尚國麗, 劉 穎, 劉孟軍, 王玖瑞*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,河北 保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國棗研究中心,河北 保定 071001)

酸棗(ZiziphusacidojujubaC. Y. Cheng et M. J. Liu)屬鼠李科棗屬植物,原產(chǎn)于中國,是中國栽培棗(ZiziphusjujubaMill.)的祖先[1-2]。酸棗通常是灌木,稀為小喬木,廣泛分布于中國北方,是最受歡迎的野生水果和重要藥用植物之一[3-4]。其果實具有獨特的酸味,維生素C含量極高,具有重要的藥用和營養(yǎng)價值[5-6]。酸棗具有抗寒、抗旱、耐澇、耐鹽堿化、耐瘠薄等特點,常被用作山地造林的先鋒植物和栽培棗樹的優(yōu)良砧木[7-8]。近年來,由于保護意識的缺乏和對酸棗種子的過度采收,造成了酸棗種質(zhì)資源的部分流失。黃驊古貝殼堤是1998年經(jīng)中國河北省人民政府批準設(shè)立的省級自然保護區(qū),位于渤海灣西岸,其開發(fā)規(guī)模、時間跨度和地質(zhì)信息在世界上都是罕見的[9-11]。酸棗是黃驊古貝殼堤中最具優(yōu)勢的喬木植物,有著不可替代的防風(fēng)固沙作用。黃驊古貝殼堤沿線的野生酸棗資源具有一定的抗鹽堿、抗寒、抗旱能力,然而它們的應(yīng)用、開發(fā)和保護還不夠。黃驊古貝殼堤的酸棗作為野生資源,很少受到人們的重視,由于部分酸棗種植區(qū)已轉(zhuǎn)為耕地,原有的種質(zhì)資源規(guī)模已遭受大量破壞。

不同類型的分子標記可用于品種鑒定、多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)生研究等,如RAPD[12-13]、AFLP[14]、SRAP[15]和簡單重復(fù)序列(SSR或微衛(wèi)星)[7,16-17]。其中SSR分子標記具有多態(tài)性高、可重復(fù)性好、孟德爾遺傳和共顯性等優(yōu)點,通常在親緣種之間具有良好的保守性[18-19]。此外,它的PCR反應(yīng)程序相對簡單,可應(yīng)用低質(zhì)量的DNA[20]。因此,SSR分子標記是研究酸棗資源的有效工具[21-22]。本研究利用SSR分子標記對收集到的黃驊古貝殼堤酸棗及其他種質(zhì)資源進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析,探討黃驊古貝殼堤瀕危酸棗種質(zhì)資源的獨特性。

1 材料與方法

1.1 材料

在河北省黃驊古貝殼堤,選取有代表性的酸棗樣樹36株,采集葉片樣品。用保鮮袋封存后置于冰盒帶回河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國棗研究中心分子實驗室,置于-20 ℃冰箱中保存,用于DNA提取。同時收集了41份來自6個省份的酸棗類型、13個主栽棗品種和3個毛葉棗(見表1)。

表1 93份供試材料信息表

1.2 基因組DNA提取和SSR分析

采用CTAB法從嫩葉中提取基因組DNA。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,同時,在Nanodrop2000超微量核酸儀上進行DNA質(zhì)量和濃度的檢測。本試驗采用肖京[23]設(shè)計的20對SSR引物(見表2)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增采用12.5 μL的反應(yīng)體系,其中0.5 μL 50 ng/μL基因組DNA模板,6.25 μL 2×Taq Master Mix (Tiangen),正向和反向引物各0.5 μL,用ddH2O補足體積。擴增程序為94 ℃預(yù)變性3 min,然后在94 ℃下變性30 s, 50～60 ℃退火反應(yīng)30 s, 72 ℃延伸30 s,共28個循環(huán),最后在72 ℃下延伸10 min,4 ℃保存。點3 μL PCR產(chǎn)物于8%變性聚丙烯酰胺凝膠上,置于1倍TBE緩沖液中,恒壓200 V電泳50 min,銀染顯色后拍照記錄。

表2 20對引物信息

1.3 遺傳多樣性分析

將原始0,1數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成AB數(shù)據(jù),利用POPGENE 32軟件分析遺傳多樣性,包括等位基因數(shù)目(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shonnon’s信息指數(shù)(I)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、近交系數(shù)(Fis,Fit,Fst)、Nei’s多樣性指數(shù)(H)、Nei’s遺傳距離(D)、遺傳一致度(I)等的計算。

原始數(shù)據(jù)經(jīng)NTSYS-2.10軟件處理,Qualitative data程序計算相似系數(shù)(GS),獲得相似系數(shù)矩陣后,用SAHN程序中UPGMA(非加權(quán)配對算術(shù))方法進行聚類分析,并通過Tree Plot模塊生成聚類圖繪制UPGMA親緣關(guān)系樹狀圖,分析遺傳距離和種質(zhì)關(guān)系。

1.4 群體結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3.4軟件[24]分析居群結(jié)構(gòu),用混合模型(Admixture Model)和等位變異發(fā)生頻率相關(guān)模型(Allele Frequencies Correlated)進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,其中貝葉斯聚類過程中的兩個基本參數(shù)Length of burnin period和Number of MCMC Reps after Burnin分別設(shè)置為10 000和100 000,K值設(shè)置為1～15,運行40次。根據(jù)Evanno[25]運算ΔK,最優(yōu)K值為第一個ΔK峰值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性

20對SSR引物在93個樣品中共檢測到138個等位基因,平均每個位點6.9個等位基因。每對引物多態(tài)性譜帶的百分率是100%,擴增片段范圍為100～290 bp。不同的引物擴增出的等位基因數(shù)量也不盡相同。擴增出等位基因數(shù)量最多的是JSSR485,共計14個;相對最少的是JSSR285,是4個(見表3)。觀測雜合度和期望雜合度的平均值分別為0.59和0.76,變幅分別為0.27～0.84 和0.61～0.88。香農(nóng)指數(shù)的變化范圍是1.20(JSSR445)和2.26(JSSR485),平均為1.60?；蛄鞯淖兓秶?.25(JSSR195)和1.11(JSSR490),平均為0.58。PIC的分布范圍在0.58～0.87,分別在JSSR445和JSSR485,平均為0.73。篩選出的20對引物的PIC值全部大于0.5,表明全部為高度多態(tài)性引物,能較高信息量的反應(yīng)出試材基因型多樣性水平。

表3 20對引物的多態(tài)性信息

2.2 遺傳多樣性分析

在聚類閾值為0.72的情況下,將93個樣品劃分為9個主要類群(見圖1)。第I大類包含黃驊古貝殼堤的全部 36 份酸棗樣品和河北邢臺的4份酸棗樣品。第II大類和第III大類均為河北省酸棗,每個亞群分別有4個和7個酸棗類型。第Ⅳ大類包含3個酸棗類型,其中2個來自河北省,1個來自山西省。第Ⅴ大類組成較復(fù)雜,包含13個主栽的中國棗品種、7個河北省的酸棗類型、3個遼寧的酸棗類型、2個河南的酸棗類型、1個山西的酸棗類型和1個山東的酸棗類型。第Ⅵ大類由3個酸棗類型組成,其中1個來自山東省,剩余2個來自山西省。第Ⅶ大類包含4個酸棗類型,2個來自河南,2個來自陜西。第Ⅷ由2個酸棗類型組成,并且全部來自山東省。第Ⅸ大類由3個來自云南的毛葉棗組成。

圖1 2022年兩地日最低氣溫和最高氣溫曲線

圖1 用UPGMA方法基于SSR標記的聚類圖

為了闡明各大類群間的遺傳分化,同時計算了Nei’s遺傳距離與遺傳一致度。由表4可知,遺傳一致度的變幅為0.097 9～0.696 2,相應(yīng)的遺傳距離變幅為0.362 1～2.324 1。第Ⅲ大類和第Ⅴ大類最近,遺傳一致度為0.696 2,同時遺傳距離最小為0.362 1。第Ⅷ大類和第Ⅸ大類最遠,其遺傳一致度最低為0.097 9,遺傳距離最大為2.234 1。包括所有貝殼堤樣品在內(nèi)的第I大類與第Ⅲ大類最近,其遺傳一致度為0.653 9,遺傳距離為0.424 7。很明顯,第I大類與包含3個毛葉棗品種‘高朗’‘脆密’‘蜜絲’在內(nèi)的第Ⅸ大類最遠,其遺傳一致度為0.240 7,遺傳距離為1.424 3。

表4 各年度氣溫曲線相似度分析

表4 基于SSR分析的9大類群的遺傳一致度和遺傳距離

表5 9大類群的遺傳多樣性分析

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)20個SSR標記的基因分型數(shù)據(jù)對群體結(jié)構(gòu)進行分析(見圖2)。根據(jù)模型統(tǒng)計表明,在K=9時,ΔK=3.75,顯著高于其他處峰值,將樣品劃分為9個群體,依次進行編號(A～I)。與本研究的距離聚類相一致的是,包含36個黃驊古貝殼堤酸棗類型的群體 E 極少有與其他8個群體的相互混雜成分。

縱坐標表示各群體中的每個個體占某群體祖先成分系數(shù)(Q);橫坐標的數(shù)字表示每個個體的編號,與表1中第一列的編號一致圖2 根據(jù)20對SSR引物對93個樣品的群體結(jié)構(gòu)評估

另外,一些群體(如A、B群體)中遺傳背景比較一致,全部來源于河北省,混雜程度相對較低;而有的群體(如H、I群體)中分配率較高,個體間混合程度相對較高,來源于不同的栽培區(qū)域,群體間的遺傳物質(zhì)交流相對較多。

Q值可以反映各樣品所含不同類群遺傳成分的多少(見表6)。群體B、C中Q≥0.6是100%,全部是來自河北省的酸棗類型,沒有其他類群的遺傳成分。其次就是黃驊古貝殼堤群體(E)Q≥0.6是97.4%,Q值大于0.8和0.9的樣品占92.1%和86.8%,說明黃驊古貝殼堤群體中基本沒有含有其他類群的遺傳成分。

表6 根據(jù)模型聚類9個群體的Q值分布

3 討論與結(jié)論

聚類分析可以反映親緣關(guān)系的遠近。本研究第Ⅴ大類中,13個主栽棗品種與14個酸棗聚在一起,即酸棗與棗沒有完全分開,其他亞組中則沒有酸棗和棗聚在一起的現(xiàn)象,說明棗和酸棗親緣關(guān)系近,這與李瑞環(huán)等[12]的結(jié)果一致。所有黃驊古貝殼堤酸棗都聚集在第Ⅰ大類,而作為外對照,其他6個省的酸棗類型并沒有根據(jù)地理位置的不同而區(qū)分開來,只有貝殼堤酸棗能很好的和外對照酸棗、主栽棗品種以及毛葉棗區(qū)分開。因此,不能簡單根據(jù)地理位置劃分組別,而貝殼堤酸棗較為獨特。毛葉棗種質(zhì)可以單獨聚類到一起,與其他的遺傳相似系數(shù)為0.67,說明毛葉棗跟酸棗和棗的親緣關(guān)系較遠[26]。

高的雜合度意味著高的遺傳多樣性[27-28]。本試驗中,黃驊古貝殼堤酸棗群體的觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.56和0.68。同樣利用SSR標記,在酸棗上報道過更高水平的多態(tài)性(Ho=0.812,He=0.805[29]。相對于其他地區(qū),黃驊古貝殼堤酸棗遺傳多樣性低,可能是由于地理位置特殊,相對閉塞,與外地的酸棗種質(zhì)基因交流少的結(jié)果。

群體結(jié)構(gòu)分析是關(guān)聯(lián)分析的重要步驟,可有效避免錯誤的相似性或偽造關(guān)聯(lián)性,從而可以更有效的對自然群體做關(guān)聯(lián)分析[24,30]。本研究只有黃驊古貝殼堤群體(E)、云南毛葉棗群體(C)和大部分遼寧酸棗群體(F)可很明顯的獨立成一個群體,而其他地區(qū)酸棗則被劃分到不同的群體或有一部分與其他地區(qū)樣品結(jié)合。例如樣品數(shù)量僅次于黃驊古貝殼堤酸棗的河北省酸棗群體分布在A、B、D、I 4個群體中,這表明任何來自同一地理區(qū)域內(nèi)的酸棗材料都存在多種血緣來源或較多的遺傳變異類型。I組中包括河北、河南、山西、陜西四地的酸棗,這種結(jié)果可能是由于酸棗的多點起源且相互交流所導(dǎo)致的。盡管酸棗的群體結(jié)構(gòu)和遷徙情況很復(fù)雜,但黃驊古貝殼堤酸棗仍然自己聚在一起,原因可能是黃驊古貝殼堤酸棗極其特殊的地理位置和生長環(huán)境,導(dǎo)致古貝殼堤酸棗較為封閉,交流少。此外,Q值反映各自交系所含不同類群遺傳成分的比例[31]。本研究解析93個樣品遺傳成分發(fā)現(xiàn),93個樣品中有 18.3% (17個)的最大Q值小于0.6,說明有少量樣品融合了多個類群的遺傳成分,在黃驊古貝殼堤群體(E)中,36個來自黃驊古貝殼堤的樣品最大Q值全部大于0.6。由此可見,貝殼堤酸棗幾乎沒有跨類群的遺傳成分。處于瀕危的黃驊古貝殼堤酸棗資源獨特,應(yīng)進一步加強保護利用。