馬 磊，婁淑慧，尹玉瑩，安姝宇，朱超強(qiáng)，韓 藝，高建民

（河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年均會(huì)產(chǎn)生大量纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物，若能將其有效利用，不僅能夠減輕生態(tài)環(huán)境的壓力，還能夠避免大量的資源浪費(fèi)。纖維素是一種高分子有機(jī)聚合物，由大量單糖組成。為了有效利用纖維素，需要將其水解成為寡糖或單糖。目前，常使用糖苷水解酶催化降解纖維素［1］，但由于糖苷水解酶對(duì)纖維素結(jié)晶區(qū)的利用效率較低，需通過(guò)物理或化學(xué)方法對(duì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理［2］，以便提高糖苷水解酶對(duì)纖維素的降解效率。近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)了裂解多糖單加氧酶（LPMO），將其歸類于輔酶家族［3］（AA家族），其能有效降低多糖底物的結(jié)晶度，且能有效提高糖苷水解酶的水解效率。關(guān)于AA家族，目前研究最多的是AA9家族［4］，其主要作用于纖維素底物。進(jìn)一步研究AA9家族，將對(duì)高效水解纖維素提供一定的技術(shù)支持。

木質(zhì)纖維素是重要的可再生資源，酶解法是將其降解利用的重要途徑。對(duì)AfLPMO7蛋白的深入研究，提高其降解效率，闡明其在生物質(zhì)降解中的作用，更好地促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物的降解，進(jìn)而創(chuàng)造較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用具有重要的意義。本研究圍繞AfLPMO7蛋白進(jìn)行蛋白表達(dá)與純化、底物吸附、酶活力測(cè)定、氧化能力分析與底物識(shí)別等。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：大腸桿菌BL21，由平頂山市珍稀食用菌工程技術(shù)研究中心保存。

質(zhì)粒：含有Tev標(biāo)簽的pCold TF載體，由平頂山市珍稀食用菌工程技術(shù)研究中心保存。

商業(yè)酶：纖維素酶（cellulase）來(lái)源于Aspergillus niger。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母粉5 g。

試劑：（1）平衡液。50 mmol NaH2PO4，300 mmol NaCl，10 mmol iminazole，NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，用0.22μmol濾膜抽濾后使用。（2）洗脫液。50 mmol NaH2PO4，300 mmol NaCl，300 mmol iminazole，NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，用0.22μmol濾膜抽濾后使用。（3）30%Acr－Bis（29∶1）、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、10%過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、蛋白5×loading、預(yù)染蛋白Marker、Xylan、2，6－DMP等均購(gòu)自源葉生物公司。（4）3%H2O2購(gòu)自平頂山新城區(qū)藥店。（5）考馬斯亮藍(lán)染色液。0.25 g考馬斯亮藍(lán)R－250溶解于包含40%甲醇的水溶液中。（6）脫色液。10%乙酸、5%乙酸溶解于去離子水中。（7）結(jié)晶纖維素（Avicel PH101）購(gòu)自Sigma公司；沒(méi)食子酸和氯化銅均購(gòu)自南試公司。

供試儀器：AKTA蛋白純化儀（美國(guó)通用GE／AKTA Pufier10）。

1.2 方法

1.2.1AfLPMO7的進(jìn)化樹(shù)分析

選取與AfLPMO7關(guān)系相近的22個(gè)蛋白的氨基酸序列，將其保存為fasta格式，使用MEGA（version 5.1，Mega Limited，Auckland，New Zealand）繪制進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2AfLPMO7的功能預(yù)測(cè)

將AfLPMO7的氨基酸序列錄入在線數(shù)據(jù)庫(kù)Conserved Domain Database（CDD）（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）上，對(duì)其功能模塊進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3AfLPMO7的表達(dá)和純化

將AfLPMO7的基因序列連接至含有Tev標(biāo)簽的pCold TF載體上，通過(guò)42℃熱擊轉(zhuǎn)化方式將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)吸光度600（OD600）達(dá)到0.5時(shí)加入500μmol的異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG），誘導(dǎo)AfLPMO7蛋白的表達(dá)，并用SDS－PAGE電泳驗(yàn)證蛋白是否表達(dá)。若蛋白表達(dá)，使用親和層析的方法純化AfLPMO7蛋白，并使用核酸定量?jī)x（ND－2000，Thermo，USA）測(cè)定AfLPMO7的蛋白濃度［5］。

1.2.4AfLPMO7與PASC的吸附實(shí)驗(yàn)

吸附實(shí)驗(yàn)根據(jù)Manjeet的方法［6］稍作改動(dòng)。底物選擇PASC，實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組為僅有AfLPMO7蛋白，另一組為AfLPMO7蛋白和PASC。AfLPMO7的蛋白濃度為0.5 mg／mL，PASC的濃度為10 mg／mL，反應(yīng)緩沖液為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），反應(yīng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為200 r／min，反應(yīng)時(shí)間為2 h。反應(yīng)結(jié)束后，10 000 r離心2 min，固液分離，并將PASC用PBS洗滌3次。最后用50μL PBS重懸PASC，加入10μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，10 000 r離心2 min后取上清，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，檢測(cè)吸附在底物上的AfLPMO7蛋白含量。

1.2.5AfLPMO7對(duì)PASC和Xylan的降解實(shí)驗(yàn)

將AfLPMO7與過(guò)量氯化銅逐步混合，室溫靜置20 min。使用50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）平衡脫鹽柱G25，將混合物流經(jīng)脫鹽柱，并用50 mmol醋酸鈉緩沖液沖洗脫鹽柱，收集蛋白溶液，即得到Cu2＋－AfLPMO7。以下酶活力實(shí)驗(yàn)均用Cu2＋－AfLPMO7。

1 mL的反應(yīng)體系包括底物PASC（1%）或者Xylan（1‰），1μmol Cu2＋－AfLPMO7，2 mmol的沒(méi)食子酸，50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）。反應(yīng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150 r／min，反應(yīng)時(shí)間為12 h。在同等條件下設(shè)置滅活的AfLPMO7蛋白作為對(duì)照（CK）。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品沸水浴5 min后，10 000 r離心10 min，取上清，加入等量DNS，沸水浴5 min，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算還原糖的含量［7］。

1.2.6AfLPMO7與纖維素酶對(duì)天然底物的糖化實(shí)驗(yàn)

1 mL的反應(yīng)體系包括1%水稻秸稈、1%小麥秸稈、1%玉米秸稈，0.05 U纖維素酶，1.0、2.0和3.0μmol Cu2＋－AfLPMO7，2 mmol沒(méi)食子酸，50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）。反應(yīng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150 r／min，反應(yīng)時(shí)間為24 h。反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算還原糖的量。

1.2.7AfLPMO7動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)根據(jù)Breslmayr的方法［8］稍作改動(dòng)。將2，6－DMP作為底物。1 U的酶活力定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol木醋醌（coerulignone）的LPMO的量。緩沖液分別選擇50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）和PBS（pH 7.4），輔助因子H2O2的濃度為100μmol，反應(yīng)溫度為30℃，在同等條件下設(shè)置滅活的AfLPMO7蛋白作為對(duì)照（CK）。反應(yīng)結(jié)束后，在波長(zhǎng)469 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算coerulignone的量。

1.2.8AfLPMO7的同源建模和分子對(duì)接

AfLPMO7的同源建模采用AlphaFold2 server（https：／／colab.research.google.com／github／deepmind／alphafold／blob／main／notebooks／AlphaFold.ipynb＃scrollTo＝woIxeCPygt7K）?；钚灾行牡念A(yù)測(cè)采用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Zhang Lab（https：／／zhanglab.ccmb.med.umich.edu／）。

用Vina［9－10］軟件進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。以預(yù)測(cè)的AfLPMO7結(jié)構(gòu)為受體、纖維六糖為配體，分別添加氫原子使其為質(zhì)子化狀態(tài)，并計(jì)算扭轉(zhuǎn)分支中心和配體扭轉(zhuǎn)自由度。將His3、His85和Tyr163視為柔性，受體坐標(biāo)分為剛性部分和柔性側(cè)鏈。最后，設(shè)置參數(shù)（包含全部可變換氨基酸的大網(wǎng)格）運(yùn)行Vina程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Af LPMO7的序列分析

AfLPMO7的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1（a），由圖1（a）可知，AfLPMO7蛋白與多數(shù)AA9家族蛋白具有較近的親緣關(guān)系，其中具有最近關(guān)系的為PsAA9蛋白（PDB數(shù)據(jù)號(hào)：7PQR），它們的氨基酸相似度為33.36%，又與部分內(nèi)切葡聚糖酶具有一定的親緣關(guān)系?；贑DD比對(duì)結(jié)果對(duì)AfLPMO7蛋白進(jìn)行功能區(qū)預(yù)測(cè)見(jiàn)圖1（b）。由圖1（b）可知，AfLPMO7蛋白N端具有一個(gè)AA9家族功能模塊，中間部分為蛋白linker，起到連接蛋白質(zhì)N端和C端的作用，C端為一個(gè)CBM1功能區(qū)，確認(rèn)AfLPMO7蛋白為AA9家族蛋白。

2.2 Af LPMO7的表達(dá)純化和底物吸附實(shí)驗(yàn)

AfLPMO7蛋白存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞破碎，經(jīng)過(guò)鎳柱分離純化后得到其純化蛋白。經(jīng)SDS－PAGE電泳驗(yàn)證后，結(jié)果如圖2（a）所示，泳道1為純化后的AfLPMO7蛋白，其大小約為38 kDa，與理論預(yù)測(cè)值一致，表明其表達(dá)成功。

圖2 Af LPMO7的SDS－PAGE電泳及底物吸附結(jié)果

在AfLPMO7蛋白對(duì)PASC的吸附實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)2 h的結(jié)合，結(jié)果如圖2（b）所示，泳道2為不加底物的蛋白含量，泳道3為反應(yīng)體系中未吸附的AfLPMO7蛋白，結(jié)果表明游離蛋白減少了較多的量。吸附在底物PASC的AfLPMO7蛋白含量如圖2（c）所示，其中泳道4～6均為吸附在PASC的AfLPMO7蛋白。結(jié)果表明AfLPMO7蛋白對(duì)PASC具有較強(qiáng)的吸附能力。

2.3 Af LPMO7對(duì)PASC和Xylan的直接降解及與纖維素酶對(duì)天然底物的糖化作用

PASC和Xylan分別為纖維素和半纖維素，將其作為底物研究AfLPMO7蛋白的酶活力。如圖3（a）所示，AfLPMO7作用于PASC時(shí)，產(chǎn)生了濃度為17.12μg／mL的還原糖，作用于Xylan時(shí)，產(chǎn)生了濃度為41.24μg／mL的還原糖，表明AfLPMO7能作用于纖維素和半纖維素，且對(duì)半纖維素的降解能力較強(qiáng)。

圖3 Af LPMO7對(duì)底物的直接作用及與纖維素酶對(duì)天然底物的糖化作用

本文主要研究AfLPMO7與纖維素酶協(xié)同降解天然底物。如圖3（b）所示，當(dāng)以水稻秸稈為底物時(shí)，經(jīng)過(guò)24 h反應(yīng)后，與僅加入纖維素酶相比，分別添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了37.53%、111.89%和87.69%。如圖3（c）所示，當(dāng)以小麥秸稈為底物時(shí)，經(jīng)過(guò)24 h反應(yīng)后，與僅添加纖維素酶相比，分別添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了20.48%、35.55%和38.82%。如圖3（d）所示，當(dāng)以玉米秸稈為底物時(shí)，經(jīng)過(guò)24 h反應(yīng)后，與僅添加纖維素酶相比，分別添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了29.97%、50.95%和22.05%。說(shuō)明AfLPMO7蛋白能有效地協(xié)助纖維素酶降解天然底物，如水稻秸稈、小麥秸稈和玉米秸稈等。

2.4 Af LPMO7的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分析

為了探究AfLPMO7蛋白的反應(yīng)速率，選擇2，6－DMP作為底物，H2O2濃度為100μmol，測(cè)定AfLPMO7蛋白的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在50 mmol醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中，AfLPMO7的Vmax值為109.99±3.91 U／g，Km值為2.82±0.33 mmol（見(jiàn)圖4（a））。在PBS（pH 7.4）中，AfLPMO7的Vmax值為91.07±1.28 U／g，Km值為0.52±0.05 mmol（見(jiàn)圖4（b））。

圖4 不同pH條件下Af LPMO7的米氏曲線

2.5 Af LPMO7的同源建模和活性中心的預(yù)測(cè)

使用AlphaFold2 server對(duì)AfLPMO7進(jìn)行同源建模，生成的結(jié)構(gòu)如圖5（a）所示，AfLPMO7的主體由AA9家族蛋白功能區(qū)和CBM1（紅色部分）組成。AA9家族蛋白功能區(qū)的核心由8個(gè)反向平行的β折疊（粉紅色）和3個(gè)α螺旋（紫色部分）組成。其活性中心位于蛋白平坦的表面，活性中心His3、His85和Tyr163氨基酸殘基組成了其銅離子活性中心（見(jiàn)圖5（b））。

圖5 Af LPMO7的三維結(jié)構(gòu)圖

2.6 Af LPMO7的分子對(duì)接

采用分子對(duì)接技術(shù)探究AfLPMO7與纖維素的結(jié)合位點(diǎn)。模擬運(yùn)算后，選取能量最小的作為對(duì)接模型，其能量為－9.2 kcal／mol。在AfLPMO7與纖維六糖的對(duì)接模型（見(jiàn)圖6（a））中，纖維六糖分子懸浮在AfLPMO7蛋白表面，且接近其活性中心的銅離子，此外還有4個(gè)氨基酸（Ser33、Thr36、Arg74、Gly159）與纖維六糖分子之間形成了氫鍵，并以此相互作用（見(jiàn)圖6（b））。圖6（c）為相互作用的二維可視化圖，結(jié)果表明AfLPMO7與纖維六糖的作用方式不僅有氫鍵，還有疏水作用（His3、Asn31、Thr73）。

圖6 Af LPMO7與纖維六糖的分子對(duì)接

3 討論與結(jié)論

AA9家族LPMOs是一類能有效協(xié)助纖維素酶降解纖維素的輔酶，可對(duì)纖維素多糖鏈進(jìn)行破壞，使多糖鏈的結(jié)構(gòu)變得疏松，進(jìn)而促進(jìn)纖維素水解酶進(jìn)一步降解纖維素。在對(duì)AA9家族蛋白的研究中，著重研究其對(duì)纖維素的吸附作用，只有酶與底物結(jié)合，才能更好地發(fā)揮作用。評(píng)價(jià)AA9家族LPMOs對(duì)纖維素的吸附能力有兩種方法，一種是反應(yīng)體系游離蛋白的減少，另一種是吸附于纖維素的蛋白量，均用SDS－PAGE電泳結(jié)果直接顯現(xiàn)。AfLPMO7具有一個(gè)CBM1模塊，表現(xiàn)出對(duì)纖維素具有較強(qiáng)的吸附能力。其他AA9家族蛋白如HjLPMO9A（來(lái)源于Hypocrea jecorina），在其蛋白C端，同樣具有一個(gè)CBM1功能區(qū)，因而也表現(xiàn)出對(duì)PASC具有較強(qiáng)的吸附能力［11］。此外，還有AA9家族蛋白攜帶名為X278的保守結(jié)構(gòu)域，由4個(gè)半胱氨酸殘基和1個(gè)芳香殘基組成，可能具有與CBM相似的功能［12］。

AfLPMO7蛋白能夠作用于PASC和Xylan并產(chǎn)生還原糖，證明其能夠作用于纖維素和半纖維素。已有研究認(rèn)為大部分AA9家族蛋白只能作用于纖維素底物，極少數(shù)能作用于半纖維素底物，同時(shí)能對(duì)木葡聚糖產(chǎn)生作用，如來(lái)源于Malbranchea cinnamomea的PMO9A＿M(jìn)ALCI［13］。AfLPMO7能與纖維素酶協(xié)同作用，提高纖維素酶對(duì)水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈的水解效率，提高幅度為20.48% ～111.89%。表明AfLPMO7能有效降解秸稈中難降解的部分，如木質(zhì)素。一般認(rèn)為，木質(zhì)素對(duì)于纖維素的水解有著不利影響，但是由于AA9家族蛋白的特殊性，木質(zhì)素反而會(huì)成為其降解纖維素的重要輔助因子，因?yàn)榈头肿恿磕举|(zhì)素具有二聚體和三聚體兩種主要構(gòu)象，這種具有一簇pi－軌道的結(jié)構(gòu)有利于未配對(duì)電子的穩(wěn)定性，使木質(zhì)素成為一種有效的電子供體［14］。

在對(duì)AfLPMO7蛋白的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定中，在50 mmol的醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中，AfLPMO7具有最高的Vmax值，為109.99±3.91 U／g，Km值為2.82±0.33 mmol，表明AfLPMO7蛋白在此pH下，具有較高的氧化能力。AfLPMO7表現(xiàn)的氧化能力稍強(qiáng)于LPMO9F（來(lái)源于Neurospora crassa），這種差別可能與其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)，尤其是銅離子活性中心的不同，這將影響AA9家族蛋白接受電子的能力［8］。AfLPMO7蛋白的Km值小于3 mmol，表明其銅離子活性中心進(jìn)化為能結(jié)合2，6－DMP的結(jié)構(gòu)。也有研究表明漆酶能有效地結(jié)合2，6－DMP，其Km值從15μmol到1 000μmol，盡管漆酶比AA9家族蛋白對(duì)2，6－DMP具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，但是在木質(zhì)素降解過(guò)程中，AA9家族蛋白的酶活力優(yōu)于漆酶［15］。此外，在自動(dòng)建模和分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)AfLPMO7蛋白銅離子活性中心由His3、His85和Tyr163氨基酸殘基組成，而其與纖維六糖結(jié)合的氨基酸為Ser33、Thr36、Arg74、Gly159，表明催化中心不一定為結(jié)合部分。

在本研究中，來(lái)源于Aspergillus fumigatusZ5的AfLPMO7蛋白被定性。AfLPMO7對(duì)PASC具有很強(qiáng)的吸附能力，能直接作用于PASC和Xylan，并釋放出可溶性產(chǎn)物，且對(duì)2，6－DMP具有較強(qiáng)的氧化能力，并能協(xié)助纖維素酶有效降解天然底物。該結(jié)果為更好地利用AA9家族蛋白提供了一定的支持。