姜麗巍，吳斌，魏佳，單晴，張潔仙，劉雪艷，張平*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830091）

木納格葡萄（VitisviniferaL.）因其味美、多汁和富含天然抗氧化劑而深受消費(fèi)者歡迎[1]。鮮食葡萄中的酚類(lèi)化合物，如黃烷醇、花青素和類(lèi)黃酮，在抗炎、緩解阿爾茨海默癥和預(yù)防心血管疾病中具有重要作用[2]。果皮不僅是葡萄果實(shí)抵御外界壓力的物理屏障，且富含豐富的酚類(lèi)化合物。目前，關(guān)于果皮中酚類(lèi)含量的研究多集中在葡萄漿果成熟過(guò)程中[3]，對(duì)采后貯藏中果皮酚類(lèi)物質(zhì)含量的變化知之甚少。

黃烷醇是葡萄果皮中豐富的酚類(lèi)化合物之一，(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表沒(méi)食子兒茶素和(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯是黃烷醇的主要組成成分[4]。黃烷醇對(duì)采后果實(shí)品質(zhì)具有重要作用，可減少葡萄果實(shí)貯藏期間霉菌和酵母菌菌落的生長(zhǎng)[5]。此外，黃烷醇含量與抗氧化能力高度相關(guān)，如：藍(lán)莓果實(shí)中黃烷醇含量與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-Picrylhdrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2,2'-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazoline-6)-Sulphonicaciddiammonium Salt)，ABTS]自由基清除活性以及鐵離子還原能力（Ferric Ion Reducing Antioxidant Power，F(xiàn)RAP）呈顯著正相關(guān)[6]。此外，高含量的(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素和(-)-表沒(méi)食子兒茶素提高了鮮食葡萄ABTS+·和DPPH·的清除能力[7]。在1-甲基環(huán)丙烯和丙烯處理的李子中，觀察到果皮中(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素含量的增加和果肉中(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素含量的減少[8]。黃烷醇不僅受外源物質(zhì)的影響，還受內(nèi)源基因的調(diào)控，黃烷醇的生物合成是通過(guò)苯丙烷途徑來(lái)完成的。無(wú)色花色素還原酶基因（Leucoanthocyantin Reductase，LAR）和花青素還原酶基因（Anthocyanidin Reductase，ANR）是黃烷醇合成的關(guān)鍵基因，受病毒誘導(dǎo)的基因沉默抑制了TRV-VvANR感染葡萄葉片中VvANR表達(dá)，降低了(-)-表兒茶素和(-)-表沒(méi)食子兒茶素的含量[9]。UV-B 和UV-C 輻照誘導(dǎo)了苯丙氨酸解氨酶基因（L-Phenylalanine Ammonia-Lyase，PAL）、查爾酮合酶基因（Chalcone Synthase，CHS）、VvANR和VvLAR的表達(dá)，促進(jìn)了果皮中(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素和(-)-表沒(méi)食子兒茶素的合成[10]。

SO2在葡萄保鮮行業(yè)的商業(yè)化應(yīng)用已有近一個(gè)世紀(jì)[11]。SO2對(duì)致病菌的抑制作用一直被認(rèn)為是維持鮮食葡萄采后品質(zhì)的關(guān)鍵因素[12]。前人研究表明SO2可上調(diào)亞硫酸還原酶基因（SulfiteReductase，SiR）、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶1 基因（SerineAcetyltransferase1，SAT1）、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶 2 基因（Serine Acetyltransferase2，SAT2）和O-乙酰絲氨酸硫醇-裂解酶基因（O-AcetylserineThiol-Lyase，OASTL）的表達(dá)，誘導(dǎo)亞硫酸鹽還原來(lái)維持過(guò)氧化氫穩(wěn)態(tài)，以減少鮮食葡萄中的氧化損傷[13]。此外，SO2可增加苯丙氨酸解氨酶（L-Phenylalanine Ammonia-Lyase，PAL）酶活性，上調(diào)VvCHI的表達(dá)，促進(jìn)鮮食葡萄中總酚和類(lèi)黃酮的積累[14]。然而，SO2是否調(diào)節(jié)酚類(lèi)物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)以及如何調(diào)控的尚不明確。

本研究旨在評(píng)價(jià)SO2對(duì)木納格葡萄果皮酚類(lèi)化合物含量、黃烷醇單體含量及抗氧化活性的影響。通過(guò)測(cè)定低溫貯藏期間酚類(lèi)化合物生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，了解采后SO2對(duì)葡萄果皮酚類(lèi)物質(zhì)合成的分子調(diào)控機(jī)制，可為鮮食葡萄采后保鮮技術(shù)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)成熟（可溶性固形物TSS≥19%；可滴定酸TA≥0.42%）的木納格葡萄（VitisviniferaL.cv‘Munage’）于2021 年10 月從新疆阿圖什市頭塔格提云村的商業(yè)葡萄園中采摘，立即用冷藏車(chē)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。在（0±1）℃預(yù)冷12 h。選取大小均勻、無(wú)褐變、裂果及病害等損傷的葡萄串，將大約3.5 kg 鮮食葡萄有序擺放在內(nèi)襯無(wú)紡布和吸水紙的周轉(zhuǎn)筐（尺寸43 cm×30 cm×13 cm）中，置于（0±1）℃貯藏用于后續(xù)試驗(yàn)。

SO2氣體（純度≥99.9%），成都恒源氣體有限公司；沒(méi)食子酸、蘆丁、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽、2,4,6-三吡啶基三嗪、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表沒(méi)食子兒茶素和(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯，上海源葉生物科技有限公司；氯化鐵、香草醛、亞硝酸鈉、三氯化鋁、過(guò)氧化氫，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。RNAprep Pure Plant Plus 試劑盒、Fast Start Essential DNA Green Master Mix 試劑盒，天根生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

T6-新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；Altus-10 高效液相色譜儀，美國(guó)PerkinElmer公司；CB4 1QB 凝膠圖像分析系統(tǒng)，英國(guó)UVltec 公司；PCV-6000 微型離心機(jī)，英國(guó)GRANT 公司；DYY-6電泳儀，北京六一生物科技有限公司；LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，瑞士羅氏公司；Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich 科學(xué)儀器公司；ML204/02分析天平，梅特勒托力多國(guó)際貿(mào)易有限公司；MDF-682 低溫冰箱，松下冷鏈（大連）有限公司。

1.3 試驗(yàn)處理方法

樣品隨機(jī)分為兩組，每組各27 筐，每筐約裝3.5 kg葡萄。在（0±1）℃條件下用500 μL/L SO2熏蒸箱（體積80 cm×70 cm×70 cm）熏蒸2 h，以空氣熏蒸為對(duì)照。熏蒸后，將所有樣品密封在聚乙烯袋中，熏蒸結(jié)束后48 h 取樣，之后每隔7 d 取樣一次，直至保存結(jié)束。在（0±1）℃、90%～95%相對(duì)濕度下保存44 d。從3個(gè)筐子中隨機(jī)選取約100 粒完整葡萄果實(shí)，手工剝?nèi)∑咸哑ち⒓捶湃胍旱校笥醚心C(jī)研磨成粉末于-80 ℃保存。共計(jì)15 組樣品，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 各指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 總酚、總黃烷醇、總黃酮和總花青素含量的測(cè)定

葡萄果皮酚類(lèi)化合物含量的測(cè)定參照Sheng 等[7]的方法，略有改動(dòng)。稱(chēng)取果皮1.5 g，加入5.0 mL 預(yù)冷的φ=80%甲醇（含2%鹽酸），4 ℃過(guò)夜浸提。4 ℃條件下10 000 r/min 離心15 min，上清液用于測(cè)定總酚、總黃烷醇、總黃酮和總花青素含量。

1.4.1.1 總酚含量的測(cè)定

將200 μL 提取物混合到1.0 mL 福林酚試劑中，靜置3 min 后，向混合物中加入0.8 mLm=7.5%無(wú)水碳酸鈉，加入9.8 mL 去離子水，暗處放置1 h 后，于765 nm處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，以沒(méi)食子酸（Galic Acid，GAE）為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以g/kg GAE 表示。

1.4.1.2 總黃烷醇含量的測(cè)定

吸取提取物100 μL，加入6.0 mL 40 g/L 的香草醛-甲醇溶液，緩慢加入3.0 mL 濃鹽酸，30 ℃避光水浴30 min，于500 nm 處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，以?xún)翰杷兀–atechins，CAT）為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以g/kg CAT 表示。

1.4.1.3 總黃酮含量的測(cè)定

吸取葡萄果皮提取液100 μL，加入900 μL 去離子水，加入150 μL 50 mg/mL亞硝酸鈉溶液，靜置3 min后，加入300 μL 100 mg/mL 三氯化鋁溶液和1.0 mL 40 mg/mL 氫氧化鈉溶液，于510 nm 處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，以蘆?。≧utin，RE）為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以g/kg RE 表示。

1.4.1.4 總花青素含量的測(cè)定

吸取提取物500 μL 和2.0 mL 兩種不同的緩沖液（pH 值1.0，0.025 mol/L 氯化鉀和pH 值4.5，0.4 mol/L醋酸鈉）分別混合均勻，在暗處放置15 min 后，在510 nm 和700 nm 處測(cè)定吸光值，結(jié)果以每千克樣品的矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-Glucoside，C3G）的克數(shù)表示，即g/kg C3G，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

1.4.2 黃烷醇單體含量的測(cè)定

(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表沒(méi)食子兒茶素和(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯的測(cè)定參照Liang 等[15]方法，略有修改。取0.5 g 樣品加入5.0 mLφ=70%甲醇（含2%甲酸）中，混合后超聲提取30 min。4 ℃浸漬12 h后，在12 000 r/min 下4 ℃離心20 min。上清液經(jīng)0.45 μm 有機(jī)微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，采用高效液相色譜法，C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）分析。以φ=0.2%甲酸水溶液為溶劑A，甲醇為溶劑B，梯度曲線：92.5%A 持續(xù)5 min，75% A 到55% A 持續(xù)5～10 min，55% A到35% A 持續(xù)10 min。設(shè)置進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。流速為1.0 mL/min，洗脫峰在280 nm 處。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表沒(méi)食子兒茶素和(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量，各樣品均平行測(cè)定三次，結(jié)果用g/kg 表示。

1.4.3 DPPH 自由基清除活性的測(cè)定

葡萄果皮DPPH·清除率的測(cè)定參照Shen 等[16]的方法，略修改。吸取上述1.4.1 中的提取物100 μL 加入到含有2.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液（甲醇制備）中，30 ℃黑暗環(huán)境下孵育30 min，于517 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，以100 μLφ=80%甲醇和2.9 mL DPPH 甲醇溶液作為空白對(duì)照測(cè)定吸光值A(chǔ)0，平行測(cè)定三次，計(jì)算公式如下。

式中：

A0——空白對(duì)照組測(cè)定的吸光值；

A1——實(shí)驗(yàn)組測(cè)定的吸光值；

C——DPPH 自由基清除率，%。

1.4.4 ABTS+自由基清除活性的測(cè)定

ABTS+·清除率的測(cè)定參照Re 等[17]的方法測(cè)定。將7.5 μmol/L ABTS+·溶液和2.5 μmol/L 的過(guò)硫酸鉀按體積1:1 混合均勻，暗處反應(yīng)16 h，用無(wú)水乙醇稀釋混合液在734 nm 處的吸光值為0.7，作為測(cè)試液。吸取上述1.4.1 中的提取物100 μL 加入到3.2 mL ABTS+·測(cè)試液中，暗處放置6 min 后，于734 nm 處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定三次。

1.4.5 FRAP 還原能力的測(cè)定

FRAP 的測(cè)定參考Benzie 等[18]的方法，略改動(dòng)。0.1 mol/L 乙酸鹽緩沖液（pH 值3.6）、10 mmol/L 2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪和20 mmol/L 氯化鐵按10:1:1（V/V/V）比例混合來(lái)制備FRAP 試劑，吸取上述1.4.1中的提取物100 μL 加入到4.9 mL FRAP 試劑中，在37 ℃孵育10 min，于593 nm 處測(cè)定吸光值，平行測(cè)定三次，以硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算FRAP 值。

1.4.6 酚類(lèi)合成基因表達(dá)量的測(cè)定

按照RNAprep Pure Plant Plus 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法從葡萄果皮中提取總RNA。使用微量核酸分光光度計(jì)評(píng)估提取RNA 的質(zhì)量，隨后，用TIANScript II RT試劑盒進(jìn)行cDNA 合成。從國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）鑒定酚類(lèi)生物合成相關(guān)基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，并由生物有限公司合成。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，參照Fast Start Essential DNA Green Master Mix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR。VvActin作為參考基因，基因的相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT方法計(jì)算[19]，本研究使用的引物序列及登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 酚類(lèi)合成相關(guān)基因引物序列Table 1 Sequence of primers related to phenolic synthesis

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖，SPSS 20.0 進(jìn)行分析數(shù)據(jù)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。其中P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 SO2 對(duì)葡萄果皮總酚、總黃烷醇、總黃酮和總花青素含量的影響

SO2對(duì)葡萄果皮總酚含量有影響，在貯藏前16 d SO2處理組和對(duì)照組無(wú)顯著差異?？傮w呈下降-上升-下降趨勢(shì)（圖1a）。貯藏結(jié)束時(shí)，SO2處理組總酚含量為42.05 g/kg，比對(duì)照組高10.28%。這與SO2處理的玫瑰香葡萄結(jié)果是類(lèi)似的[14]。SO2處理對(duì)葡萄果皮總黃烷醇含量的影響如圖1b 所示，葡萄果皮總黃烷醇含量總體呈先上升后下降趨勢(shì)，在貯藏2 d 后SO2處理組和對(duì)照組間存在顯著性差異（P＜0.05）。貯藏至第9 天時(shí)對(duì)照組總黃烷醇含量為27.15 g/kg，SO2處理組比對(duì)照組高10.55%。吳敏等[20]基于代謝組學(xué)解析發(fā)現(xiàn)，SO2可顯著調(diào)控類(lèi)黃酮的生物合成。在我們的研究中，對(duì)照組葡萄果皮的總黃酮含量在貯藏期間呈下降趨勢(shì)（圖1c），在貯藏2 d 后SO2處理組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。貯藏結(jié)束時(shí)，SO2處理組葡萄果皮的總黃酮含量比初始值低38.53%，是對(duì)照組的1.33倍。貯藏期間總花青素含量的變化如圖1d 所示，呈上升-下降-上升-下降趨勢(shì)。除第9 天外，SO2處理組與對(duì)照組均存在顯著差異（P＜0.05）。峰值出現(xiàn)在第9天和第23 天，其中，第23 天SO2處理組比對(duì)照組高20.24%。貯藏至第44 天，SO2處理組比對(duì)照組高33.12%。此外，SO2也可調(diào)控紅地球葡萄的總花青素含量[21]。綜上所述，SO2可在一定程度上延緩酚類(lèi)化合物含量的下降。

圖1 SO2對(duì)葡萄果皮總酚（a）、總黃烷醇（b）、總黃酮（c）和總花青素（d）含量的影響Fig.1 Effects of SO2 on the contents of total phenols (a),total flavanols (b),total flavones (c) and total anthocyanins (d) in grape peel

2.2 SO2對(duì)葡萄果皮黃烷醇單體含量的影響

黃烷醇是葡萄果皮中豐富的酚類(lèi)化合物之一，Souquet 等[22]從葡萄果皮提取物中鑒定出四種主要的黃烷醇單體，(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯和(-)-表沒(méi)食子兒茶素。因此，本研究檢測(cè)了葡萄果皮中這四種黃烷醇單體含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SO2對(duì)(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯和(-)-表沒(méi)食子兒茶素均具有一定的調(diào)控作用。如圖2a 所示，SO2處理可顯著提高9～37 d (+)-兒茶素的含量（P＜0.05），第9 天出現(xiàn)峰值，SO2處理組比對(duì)照組高24.55%。在貯藏期間(-)-表兒茶素含量呈先上升后下降趨勢(shì)（圖2b），貯藏結(jié)束時(shí)，SO2處理組是對(duì)照組的1.79 倍，為初始值的39.54%。由圖2c可以看出，(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯含量在貯藏期間呈先上升后下降趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在第16 天，SO2處理組是對(duì)照組的1.37 倍。除第2 天和第44 天SO2處理均顯著提高了(-)-表沒(méi)食子兒茶素含量，第9 天出現(xiàn)峰值（圖2d），SO2處理組比對(duì)照組高16.92%。這與衛(wèi)穎等[23]對(duì)極早蜜葡萄的研究結(jié)果一致。四種黃烷醇單體中(+)-兒茶素含量最高，初始值為5.60 g/kg，(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯含量最低，初始含量為0.05 g/kg。在‘夏黑’葡萄中(+)-兒茶素含量最高，但未檢測(cè)到(-)-表沒(méi)食子兒茶素[7]，這可能是因?yàn)槠咸哑贩N差異造成的。

圖2 SO2對(duì)葡萄果皮黃烷醇單體含量的影響Fig.2 Effect of SO2 on flavanol monomer content in grape peel

2.3 SO2對(duì)葡萄果皮抗氧化能力的影響

葡萄果皮的酚類(lèi)物質(zhì)含量和種類(lèi)與其抗氧化活性密切相關(guān)[24]。為了評(píng)價(jià)木納格葡萄果皮酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化效果，本試驗(yàn)采用DPPH·清除率、ABTS+·清除率和FRAP 來(lái)評(píng)價(jià)SO2處理后酚類(lèi)提取物的抗氧化能力。除第2 天外，SO2處理組DPPH·清除率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。DPPH·清除率呈先上升后下降趨勢(shì)（圖3a），貯藏至第16 天時(shí)DPPH·清除率出現(xiàn)峰值，SO2處理組DPPH·清除率為43.73%，比對(duì)照組高6.16%。貯藏期間對(duì)照組葡萄果皮ABST+·清除率呈不斷下降趨勢(shì)（圖3b），與總黃烷醇、總黃酮和(-)-表兒茶素含量變化趨勢(shì)相一致，說(shuō)明ABST+·清除率與總黃烷醇、總黃酮和(-)-表兒茶素含量可能相關(guān)。這與Sheng等[7]對(duì)‘夏黑’葡萄的研究結(jié)果一致。除第2 天外，ABST+·清除率處理組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。第44 天，對(duì)照組ABST+·清除率為10.87%，SO2處理組是對(duì)照組的1.20 倍。在貯藏期間SO2處理組葡萄果皮FRAP 均顯著高于對(duì)照組（圖3c）。FRAP 變化趨勢(shì)與總花青素含量變化相似，說(shuō)明FRAP 可能與花青素含量有關(guān)。貯藏結(jié)束時(shí)，SO2處理組FRAP 比對(duì)照組高4.98%，是初始值的1.05 倍。綜上所述，與對(duì)照組相比，SO2處理組葡萄果皮在貯藏期間表現(xiàn)出更高水平的抗氧化能力，這可能是因?yàn)镾O2處理提高了各酚類(lèi)化合物含量。茉莉酸甲酯處理后龍眼果皮總酚和總黃酮含量的增加和DPPH·清除率的提高與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[25]。

圖3 SO2對(duì)葡萄果皮抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of SO2 on antioxidant capacity of grape peel

2.4 SO2對(duì)葡萄果皮酚類(lèi)合成基因表達(dá)量的影響

在SO2處理的葡萄果皮中檢測(cè)到較高水平的酚類(lèi)化合物，這取決于SO2誘導(dǎo)的苯丙烷途徑[14]。PAL、肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamate 4-Hydroxylase，C4H）和4-香豆酸-輔酶連接酶（4-Coumarate：CoA Ligase，4CL）是苯丙烷途徑中三種重要的酶[26]。如圖4a 所示，葡萄果皮VvPAL表達(dá)量在2 d、23 d、30 d 和37 d SO2處理組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。處理組分別為對(duì)照組的1.82 倍、1.36 倍、1.33 倍和1.36 倍。SO2處理組肉桂酸-4-羥基化酶基因（Cinnamate 4-Hydroxylase，C4H）表達(dá)量在2 d、16 d、37 d 和44 d 與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），SO2處理組第16 天表達(dá)量最高為5.58，是對(duì)照組的15.5 倍（圖4b）。由圖4c 所知，SO2處理組4-香豆酸-輔酶連接酶基因（4-Coumarate:CoA Ligase，4CL）表達(dá)量除第2 天和第30 天外均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第16 天表達(dá)量為5.77，比處理組高387.08%，這可能是第16 天SO2處理組總酚含量顯著高于對(duì)照組的原因。在本研究中SO2處理可能通過(guò)上調(diào)VvPAL、VvC4H和Vv4CL在果皮中的表達(dá)，而延緩總酚和總黃酮的下降。茉莉酸甲酯通過(guò)增強(qiáng)LbPAL、LbC4H和Lb4CL的表達(dá)，提高了百合總酚和總黃酮含量與本研究結(jié)果一致[27]。

圖4 SO2對(duì)葡萄果皮酚類(lèi)合成基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of SO2 on the expression of grape peel phenols synthesis genes

VvPAL、VvC4H和Vv4CL是苯丙烷途徑開(kāi)始的第一步基因，可能影響下游基因VvCHS、VvCHI、VvDFR、VvLAR和VvANR的表達(dá)。對(duì)照組VvCHS的表達(dá)量在貯藏前16 d 無(wú)明顯變化（圖4d），貯藏至第44 天時(shí)，SO2處理組表達(dá)量最高為1.12，是對(duì)照組的12.11 倍。由圖4e 可知，查爾酮異構(gòu)酶基因（Chalcone Isomerase，CHI）表達(dá)量在16 d 之后SO2處理組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），第44 天對(duì)照組幾乎不表達(dá)，SO2處理組是對(duì)照組的20.31 倍。同樣，觀察到SO2處理組酚類(lèi)物質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組。VvCHS和VvCHI的表達(dá)可能為酚類(lèi)合成提供了前體物質(zhì)，這與褪黑素處理的‘Kyoho’葡萄結(jié)果相似[28]。值得一提的是，對(duì)照組VvCHS和VvCHI的表達(dá)在第2 天和第9 天均顯著增加，而SO2處理組顯著抑制了二者的表達(dá)（P＜0.01）。說(shuō)明SO2可以誘導(dǎo)VvCHS和VvCHI的表達(dá)，但這種誘導(dǎo)具有時(shí)間效應(yīng)。

如圖4f 所示，SO2處理組二氫黃酮醇-4-還原酶基因（Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR）表達(dá)量?jī)H在第2 天顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），這與SO2對(duì)總花青素的調(diào)控模式類(lèi)似，SO2處理組VvDFR的表達(dá)總體呈先上升后下降趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在第9 天，SO2處理組比對(duì)照組高32.33%。DFR 是花青素生物合成的限速酶，控制花青素合成途徑的碳通量方向，從而影響花青素的含量[29]。在UV-C 處理的甜櫻桃中觀察到PaDFR的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了花青素的生物合成[26]。因此，推測(cè)SO2處理總花青素含量高于對(duì)照組可能是因?yàn)閂vDFR的表達(dá)量提高。

在圖4g 中，SO2處理的VvLAR表達(dá)量在第9、16、23 和44 天均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別比對(duì)照組高36.28%、113.01%、19.10%和221.91%。同時(shí)，也相應(yīng)提高了(-)表兒茶素和(-)表兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量。由圖4h 可知，除第2 天和第44 天，貯藏期間SO2處理組VvANR表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且與(+)-兒茶素和(-)-表沒(méi)食子兒茶素含量變化趨勢(shì)總體一致，SO2處理組第9 天表達(dá)量為5.32，比對(duì)照組高164.09%。這與Liang 等[15]對(duì)‘早黑寶’葡萄的研究結(jié)果類(lèi)似。LAR 和ANR 是負(fù)責(zé)黃烷醇合成的關(guān)鍵酶[9]。SO2處理可通過(guò)誘導(dǎo)VvANR和VvLAR的表達(dá)，提高果皮中黃烷醇的含量。有類(lèi)似的研究表示可以通過(guò)調(diào)節(jié)VvANR、VvLAR1和VvLAR2的表達(dá)，而提高葡萄葉片中黃烷醇含量[9]。因此，SO2的應(yīng)用可能是誘導(dǎo)VvANR和VvLAR的表達(dá)促進(jìn)葡萄果皮黃烷醇合成的有效方式。

3 結(jié)論

SO2處理可激活木納格葡萄果皮的苯丙烷代謝途徑。SO2處理可通過(guò)上調(diào)VvPAL、VvC4H、Vv4CL、VvCHS、VvCHI、VvDFR、VvLAR和VvANR的表達(dá)，延緩果皮中總酚、總黃烷醇、總黃酮和總花青素含量的下降，增加黃烷醇單體(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表沒(méi)食子兒茶素和(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量，維持采后葡萄果皮的抗氧化能力。然而，酚類(lèi)化合物單體眾多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，SO2對(duì)其他酚類(lèi)化合物單體的調(diào)控作用仍有待進(jìn)一步研究。且不同濃度SO2對(duì)酚類(lèi)化合物的影響尚不明確，本研究為SO2在葡萄果實(shí)采后酚類(lèi)化合物合成方面的研究提供理論依據(jù)。