用抗布魯菌LPS 的O 鏈C 抗原的單抗16C5，建立開發(fā)膠體金免疫層析法，研制出針對(duì)布魯菌病的檢測(cè)試紙卡。該試紙卡與布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒的符合率為94.4%，敏感性為83.3%，特異性為100%，表明該試紙卡特異性強(qiáng)、敏感性高，能快速檢測(cè)出未表現(xiàn)明顯臨床癥狀的感染牛，以切斷布魯菌病的流行和蔓延。布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡的研制成功為我國(guó)布魯菌的控制與根除提供了很好的技術(shù)支持。用制備好的試紙條對(duì)某地區(qū)送檢的72 份臨床樣本進(jìn)行布魯菌檢測(cè)，結(jié)果顯示布魯菌的陽性檢出率為2.8%，表明養(yǎng)殖戶對(duì)布魯菌的防控具有很高的認(rèn)知。

綜上所述，本研究制備的布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)感染布魯菌的家畜。建議相關(guān)部門盡快將該方法納入布魯菌病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，以提高我國(guó)獸醫(yī)的檢測(cè)能力，促進(jìn)家畜布魯菌病的防控。