劉纖纖 李文莉 梁曉蓮 周楚惠 陳勇 羅孔現(xiàn) 劉兆祥

摘要：為了建立紅穿破石地上、地下部分HPLC指紋圖譜，對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。采用Agilent ZORBX SB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL，通過相似度評(píng)價(jià)、結(jié)合聚類分析和主成分分析對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分進(jìn)行評(píng)價(jià)。建立了紅穿破石地上、地下部分HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定13個(gè)共有峰。根據(jù)主成分綜合得分模型，對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上部分與地下部分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，廣西桂林市平樂縣的紅穿破石綜合質(zhì)量更優(yōu)。該方法操作簡便、重復(fù)性好、分析速度快，可用于紅穿破石綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)和規(guī)范紅穿破石的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：紅穿破石；HPLC指紋圖譜；地上部分；地下部分；聚類分析；主成分分析；廣西

中圖分類號(hào)：R284? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）12-0163-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.030 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on HPLC fingerprints of the aboveground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from different producing areas in Guangxi

LIU Qian-qian1，2， LI Wen-li1， LIANG Xiao-lian1， ZHOU Chu-hui1， CHEN Yong1， LUO Kong-xian1， LIU Zhao-xiang1

（1. Science Experimental Center，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning? 530200，China；2. Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang? 524000， Guangdong， China）

Abstract： In order to establish HPLC fingerprints of the aboveground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa， a comprehensive evaluation was conducted on the quality of the aboveground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from 10 production areas. Using Agilent ZORBX SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） Chromatographic column， acetonitrile 0.1% phosphoric acid gradient elution was conducted， with the flow rate of 0.8 mL/min， column temperature of 25 ℃， detection wavelength of 254 nm， and injection volume of 10 μL. The above-ground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from 10 production areas were evaluated through similarity evaluation， combined with cluster analysis and principal component analysis. This study had established HPLC fingerprints of the above-ground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa and calibrated a total of 13 common peaks. According to the principal component comprehensive score model， a comprehensive evaluation was conducted on the above ground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from 10 production areas. The comprehensive quality of Radix Ventilago Leicocarpa in Pingle County， Guilin City， Guangxi was better. This method was easy to operate， had good repeatability， and fast analysis speed， and could be used for the comprehensive quality evaluation of Radix Ventilago Leicocarpa and to standardize the quality of Radix Ventilago Leicocarpa.

Key words： Radix Ventilago Leicocarpa； HPLC fingerprints； aboveground parts； underground parts； cluster analysis； principal component analysis； Guangxi

紅穿破石原植株分布于廣西、廣東省、云南省、福建省等地區(qū)，又名血風(fēng)藤（Ventilago leiocarpa Benth.）［1-3］。紅穿破石具有清熱利濕、利尿通淋、舒筋活絡(luò)、盈補(bǔ)氣血等功效，對(duì)泌尿系統(tǒng)結(jié)石具有特殊作用，可用于尿路感染、急慢性腎炎、腎結(jié)石的治療，對(duì)于跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕疼痛等癥狀都有較好的治療效果［4，5］。

紅穿破石含有豐富的蒽醌類、黃酮類等成分，蒽醌類成分包括大黃素［6］、大黃素-6，8-二甲醚［6，7］、大黃酚［6］、1-羥基-6，7，8-三甲氧基-3-甲基蒽醌［7］、翼核果素［7］、翼核果醌［7］、鳶尾甙元［8］和羽扇豆醇［9］等?，F(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有過對(duì)紅穿破石大黃素及大黃素甲醚的定量分析［10，11］，但并不能較完全地反映紅穿破石的質(zhì)量，因此要建立能完全反映其質(zhì)量的HPLC指紋圖譜［12，13］。在傳統(tǒng)用藥和文獻(xiàn)記載的藥用部位中，紅穿破石大多以地下部分的根及根莖作為藥用部位，地上部分的莖和葉基本都被丟棄?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)也有對(duì)紅穿破石根及根莖的HPLC指紋圖譜研究［14］，但其地上部分的HPLC指紋圖譜研究較少，難以為紅穿破石的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供較全面的參考。因此，建立紅穿破石地上、地下部分HPLC指紋圖譜，可為民族藥紅穿破石的質(zhì)量評(píng)價(jià)和研究提供較全面的參考依據(jù)［15］。

1 儀器、藥材與試劑

Waters 2695型高效液相色譜儀購自美國沃特世科技（上海）有限公司；D24UV型默克密理博超純水一體化系統(tǒng)購自德國默克公司；Agilent ZORBX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱購自安捷倫科技有限公司；SQP型分析天平購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；大黃素對(duì)照品（批號(hào)：RP190519，純度：99.66%）購自成都麥德生科技有限公司；甲醇色譜純（批號(hào)：203511）、乙腈色譜純（批號(hào)：204127）購自美國Fisher公司；水為去離子水。

試驗(yàn)所用紅穿破石經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室郭敏副教授鑒定為鼠李科植物翼核果的干燥根、根莖、莖及葉，紅穿破石樣品信息見表1。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

分別稱取紅穿破石地上、地下部分粉末1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇各20 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱采用Agilent ZORBX SB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%磷酸；梯度洗脫如表2所示；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察 精密稱取紅穿破石地上部分粉末1.0 g，連續(xù)進(jìn)樣6次，以13號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，其他12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.05%～0.54%，相對(duì)峰面積的RSD為0.05%～0.47%，均小于3.00%，說明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性考察 精密稱取紅穿破石地上部分粉末1.0 g，平行制備6份，以13號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，其他12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.06%～0.43%，相對(duì)峰面積的RSD為0.96%～2.88%，均小于3.00%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察 取紅穿破石地上部分供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h，以13號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，其他12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.07%～0.38%，相對(duì)峰面積的RSD為0.86%～2.66%，均小于3.00%，說明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 共有峰的HPLC指紋圖譜

本試驗(yàn)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分HPLC色譜圖進(jìn)行分析，將10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分峰面積均較大的色譜峰標(biāo)定為共有峰，10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分各標(biāo)定有13個(gè)共有峰。為減少溶劑峰對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響，將平均值法作為生成對(duì)照指紋圖譜的方法，以0.5 min的時(shí)間寬度進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark峰匹配，從而得到10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分對(duì)照指紋圖譜和各產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分疊加圖譜，見圖1至圖4。

3.2 大黃素的指紋圖譜

大黃素是紅穿破石的指標(biāo)性成分，含量較高，峰面積穩(wěn)定，地上部分13號(hào)峰、地下部分12號(hào)峰分別為指紋圖譜參照峰，如圖5所示。以指紋圖譜中的地上部分13號(hào)峰（地下部分12號(hào)峰）為參照峰，分別計(jì)算10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果見表3至表6。

3.3 相似度分析

將10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分的指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，通過與紅穿破石地上、地下部分的對(duì)照指紋圖譜比較，得到不同產(chǎn)地的相似度結(jié)果。

由表7可知，10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上部分的相似度在0.823～0.979，但S4（廣西欽州市欽北區(qū)貴臺(tái)鎮(zhèn)）、S8（廣西防城港市防城區(qū)）2個(gè)產(chǎn)地的相似度均低于0.900，說明這2個(gè)產(chǎn)地與其他產(chǎn)地的紅穿破石地上部分化學(xué)成分存在較大差異。10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地下部分的相似度在0.712～0.945，其采收時(shí)間、環(huán)境、生長年限等存在差異。

3.4 聚類分析（HCA）

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接法，以歐式距離平方和為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)地上部分和地下部分進(jìn)行聚類［16，17］。

由圖6a可知，當(dāng)d=10時(shí)，紅穿破石地上部分被分為2個(gè)聚群，其中S7為一類，S3、S4、S9、S2、S8、S6、S1、S5、S10聚為一類；當(dāng)d=4時(shí)，紅穿破石地上部分被分為3個(gè)聚群，其中S5、S10聚為一類，S7為一類，S3、S4、S9、S2、S8、S6、S1聚為一類。由此可見，紅穿破石S7地上部分與其他樣品存在明顯差異，而S3、S4、S9、S2、S8、S6、S1、S5、S10樣品的差異較小，化學(xué)成分較相似，綜合質(zhì)量較穩(wěn)定。

由圖6b可知，當(dāng)d=20時(shí)，紅穿破石地下部分被分為2個(gè)聚群，S4、S9、S1為一類，S2、S6、S3、S7、S5、S8、S10聚為一類；當(dāng)d=15時(shí)，紅穿破石地下部分被分為3個(gè)聚群，S4、S9聚為一類，S1為一類，S2、S6、S3、S7、S5、S8、S10聚為一類；當(dāng)d=10時(shí)，紅穿破石地下部分被分為4個(gè)聚群，S4、S9聚為一類，S1為一類，S8、S10聚為一類，S2、S6、S3、S7、S5聚為一類。由此可見，紅穿破石S4、S9、S1地下部分與其他樣品存在明顯差異，而S2、S6、S3、S7、S5、S8、S10樣品的差異較小，化學(xué)成分較相似，綜合質(zhì)量較穩(wěn)定。

3.5 主成分分析

3.5.1 主成分提取分析 為了綜合評(píng)價(jià)紅穿破石地上、地下部分的品質(zhì)，將10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分指紋圖譜共有峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析［18-21］。主成分分析（PCA）結(jié)果見表8。

紅穿破石地上、地下部分PCA碎石圖（圖7）表明，地上部分前3個(gè)成分、地下部前6個(gè)成分特征值均較大，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率分別為99.412%、96.173%，說明地上部分前3個(gè)成分和地下部分前6個(gè)成分為主要成分，包含了藥材指紋圖譜大部分信息，其他成分包含信息較少。本研究以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，地上部分前2個(gè)成分、地下部分前4個(gè)成分符合要求，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率分別為98.115%、85.035%，因此分別選擇地上部分前2個(gè)成分和地下部分前4個(gè)成分作為紅穿破石的主要成分。

3.5.2 特征向量與主成分模型 為得到所選取的地上部分前2個(gè)主成分（A1、A2）和地下部分前4個(gè)主成分（B3、B4、B5、B6）公因子的表達(dá)式，以各自主成分載荷量除以各自主成分特征值的算術(shù)平方根得到特征向量，如表9所示。其中主成分載荷矩陣主要反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小及作用方向，且絕對(duì)值越大表示相關(guān)性越密切。

用F1、F2、F3、F4、F5、F6分別代表6個(gè)公因子，Z1至Z13分別代表正態(tài)變換后的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，可得各主成分公因子表達(dá)式。

地上部分前2個(gè)主成分公因子表達(dá)式如下：

F1=0.290Z1+0.910Z2+0.290Z3+0.290Z4+0.290Z5+0.290Z6+0.170Z7+0.290Z8+0.290Z9+0.270Z10+0.270Z11+0.270Z12+0.280Z13? ? ? ? （1）

F2=-0.140Z1-0.140Z2-0.120Z3-0.170Z4+0.050Z5-0.100Z6+0.750Z7-0.110Z8-0.020Z9+0.350Z10+0.370Z11-0.230Z12-0.140Z13? ? ? （2）

地下部分前4個(gè)主成分公因子表達(dá)式如下：

F3=0.230Z1+0.390Z2+0.180Z3+0.290Z4+0.230Z5+0.300Z6+0.380Z7-0.290Z8+0.090Z9+0.220Z10+0.190Z11-0.230Z12-0.390Z13? ? ? （3）

F4=0.130Z1-0.090Z2-0.400Z3+0.170Z4+0.010Z5-0.360Z6-0.210Z7+0.260Z8+0.370Z9+0.410Z10+0.360Z11-0.330Z12-0.040Z13? ? ? ? （4）

F5=0.540Z1-0.180Z2-0.010Z3-0.020Z4+0.580Z5-0.050Z6-0.140Z7+0.290Z8-0.280Z9-0.100Z10-0.330Z11-0.140Z12-0.130Z13? ? （5）

F6=0.140Z1-0.003Z2+0.390Z3-0.130Z4+0.230Z5+0.310Z6-0.060Z7+0.400Z8+0.340Z9+0.150Z10+0.330Z11+0.430Z12+0.260Z13? ? ? （6）

將主成分因子占所提取主成分總特征值之和的比例作為權(quán)重系數(shù)，得到主成分綜合模型M。

地上部分主成分綜合模型M1的表達(dá)式如下：

M1=α1×F1+α2×F2? ? ? ? （7）

式中，α為主成分貢獻(xiàn)率；α1=0.890 4；α2=? ? 0.090 8。

地下部分主成分綜合模型M2的表達(dá)式如下：

M2=α1×F1+α2×F2+α3×F3+α4×F4? ? ? （8）

式中，α1=0.398 9；α2=0.215 0；α3=0.138 5；α4=0.097 9。

3.5.3 10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上、地下部分主成分綜合評(píng)價(jià) 針對(duì)主成分對(duì)紅穿破石地上、地下部分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，按照主成分公因子的表達(dá)式及主成分綜合模型M計(jì)算10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上部分和地下部分的綜合得分。

由表10、表11可知，10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上部分的綜合評(píng)分排名由高到低依次為HCPS-1、HCPS-7、HCPS-9、HCPS-4、HCPS-2、HCPS-6、HCPS-8、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-5。10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地下部分的綜合評(píng)分排名由高到低依次為HCPS-5、HCPS-7、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-1、HCPS-6、HCPS-2、HCPS-8、HCPS-9、HCPS-4。

4 小結(jié)與討論

已有文獻(xiàn)對(duì)紅穿破石藥用部分（即地下部分）進(jìn)行指紋圖譜分析［14］，本試驗(yàn)建立了紅穿破石地上、地下部分HPLC指紋圖譜分析方法，該方法可以同時(shí)對(duì)10個(gè)產(chǎn)地的紅穿破石地上、地下部分進(jìn)行測定，并運(yùn)用指紋圖譜相似度分析、聚類分析和主成分分析［22］ 3種方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中，供試品考察了不同溶劑、溶劑比例、液料比、時(shí)間、溫度等樣品處理方法，考察了不同流動(dòng)相、流速、柱溫、波長、色譜柱等色譜條件，最終確定紅穿破石樣品處理方法及色譜條件。

本試驗(yàn)建立了紅穿破石地上、地下部分HPLC指紋圖譜的檢測方法，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)分析，鑒定并指認(rèn)了紅穿破石地上、地下部分的大黃素成分。紅穿破石中除大黃素外，還有已知的大黃酚、大黃素甲醚等蒽醌類成分及翼核果素、翼核果醌。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大黃酚、大黃素甲醚在紅穿破石地上、地下部分含量較低且翼核果素及翼核果醌對(duì)照品難以獲取，大黃素在色譜圖上響應(yīng)值高、分離度較好、穩(wěn)定性良好，因此以大黃素為參照峰更具有代表性。

本研究對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上部分與地下部分的指紋圖譜共有峰面積進(jìn)行了主成分分析，結(jié)合碎石圖提取了地上部分前2個(gè)成分作為主成分，主成分A1、主成分A2的方差貢獻(xiàn)率分別為89.037%、9.078%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為98.115%；提取了地下部分前4個(gè)成分作為主成分，主成分B1、主成分B2、主成分B3、主成分B4的方差貢獻(xiàn)率分別為39.894%、21.495%、13.853%、9.793%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.035%。根據(jù)主成分綜合得分模型，對(duì)10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地上部分與地下部分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，地上部分的綜合評(píng)分排名由高到低依次為HCPS-1、HCPS-7、HCPS-9、HCPS-4、HCPS-2、HCPS-6、HCPS-8、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-5。10個(gè)產(chǎn)地紅穿破石地下部分的綜合評(píng)分排名由高到低依次為HCPS-5、HCPS-7、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-1、HCPS-6、HCPS-2、HCPS-8、HCPS-9、HCPS-4。綜上，HCPS-7（廣西桂林市平樂縣）的綜合質(zhì)量更優(yōu)。

受取樣環(huán)境的影響，本研究的藥材選取產(chǎn)地較少，且均來源于廣西，具有地域性，代表性不足，使得結(jié)果具有一定的局限性。后續(xù)將采集不同省份、不同地區(qū)以及不同采收期的紅穿破石，對(duì)紅穿破石地上、地下部分進(jìn)行深入的分析。此外，紅穿破石中很多化學(xué)成分尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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