聶永勝，高求煒，周 爍，王 瑋

（ 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510000 ）

大腸桿菌病是由大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）引起的細(xì)菌性人畜共患病[1]。大腸埃希菌是動(dòng)物或人腸道內(nèi)的正常菌群，一般情況不具有致病力，只有某些特殊血清型的大腸埃希菌具有致病性[2]，屬于革蘭氏陰性短桿菌，大小為（1.1～1.5） μm×（2～6） μm，多數(shù)有周身鞭毛[3]。在開展動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的異常死亡應(yīng)引起重視，調(diào)查清楚死亡原因并明確其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獸醫(yī)的職責(zé)。

在某次開展藥效學(xué)試驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買超重度免疫缺陷SPF 小鼠300 只（5～6 周齡，雌性，體重20～25 g），到貨時(shí)發(fā)現(xiàn)死亡3 只，后續(xù)檢疫期內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)死亡5 只，共死亡8 只。為探究小鼠死亡原因，選擇死亡小鼠中尚未發(fā)生自溶的5只小鼠進(jìn)行大體病理解剖。本研究利用獸醫(yī)臨床微生物知識(shí)對(duì)超重度免疫缺陷小鼠出現(xiàn)死亡的原因進(jìn)行了充分分析，最終找到了病因，為后續(xù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了幫助。此外，在研究過程中以質(zhì)譜儀鑒定菌種，本研究結(jié)果也可為微生物快速鑒定技術(shù)的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與耗材

CX23生物顯微鏡（奧林巴斯公司）、SPX150BE生化培養(yǎng)箱（力辰科技有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、Microflex LT/SH MALDITOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司）等。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（N/A）平皿（南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司）、麥康凱培養(yǎng)基（南京全隆生物技術(shù)有限公司）、革蘭氏染液（比克曼生物公司）、一次性無菌接種環(huán)（比克曼生物公司）、生理鹽水（山東齊都藥業(yè)有限公司）；細(xì)菌培養(yǎng)試管、細(xì)菌生化檢測(cè)試劑（廣東環(huán)凱生物公司）。解剖鑷子剪刀由上海醫(yī)療器械基團(tuán)有限公司生產(chǎn)，高壓滅菌后使用。

1.1.2 試驗(yàn)菌株與動(dòng)物

醫(yī)學(xué)院校科研用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（需保密），同品系免疫缺陷SPF小鼠10只（供應(yīng)商需保密）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解剖記錄病理變化

對(duì)死亡但尚未發(fā)生自溶，具有病理解剖意義的5 只小鼠在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行解剖，全程注意無菌操作并做好自身生物安全防護(hù)，拍照觀察記錄相關(guān)病理變化。

1.2.2 病變滲出物涂片革蘭氏染色鏡檢

對(duì)小鼠胸腹腔滲出物與膠凍樣物質(zhì)進(jìn)行涂片，操作方式同血涂片，蘸取一滴滲出液，推片接近滲出液，使液體呈一字展開，推片與載玻片呈30°角，勻速推向另一側(cè)，厚薄適中，自然晾干。之后進(jìn)行革蘭氏染色：結(jié)晶紫染60 s，碘液染60 s水洗，無水乙醇脫色30 s，沙黃復(fù)染60 s后鏡檢。

1.2.3 病料培養(yǎng)

對(duì)滲出物用無菌采樣環(huán)劃線接種于無菌普通瓊脂培養(yǎng)基與麥康凱培養(yǎng)基（全程在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行），在生化培養(yǎng)箱中37.0 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并挑取菌落用無菌液稀釋后涂片，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 細(xì)菌生化鑒定

培養(yǎng)出的細(xì)菌進(jìn)行純化分批接種于多管細(xì)菌培養(yǎng)試管中培養(yǎng)，菌種生長(zhǎng)良好，之后開展乳糖、動(dòng)力、葡萄糖產(chǎn)氣、醋酸鹽等細(xì)菌生化鑒定并匯總記錄結(jié)果。

1.2.5 質(zhì)譜儀細(xì)菌鑒定

對(duì)普通瓊脂與麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌各接種于專業(yè)的運(yùn)輸培養(yǎng)基，送檢第三方機(jī)構(gòu)（檢測(cè)機(jī)構(gòu)需保密，有CNAS與CM資質(zhì)），使用質(zhì)譜儀對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。

1.2.6 攻毒試驗(yàn)

知悉病原菌種屬后，使用該菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)同品系的小鼠10只進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。設(shè)立試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組5只小鼠，原菌液進(jìn)行100 倍稀釋，試驗(yàn)組每只小鼠灌服0.2 mL菌液，對(duì)照組灌服0.2 mL 生理鹽水，飼養(yǎng)于屏障級(jí)獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)籠具（IVC）內(nèi)，飼養(yǎng)觀察1周。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠剖檢結(jié)果（見圖1～圖3）

圖1 小鼠肝臟表面有纖維素性滲出Fig.1 Anatomy shows a fibrinous exudation on the surface of the mice liver

圖2 到貨時(shí)死亡小鼠胸腔解剖結(jié)果Fig.2 Results of thoracic anatomy of the dead mice upon arrival

圖3 檢疫期內(nèi)死亡小鼠胸腔解剖結(jié)果Fig.3 Results of thoracic anatomy of the dead mice during quarantine period

由圖1～圖3 可知，解剖的5 只小鼠表現(xiàn)的大體病理變化均為胸腹腔纖維素性滲出，部分肝臟表面被纖維素性滲出物附著，還有部分小鼠心肺被大量膠凍樣物質(zhì)包裹，出現(xiàn)“包心包肝”現(xiàn)象。

2.2 病變滲出物涂片革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（見圖4）

由圖4 可知，滲出物直接鏡檢可見少量炎性細(xì)胞和大量革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 病料培養(yǎng)及培養(yǎng)菌落鏡檢結(jié)果（見圖5～圖7）

圖5 普通瓊脂培養(yǎng)皿培養(yǎng)菌落Fig.5 Colonies were cultured in the ordinary AGAR dishes

由圖5、圖6 可知，普通瓊脂菌落呈圓形、直徑為2～3 mm、稍凸、邊緣整齊、灰白色、不透明的菌落、少數(shù)菌株出現(xiàn)β溶血環(huán)、極少數(shù)出現(xiàn)較大、扁平、皺起的粗糙型菌落；在麥康凱瓊脂平板上形成不透明、粉紅色菌落，部分形成中間黃色、周圍紅色菌落。

圖6 麥康凱瓊脂培養(yǎng)皿培養(yǎng)菌落Fig.6 Colonies on the MacConkey AGAR plates

由圖7 可知，滲出物培養(yǎng)皿挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，培養(yǎng)菌株為革蘭氏陰性短桿菌。

圖7 滲出物培養(yǎng)皿挑取菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.7 Results of Gram staining microscopy of the colonies picked from the exudate petri dishes

2.4 細(xì)菌生化分析結(jié)果（見表1）

表1 細(xì)菌生化分析結(jié)果Tab.1 Results of the bacterial biochemical analysis

由表1可知，分離株乳糖、動(dòng)力、葡萄糖產(chǎn)氣、醋酸鹽結(jié)果均為陽(yáng)性，生化結(jié)果指向大腸埃希菌。

2.5 質(zhì)譜儀細(xì)菌鑒定結(jié)果

第三方檢測(cè)公司反饋分離株為大腸埃希菌。

2.6 攻毒試驗(yàn)結(jié)果

飼養(yǎng)1周后，對(duì)照組小鼠未見異常，試驗(yàn)組5只同品系小鼠中有2只出現(xiàn)癥狀后死亡，剖檢可見胸腹腔纖維性滲出，胸腔心肺被膠凍樣物質(zhì)包裹的大體病理變化（見圖8）；對(duì)滲出物接種于麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成粉紅色菌落（見圖9）；對(duì)所培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色物鏡檢與質(zhì)譜儀鑒定，確定分離株為大腸埃希菌（見圖10）。

圖8 攻毒試驗(yàn)小鼠大體病理表現(xiàn)Fig.8 Gross pathological findings of the mice in challenge experiments

圖10 滲出物革蘭氏鏡檢結(jié)果Fig.10 Gram microscopic examination of the exudate

3 討論

大腸埃希菌為動(dòng)物體內(nèi)正常菌，作為一種構(gòu)造簡(jiǎn)單的原核生物，因其具有遺傳背景清晰、易培養(yǎng)、生長(zhǎng)繁殖快速、在腸道中易成為優(yōu)勢(shì)菌等優(yōu)點(diǎn)成為如今腸桿菌科原核工程菌的代表性菌株[4]?！吨袊?guó)藥典》2010年版收載了大腸埃希菌的確認(rèn)方法，即4-甲基傘形酮葡糖酸酐（MUG）和靛青質(zhì)（indole）試驗(yàn)可作為確認(rèn)的參考方法；IMViC 試驗(yàn)【包括靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）試驗(yàn)】亦可作為鑒定和確認(rèn)的參考[5]。

在本試驗(yàn)鑒定過程中，質(zhì)譜儀發(fā)揮了很重要的作用，基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDITOF MS）是一項(xiàng)微生物快速鑒定技術(shù)，以其快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、高通量的特點(diǎn)在細(xì)菌鑒定、耐藥性和毒力監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要的作用[6-7]。作為近年來發(fā)展起來的新型診斷技術(shù)[8-9]，MALDI-TOF MS技術(shù)根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、生化、抗原、遺傳等特征，可以快速完成對(duì)微生物種、屬水平的鑒定[10]。MALDI-TOF MS 的樣品處理簡(jiǎn)單快速，可提供復(fù)雜樣品中各組分分子量的信息，逐漸發(fā)展成為系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)研究人員的新工具[11]。MALDI-TOF MS 通過將掃描出的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，從而得出鑒定結(jié)果[12-13]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物等級(jí)劃分為：普通級(jí)動(dòng)物、無特定病原體級(jí)動(dòng)物、無菌級(jí)動(dòng)物[14]。不同級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活在不同要求的環(huán)境中，普通級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)于普通環(huán)境，無菌級(jí)動(dòng)物生活在隔離環(huán)境中。無特定病原體級(jí)動(dòng)物生活在屏障環(huán)境中，該環(huán)境要求符合動(dòng)物居住要求，嚴(yán)格控制人員、物品和空氣的進(jìn)出，適用于飼育清潔級(jí)和無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[15]。

超重度免疫缺陷鼠因其自身的免疫系統(tǒng)功能弱，B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴極少，樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等較免疫正常小鼠含量少，易發(fā)生微生物感染。因此，超重度免疫缺陷鼠需按照國(guó)標(biāo)要求飼養(yǎng)在符合潔凈度達(dá)到5級(jí)的環(huán)境中，建議使用IVC 或隔離包進(jìn)行飼養(yǎng)，盡量減少人為污染。大腸埃希菌未列入新國(guó)標(biāo)SPF 級(jí)別小鼠必須排除病原，但其對(duì)重度免疫缺陷鼠該菌的致病性還需要重點(diǎn)關(guān)注。本研究中，對(duì)于該菌的感染路徑以及作用機(jī)制受限于實(shí)驗(yàn)條件，未能進(jìn)一步展開；鑒于本試驗(yàn)中的小鼠生活在屏障環(huán)境中，接觸的墊料、飲水、飼料皆是滅菌后使用，且并未發(fā)生大規(guī)模發(fā)病，表明大腸埃希菌在此類小鼠中的傳染性有限。結(jié)合攻毒試驗(yàn)結(jié)果，目前推測(cè)是部分免疫缺陷小鼠腸道內(nèi)菌群上行引起的內(nèi)源性感染[16]。

腸道菌群主要通過跨腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和緊密連接轉(zhuǎn)運(yùn)等兩種方式由腸靜脈到達(dá)門靜脈或由腸淋巴系統(tǒng)進(jìn)入體循環(huán)?？缂?xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過一些特殊的細(xì)胞通道以及泵膜，大腸埃希菌、變形桿菌等活細(xì)菌主要通過此類方式入侵。緊密連接轉(zhuǎn)運(yùn)主要源于腸腔內(nèi)滲透壓改變、腸上皮細(xì)胞骨架及其蛋白構(gòu)架微管和微絲的直接破壞，大分子如內(nèi)毒素就是通過疏松的緊密連接進(jìn)行易位。高度免疫缺陷實(shí)驗(yàn)小鼠T 細(xì)胞缺失，致使其盲腸中厭氧菌含量較低，導(dǎo)致厭氧菌對(duì)腸桿菌的抑制作用減弱，大腸埃希菌過量繁殖[17]，成為致病菌。有很多文獻(xiàn)描述了腸道微生物易位感染。腸道不僅是最重要的消化和吸收器官，也是機(jī)體最大的免疫器官和重要的生理屏障。腸道覆蓋著體內(nèi)最大的黏膜層，可隔離機(jī)體與腸腔內(nèi)大量?jī)?nèi)容物，以免微生物的侵襲和毒素、抗原分子的損害。腸腔內(nèi)含有300～500種細(xì)菌，主要集中于下消化道，每毫升糞便中細(xì)菌量可達(dá)1012，約占糞便干重的60%[18]。在失血、失液、休克、嚴(yán)重?zé)齻?、呼吸衰竭、營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重感染、缺血缺氧、嚴(yán)重創(chuàng)傷、免疫缺陷等應(yīng)激狀態(tài)下，腸壁通透性增加，腸屏障功能受損，原存在于腸腔內(nèi)的細(xì)菌和毒素向區(qū)域淋巴結(jié)、門靜脈及外周血易位，黏膜下層免疫細(xì)胞異常激活，炎癥介質(zhì)釋放，進(jìn)而引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）甚至多器官功能障礙 綜 合 征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[19]。為保證科學(xué)試驗(yàn)不受干擾，不能使用抗生素防控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病，可從增強(qiáng)腸道抵抗力與整體免疫力的方面考量，如添加無菌營(yíng)養(yǎng)膠，保證小鼠飼養(yǎng)環(huán)境潔凈度，減少微生物富集，避免價(jià)格昂貴的實(shí)驗(yàn)鼠發(fā)病死亡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獸醫(yī)需要作出專業(yè)的診斷，查明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物異常的原因，為相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)的順利開展提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究中，綜合評(píng)估培養(yǎng)基菌落形態(tài)、顏色及生化鑒定、質(zhì)譜儀鑒定、攻毒試驗(yàn)等結(jié)果，判定該批超重度免疫缺陷小鼠發(fā)病原因?yàn)榇竽c埃希菌感染，并且由大腸埃希菌易位或上行引起滲出性炎癥最終死亡等可能性較大。