陳麗香， 許佩勤

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442）

2,4-滴，化學(xué)名稱為2,4-二氯苯氧乙酸，是一種有機(jī)化合物，主要用作除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，也可作為殺菌保鮮劑，常在柑橘、番茄、香蕉等果蔬種植中用于防落花落果和延長(zhǎng)貯藏保鮮時(shí)間[1-2]。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在2017年10月27日公布的致癌物清單中，2,4-滴為2B類致癌物，對(duì)人類有潛在致癌作用。有研究認(rèn)為，長(zhǎng)期暴露超過最大污染水平，2,4-滴可能會(huì)對(duì)腎臟和肝臟等造成損害，甚至能夠?qū)е禄掳┳僛3]。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》GB 2763-2021規(guī)定了2,4-滴和2,4-滴鈉鹽在柑、橘、橙的最大殘留限量為0.1 mg/kg，指定按照GB/T 5009.175規(guī)定的方法測(cè)定，該方法采用氣相色譜儀配置電子捕獲檢測(cè)器（ECD）檢測(cè)，ECD靈敏度高，農(nóng)產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜，雜峰干擾多，定性能力較弱，檢出陽性需要再用質(zhì)譜輔助定性。目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道2,4-滴的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[4-5]、氣相色譜質(zhì)譜法[6-7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]和離子色譜法[12]，多數(shù)是研究飲用水中2,4-滴的檢測(cè)方法，沒有專門研究柑橘類樣品中2,4-滴的檢測(cè)方法。2,4-滴因其具有極性官能團(tuán)，使得其用氣相色譜分析會(huì)有拖尾和吸附現(xiàn)象，為改善其色譜行為，需通過衍生化反應(yīng)來封閉羥基的氫鍵部位，改善它與固定性相的作用特性。衍生化常用反應(yīng)有酯化、?；?、烷基化、硅烷化和離子化等，GB/T 5009.175-2003標(biāo)準(zhǔn)方法采用酯化，用14%三氟化硼丁醇溶液將2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，該方法用的衍生劑比較難購(gòu)得且價(jià)格較貴。本文研究在酸性條件下采用乙醚提取，硫酸作為催化劑用正丁醇將2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定柑橘中2,4-滴的殘留量，外標(biāo)法定量，建立柑橘水果中2,4-滴測(cè)定的方法，優(yōu)化后的方法靈敏度高，定性準(zhǔn)確，回收率穩(wěn)定，能更好地監(jiān)測(cè)柑橘類水果中2,4-滴的殘留量，為食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沃柑為市售。

2,4-滴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為99.4%，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇，色譜純，上海星可高純?cè)噭┯邢薰?；無水乙醚，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；正己烷，色譜純，上海星可高純?cè)噭┯邢薰?；丙酮，色譜純，廣州化學(xué)試劑廠；正丁醇，分析純，天津康科德技術(shù)有限公司；濃硫酸，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；氯化鈉，分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q-Advantage A10制備的一級(jí)水，美國(guó)Milli-pore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent GC 7890B，MSD 5977B，配拉出透鏡高靈敏度離子源（EI），美國(guó)安捷倫公司；MS 3basic 旋渦混合器，德國(guó)IKA 公司；ROTINA 380R 高速冷凍離心機(jī)，Hettich 公司；TL-DCII 氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；HWS-26水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取2,4-滴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷凍保存。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.3.1.1）100 μL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，即得1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，冷藏保存。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取2,4-滴標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.3.1.2）0、5.00、10.0、50.0、100、200、500 μL，用甲醇稀釋定容至1 mL，氮吹至干，以下步驟按1.3.2.2與試樣同時(shí)處理，最終得0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取 稱取樣品5.00 g置于50 mL離心管，加入5 mL pH 2.0的酸性稀硫酸水溶液，再加入10 mL乙醚，振蕩提取5 min，8 500 r/min離心3 min，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一支50 mL離心管中，于殘?jiān)屑尤?0 mL乙醚，重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相，加入2 g無水硫酸鈉，混勻以吸收水分，放置5 min后轉(zhuǎn)移到另一條50 mL離心管，用少許乙醚潤(rùn)洗無水硫酸鈉2次，合并，室溫氮吹至干，待衍生化。

1.3.2.2 衍生化 加入160 μL 正丁醇和40 μL 濃硫酸，加蓋混勻后在45 ℃下衍生50 min，加入2.5 mL 正己烷:丙酮（9+1），渦旋3 min，8 500 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一條15 mL塑料離心管中，加3 mL 50 g/L飽和氯化鈉水溶液,渦旋1 min，8 500 r/min 離心3 min，移出有機(jī)相，加入約0.3 g無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，將溶劑轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.3 儀器分析參數(shù)

1.3.3.1 色譜條件 色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持1 min；以10 ℃/min升至230 ℃，再以30 ℃/min升至260 ℃保持5 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；載氣（He）流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件 拉出透鏡高靈敏度離子源（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)譜接口溫度：260 ℃；采集模式：選擇離子掃描（SIM）；溶劑延遲：10 min；定量離子：276；定性離子：185、278。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

2,4-滴衍生后標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣衍生后溶液通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)試，應(yīng)用安捷倫Mass-Hunter數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以2,4-滴衍生物峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以2,4-滴的濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/L），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到試樣溶劑中2,4-滴的濃度（mg/L），如果試樣溶液中2,4-滴的濃度超出線性范圍時(shí)應(yīng)根據(jù)測(cè)定濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行分析。同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定，平行試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值為最終測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

考察了2,4-滴衍生物在農(nóng)殘分析常用的弱極性（TG-5MS）和中極性（DB-1701P）色譜柱上的色譜行為。根據(jù)1.3.3儀器分析條件，分析為0.1 mg/kg的2,4-滴衍生物在上述兩種極性色譜柱的出峰情況，總離子流色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明：2,4-滴衍生物在這兩種色譜柱上峰形尖銳對(duì)稱，但弱極性色譜柱的靈敏度比中級(jí)性的靈敏度高，中級(jí)性色譜柱的雜峰也比較多，故選用弱極性色譜柱進(jìn)行分析。

圖1 2,4-滴衍生物在弱極性色譜柱（TG-5MS）和中極性色譜柱（DB-1701P）的色譜圖Figure 1 Chromatograms of 2,4-D derivatives with weakly polar (TG-5MS) column and medium polarity (DB-1701P) column

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用全掃描（SCAN）的采集模式對(duì)2,4-滴衍生物（2,4-滴丁酯）進(jìn)行分析，質(zhì)譜圖如圖2 所示。質(zhì)荷比豐度由高到低分別是185、57、276、175、161、278，選擇這幾個(gè)質(zhì)荷比作為特征離子分析沃柑加標(biāo)樣品，發(fā)現(xiàn)57、175 和161 目標(biāo)峰附近有干擾峰，且不能完全分離，185基線有點(diǎn)漂移，276基線平整且目標(biāo)峰附近沒有雜峰干擾。根據(jù)選擇質(zhì)荷比大、豐度高及無干擾的原則，最后確定了276作為定量離子，185、278作為定性離子。加標(biāo)樣品的定量離子和定性離子色譜圖見圖3。

圖2 2,4-滴衍生物全掃描質(zhì)譜圖Figure 2 Full scan mass spectrum of 2,4-D derivatives

圖3 加標(biāo)樣品定量離子和定性離子色譜圖Figure 3 Spiked sample quantifier and qualifier chromatograms

2.3 提取次數(shù)的確定

在空白沃柑樣品中加入0.1 mg/kg 的2,4-滴標(biāo)準(zhǔn)溶液，除了用乙醚提取次數(shù)不一樣，其他步驟按照1.3.2 操作，對(duì)比提取1 次、2 次和3 次對(duì)加標(biāo)樣品回收率的影響，每次用10 mL 乙醚提取。比對(duì)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，提取1 次回收率偏低，提取2 次和3 次的回收率相差不大，綜合考慮提取效率、實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本節(jié)省，確定本方法提取次數(shù)為2 次。

表1 不同提取次數(shù)對(duì)回收率的影響Table 1 Effect of different extraction times on the recovery rate

2.4 衍生條件的優(yōu)化

2.4.1 衍生溫度的確定

配制5個(gè)濃度為0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮吹干后，加入160 μL正丁醇和40 μL濃硫酸，在35、45、55、65、75 ℃ 5個(gè)不同溫度下各衍生40 min，之后操作同1.3.2.2，比較結(jié)果見圖4(a)。結(jié)果表明，45 ℃條件下衍生時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)值最大，故確定45 ℃為衍生溫度。

圖4 不同衍生溫度和衍生時(shí)間對(duì)2,4-滴衍生物響應(yīng)值的影響Figure 4 Effect of different derivation temperatures and times on the response value of 2,4-D derivatives

2.4.2 衍生時(shí)間的確定

配制5個(gè)濃度為0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮吹干后，加入160 μL正丁醇和40 μL濃硫酸，在45 ℃下分別衍生30、40、50、60、70 min，之后操作同1.3.2.2，比較結(jié)果見圖4（b）。結(jié)果表明，衍生50 min時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)值最大，故確定衍生時(shí)間為50 min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

按確定的方法進(jìn)行測(cè)定，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5 所示。結(jié)果表明，在0 ～ 0.5 μg/mL 的線性范圍內(nèi)，2,4-滴衍生物呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。根據(jù)3 倍和10 倍定量離子信噪比確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得出2,4-滴的檢出限為0.002 5 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg，可以滿足柑橘中2,4-滴檢測(cè)要求。

圖5 2,4-滴的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 5 2,4-D Standard curve

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

在不含2,4-滴的沃柑空白試樣中分別添加0.005、0.01 和0.1mg/kg 3 個(gè)水平做加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平做6 個(gè)平行，按照“1.3”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，2,4-滴的回收率在86.61%～99.32%之間，RSD 在2.08%～4.46%（n= 6）之間，符合GB/T 27404-2008附錄F中回收率和精密度的要求。

表2 2,4-滴在沃柑中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 2, 4-D added to citrus

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照本文建立的方法對(duì)市售的30 批柑橘樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3。30批柑橘樣品中共有17批樣品檢出2,4-滴，檢出率高達(dá)56.7%，其中有6 批樣品的含量高于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021 中柑橘的最大殘留限量0.1 mg/kg，不合格率為20%。

表3 實(shí)際樣品中2,4-滴的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detected results of the 2,4-D in real sample

3 結(jié)論

本文在酸性條件下采用乙醚提取，硫酸作為催化劑用正丁醇將2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定柑橘中2,4-滴的殘留量。該方法回收率范圍在86.61%～99.32%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.08%～4.46%（n= 6）之間，檢出限為0.002 5 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg，符合分析方法的要求，靈敏度高，回收率穩(wěn)定，能夠滿足柑橘類水果中2,4-滴的定性和定量檢測(cè)，為食品安全監(jiān)督管理提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。