孟昀晨 ，徐 丹，張偉南，熊 信，薛亞奇，安莎莎，張 嶸，甄志平*

（1. 北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875；2. 中國礦業(yè)大學(xué)（北京） 體育教研部，北京 100083；3. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100191）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，通常發(fā)病于3 歲前，并持續(xù)終生（Xiao et al.， 2014）。ASD 患者的行為表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，除了社交互動(dòng)障礙和重復(fù)刻板行為兩種核心癥狀外，還表現(xiàn)出其他精神疾病癥狀，包括運(yùn)動(dòng)、語言、智力、感覺、睡眠等障礙，以及發(fā)育遲緩、癲癇、強(qiáng)迫癥和注意力缺陷多動(dòng)行為等（李明娟 等， 2021； Hewitson， 2013）。Shank3基因缺陷是ASD 最常見的單基因風(fēng)險(xiǎn)因素之一（劉春雪 等， 2022； 徐丹 等， 2020）。對(duì)由Shank3基因缺陷引起ASD 的患者和動(dòng)物模型的深入研究為了解ASD 的潛在神經(jīng)病理學(xué)機(jī)制提供了機(jī)會(huì)。SHANK3 是一種突觸后的主支架蛋白，在興奮性突觸后致密部聚集，對(duì)突觸生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要（Monteiro et al.， 2017）。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Shank3基因在多個(gè)腦區(qū)表達(dá)，其中在紋狀體的表達(dá)最為豐富（Monteiro et al.， 2017）。

研究表明，ASD 的多種癥狀與紋狀體腦區(qū)的功能異常密切相關(guān)（孟昀晨 等， 2021；Li et al.， 2019）。其中，背側(cè)紋狀體介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)和執(zhí)行功能，可能與重復(fù)刻板行為和運(yùn)動(dòng)功能障礙有關(guān)（Langen et al.， 2014）。腹側(cè)紋狀體主要介導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)、認(rèn)知和目標(biāo)定向，與ASD 患者的強(qiáng)迫行為、僵化思維、執(zhí)行功能和異常社會(huì)共存模式有關(guān)（Kohls et al.， 2013）。ASD 的行為癥狀與紋狀體突觸可塑性的異常密切相關(guān)，突觸可塑性又受興奮-抑制性神經(jīng)遞質(zhì)及靶向的受體調(diào)控。谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的一對(duì)興奮-抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。大多數(shù)的皮層區(qū)域，包括感覺、運(yùn)動(dòng)和邊緣皮層，向紋狀體發(fā)送興奮性谷氨酸能突觸投射（Hintiryan， 2016），這有助于各種感覺、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知處理任務(wù)（Haber， 2016）。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）受體和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受體是重要的谷氨酸受體，其中AMPA 受體在興奮性信息傳遞中起先導(dǎo)作用，由GluA1～4 4 種亞基組成同四聚體或異四聚體。NMDA 受體作為另一種接受Glu 信號(hào)傳遞的重要興奮性受體，是影響神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵受體，包括NR1～3 3 種亞基，其中NR2 有A～D 4 種亞型。此外，紋狀體中的GABA 信號(hào)傳導(dǎo)也可以通過GABA受體的作用調(diào)節(jié)紋狀體神經(jīng)元功能。

體力活動(dòng)和豐富環(huán)境是神經(jīng)可塑性過程中的有利刺激（甄志平 等， 2020； Ball et al.， 2019），而游泳將體力活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)刺激與豐富環(huán)境的多元感官刺激相結(jié)合，是促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)可塑性的有效鍛煉方式之一（Musiyenko et al.， 2020）。適宜負(fù)荷的游泳運(yùn)動(dòng)可以對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和心肺功能產(chǎn)生積極的影響，在維持身心健康、減少負(fù)面情緒以及提高學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力方面發(fā)揮重要作用（馬春蓮 等，2018）。游泳與其他運(yùn)動(dòng)相比具有較強(qiáng)的適齡性，尤其是其可以作為嬰幼兒發(fā)育促進(jìn)的有效運(yùn)動(dòng)手段。許多人群研究都證明了游泳干預(yù)有助于減輕ASD的癥狀（Ennis， 2011；Pan， 2010；Yanardag et al.， 2013）。

綜上所述，游泳可以作為干預(yù)ASD 的有效手段，但目前ASD 干預(yù)的相關(guān)研究中，干預(yù)年齡主要集中在青少年期，很少有研究關(guān)注游泳對(duì)幼年期ASD 患者行為的影響。本研究團(tuán)隊(duì)先前已經(jīng)證明，Shank3基因敲除大鼠具有ASD 的典型癥狀——刻板行為，且紋狀體腦區(qū)的突觸蛋白表達(dá)異常（Song et al.， 2019），且已有研究證明，紋狀體功能障礙是ASD 刻板行為的基礎(chǔ)（Wang et al.， 2017）。因此，針對(duì)刻板行為和運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，本研究聚焦紋狀體腦區(qū)，對(duì)Shank3基因敲除大鼠進(jìn)行早期游泳干預(yù)，通過檢測(cè)紋狀體腦區(qū)樹突棘形態(tài)、支架蛋白表達(dá)和受體蛋白表達(dá)情況，探索早期游泳干預(yù)改善ASD 樣行為的機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為8 日齡Shank3基因敲除ASD 模型雄性大鼠，SPF 級(jí)。大鼠每籠飼養(yǎng)2～4 只，保持12 h∶12 h 光/暗循環(huán)，室溫20～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲食和飲水。

采用PCR 法對(duì)幼鼠鼠尾進(jìn)行基因型鑒定，鑒定中使用兩種引物，F(xiàn)1（CTGTTGGCTGAGCCTGGCATAGAG）和R1（GCTGGAAAGAAACAACGAGAGCCAG）用于檢測(cè)野生型鼠的等位基因（559 個(gè)堿基對(duì)），F(xiàn)2（TTGTGCACTGCCTATGTTGACCACT）和R2（TAGGCGAGAGAAGATGGTGTGATTTCC）檢測(cè)突變體缺失的等位基因（688 個(gè)堿基對(duì)）。根據(jù)基因型J 鑒定結(jié)果將幼鼠隨機(jī)分為4 組：Shank3基因敲除對(duì)照組（KC）、同窩野生型對(duì)照組（WC）、Shank3基因敲除游泳組（KS）、同窩野生型游泳組（WS），每組各20 只。為了盡量減少重復(fù)測(cè)試和處理的影響，每組大鼠進(jìn)行的行為測(cè)試不超過3 個(gè)。

1.2 游泳干預(yù)方案

幼鼠產(chǎn)后第8 天（PND8）時(shí)，對(duì)WS、KS 組大鼠進(jìn)行8 周游泳訓(xùn)練，每周游泳5 天，休息2 天。PND8 的大鼠對(duì)應(yīng)大約1 歲的兒童（Andreollo et al.， 2012）。本研究參照了de Santana Muniz 等（2013）的8 日齡SD 幼鼠早期游泳訓(xùn)練方法，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中8 日齡ASD 幼鼠的游泳情況，制定游泳干預(yù)計(jì)劃。PND8—10 為游泳適應(yīng)階段，在485 mm×350 mm×200 mm 矩形籠內(nèi)進(jìn)行游泳干預(yù)，水溫提前預(yù)熱，控制在（32±1）℃。在PND8 時(shí)，大鼠游泳2 min，水沒過大鼠腿部，水深約3 cm。在PND9，大鼠游泳5 min，水沒過大鼠肚子，水深約3.5～4 cm。在PND10，大鼠游泳10 min，水沒過大鼠頭部，水深約4.5～5 cm。PND13 后，在直徑為150 cm 的圓形水箱中進(jìn)行游泳干預(yù)，水位保持在50 cm。PND13—15期間，大鼠每天分別進(jìn)行15、20、25 min的游泳訓(xùn)練。在PND16—26 期間，大鼠每天游泳30 min，PND27—60期間，大鼠每天游泳40 min（圖1）。

圖1 早期游泳干預(yù)和行為測(cè)試方案Figure 1. Early Swimming Intervention and Behavior Testing Protocol

1.3 行為學(xué)測(cè)試

抓力測(cè)試和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)于大鼠PND61—63 的每天8∶00進(jìn)行，兩個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)間隔1 h。曠場(chǎng)與自梳理行為學(xué)測(cè)試于19∶00 進(jìn)行（圖1）。

1.3.1 自梳理實(shí)驗(yàn)

自梳理實(shí)驗(yàn)用于分析大鼠的刻板、重復(fù)行為。實(shí)驗(yàn)大鼠被放置在一個(gè)矩形盒子（40 cm×34 cm×40 cm）內(nèi)，先適應(yīng)10 min，然后使用紅外攝像機(jī)記錄10 min 內(nèi)大鼠在黑暗中的自我梳理行為（Song et al.， 2019）。自我梳理行為包括大鼠舔舐自己的身體和頭發(fā)、用前爪擦臉、抓撓軀干等。

1.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)大鼠的自由活動(dòng)與焦慮情緒（王莉穎等， 2019）。大鼠被放入矩形空曠盒子中（90 cm×90 cm×50 cm）并進(jìn)行適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)區(qū)與外界隔音，光照均勻，環(huán)境溫度維持在（24.0±0.5）℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)用紙板將大鼠輕輕移入曠場(chǎng)中央并同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，視頻錄制10 min。每只大鼠測(cè)試完成后清理糞便、尿液，然后用75%酒精消除氣味，待曠場(chǎng)完全干燥后放入下一只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。整個(gè)過程實(shí)驗(yàn)者保持安靜，并遠(yuǎn)離測(cè)試大鼠。通過視頻采集系統(tǒng)采集實(shí)驗(yàn)錄像，使用smart 3.0 軟件對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡和速度進(jìn)行分析。

1.3.3 抓力實(shí)驗(yàn)

抓力實(shí)驗(yàn)主要測(cè)試大鼠四肢力量。使用最大抓力測(cè)試儀（BIO-GS3 Grip strength，美國）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。前2 天為適應(yīng)階段，第3 天進(jìn)行正式測(cè)試。大鼠四肢抓住抓力測(cè)試儀上的金屬網(wǎng)后，勻速向后拖拽大鼠尾巴，當(dāng)大鼠前肢松開時(shí)記錄最高值即為最大抓力。每只大鼠測(cè)試3 次，每次間隔30 min，記錄3 次實(shí)驗(yàn)的最大值為最大抓力。最大抓力可反應(yīng)肌肉力量、神經(jīng)肌肉接頭功能。

1.3.4 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。使用轉(zhuǎn)棒測(cè)試儀（UGO BASILE）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。前2 天為適應(yīng)階段，適應(yīng)階段轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速為4 r/min，大鼠在轉(zhuǎn)棒測(cè)試儀上進(jìn)行適應(yīng)，掉落后，放回轉(zhuǎn)棒繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，總適應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為3 min/天。第3天正式測(cè)試，測(cè)試階段5 min 內(nèi)將轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速從4 r/min 勻速增加至40 r/min，大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落，或者抓住轉(zhuǎn)棒后連續(xù)旋轉(zhuǎn)兩圈而不在轉(zhuǎn)棒上行走即停止實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠掉落的時(shí)間。每只大鼠測(cè)試3 次，每次實(shí)驗(yàn)間隔30 min，取3 次實(shí)驗(yàn)的最大值。

1.4 高爾基染色

大鼠完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后24 h（PND64），使用10%水合氯醛麻醉致死，斷頭取腦。按照高爾基染色試劑盒（HTKNS1125， Hitobiotec）說明書，每cm3腦組織加入5 mL 等體積溶液1 和溶液2 混合液浸泡大鼠腦組織，室溫避光浸泡12～24 h，次日更換浸泡液，同條件貯存14 d。之后轉(zhuǎn)移至等體積溶液3 中，4 ℃避光貯存12 h，再更換等體積溶液3，同條件下儲(chǔ)存48～72 h。將腦組織從溶液3 中取出，置于異戊烷中冷凍干燥。再將腦組織于-20 ℃以下冰凍切片機(jī)上進(jìn)行切片，厚度為150 μm。腦組織切片在室溫避光干燥后進(jìn)行染色。使用激光共聚焦顯微鏡拍攝腦片中背側(cè)紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元樹突形態(tài)。紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons， MSNs）的特征為：1）在形態(tài)上存在大量的棘突和相對(duì)較短的神經(jīng)元分支；2）胞體為圓形或卵圓形，有3～8 個(gè)一級(jí)樹突。每組選取3 只大鼠，每只大鼠在10×目鏡下拍攝2 個(gè)神經(jīng)元，每個(gè)神經(jīng)元在40×目鏡下拍攝2 個(gè)樹突分支分析樹突棘密度。使用Image J 軟件對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行Sholl 分析，并分析樹突棘密度（姚涵 等， 2018）。

1.5 PSD蛋白提取及免疫印跡實(shí)驗(yàn)

各組大鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后24 h（PND64）斷頭取腦，在冰上分離右側(cè)紋狀體組織，置于-80 ℃冰箱待用。將紋狀體組織置于緩沖液1中（10 mmol/L HEPES，2 mmol/LEDTA，5 mmol/L Na3VO4，30 mmol/L NaF，20 mmol/L β-甘油磷酸酯，蛋白酶抑制劑）勻漿，4 ℃下500 rcf 離心5 min，取上層懸濁液。然后4 ℃下10 000 rcf 離心15 min，移去上清保留膜粗提取物。將膜粗提取物重懸于300～500 μL 緩沖液2中（50 mmol/L HEPES，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，5 mmol/L Na3VO4，30 mmol/L NaF，20 mmol/L β-甘油磷酸酯，1% Triton X-100，蛋白酶抑制劑），4 ℃下20 000 rcf 離心80 min，沉淀即為突觸后致密部（postsynaptic density， PSD）顆粒。將PSD顆粒重懸于50 μL緩沖液3 中（50 mmol/L Tris，5 mmol/L Na3VO4，30 mmol/L NaF，20 mmol/L β-甘油磷酸酯，1% NaDOC，蛋白酶抑制劑），即得到PSD 蛋白提取物。

使用Bredford 試劑盒測(cè)定PSD 蛋白提取物中的蛋白濃度。按總蛋白10 μg 含量上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離膠分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉。在一抗溶液中孵育過夜，各指標(biāo)一抗孵育濃度如下：SHANK2（1∶1 000）、PSD95（1∶2 000）、Homer1（1∶2 000）、GluA1（1∶2 000）、GluA2（1∶2 000）、NR1（1∶2 000）、NR2A（1∶2 000）、NR2B（1∶2 000）、mGluR（1∶1 000）、GABAR（1∶5 000）。TBST 漂洗后孵育二抗，再洗滌。之后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下使用ECL 發(fā)光液曝光。使用Image J 軟件分析條帶積分光密度值（IOD）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS 20 和GraphPad Prism 9.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，采用雙因素方差分析（two way ANOVA）。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 研究結(jié)果

2.1 基因型測(cè)定

Shank3基因敲除大鼠通過CRISPR-Cas9 技術(shù)刪除種系中的Shank311～21 號(hào)位點(diǎn)產(chǎn)生（Song et al.， 2019）（圖2A）。實(shí)驗(yàn)中所有受試大鼠均來自雜合子繁殖對(duì)。通過PCR 對(duì)鼠尾DNA 進(jìn)行鑒定，確認(rèn)基因型（圖2B）。為進(jìn)一步分析Shank3基因敲除大鼠紋狀體腦區(qū)SHANK3 蛋白的表達(dá)情況，使用針對(duì)SHANK3 富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的抗體進(jìn)行Western blot 印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，Shank3基因敲除大鼠紋狀體腦區(qū)確認(rèn)不存在SHANK3 蛋白，基因敲除成功（圖2C）。

圖2 Shank3基因敲除大鼠模型 （Meng et al.， 2022）Figure 2. Shank3 Knockout Rat Model （Meng et al.， 2022）

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 早期游泳對(duì)大鼠刻板行為的影響

重復(fù)刻板行為是ASD 的核心癥狀之一，表現(xiàn)為嚙齒類動(dòng)物的自我梳理行為（圖3A）增加。分析不同組別大鼠的自我梳理時(shí)間發(fā)現(xiàn)，與WC 組相比，KC 組大鼠的自我梳理時(shí)間明顯增加（P＜0.001）；KS 組大鼠的自我梳理時(shí)間明顯低于KC 組（P＜0.05）；WS 組大鼠的自梳理時(shí)間相比WC 組有所增加，但并無顯著差異（P＞0.05）（圖3B）。這些結(jié)果表明，Shank3基因敲除大鼠表現(xiàn)出重復(fù)刻板行為，早期游泳干預(yù)可以減少Shank3基因敲除大鼠的刻板行為，但對(duì)野生型大鼠并無影響。

圖3 早期游泳干預(yù)后大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果Figure 3. Behavioral Test Results after Early Swimming Intervention

2.2.2 早期游泳對(duì)大鼠焦慮情緒與自由活動(dòng)的影響

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡可以反映大鼠的焦慮情緒，活動(dòng)距離可以反映大鼠的自由活動(dòng)情況。結(jié)果顯示，KC組大鼠在曠場(chǎng)邊緣區(qū)域的停留時(shí)間顯著高于WC 組（P＜0.05）和WS 組（P＜0.01）（圖3D），自由活動(dòng)的總距離顯著低于WC 組（P＜0.001）和WS 組（P＜0.001）（圖3E）。早期游泳干預(yù)后，KS 組大鼠在邊緣區(qū)域的停留時(shí)間與KC 組相比未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）（圖3D），但自由活動(dòng)總距離顯著增加（P＜0.001）（圖3E）。這些結(jié)果表明，Shank3基因敲除大鼠明顯存在焦慮情緒，且自由活動(dòng)度較低，早期游泳干預(yù)未能明顯改善Shank3基因敲除大鼠的焦慮情況，但顯著提升了其自由活動(dòng)距離。

2.2.3 早期游泳對(duì)大鼠肌肉力量的影響

大鼠最大抓力測(cè)試結(jié)果顯示，KC 組大鼠最大抓力顯著低于WC 組（P＜0.01）。在游泳干預(yù)后，KS 組大鼠最大抓力顯著高于KC 組（P＜0.05），與WC 組已無顯著差異，但顯著低于WS 組（P＜0.05）（圖3G）。這些結(jié)果表明，Shank3基因敲除大鼠的肌肉力量顯著降低，早期游泳干預(yù)可以改善Shank3基因敲除大鼠的肌肉力量，且早期游泳干預(yù)對(duì)野生型大鼠的肌肉力量也有一定的強(qiáng)化效果。

2.2.4 早期游泳對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的影響

在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，大鼠在轉(zhuǎn)棒上掉落的潛伏期越長(zhǎng)，代表大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力越好。結(jié)果顯示（圖3I），KC 組大鼠在轉(zhuǎn)棒掉落的潛伏期顯著低于WC 組大鼠（P＜0.001）。早期游泳干預(yù)后，KS 組大鼠轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期顯著高于KC組（P＜0.05），與WC 組已無顯著差異（P＞0.05）。WS 組大鼠轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期顯著高于WC 組（P＜0.05），且顯著高于KS 組（P＜0.001）。這些結(jié)果表明，Shank3基因敲除導(dǎo)致大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力顯著降低；早期游泳干預(yù)后，基因敲除大鼠和野生型大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力均得到了顯著提高。

2.3 紋狀體腦區(qū)樹突形態(tài)檢測(cè)結(jié)果

激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察各組大鼠紋狀體MSNs 樹突分支與樹突棘密度（圖4）。結(jié)果顯示，KC 組大鼠紋狀體樹突分支數(shù)在距離胞體60～100 μm 段顯著低于WC 組和WS 組，在60 μm 處顯著低于KS 組（圖4B）。KC組大鼠紋狀體樹突分支數(shù)量顯著低于WC 組（P＜0.05），早期游泳干預(yù)后，KS 組大鼠紋狀體樹突分支數(shù)量顯著多于KC 組（P＜0.01）（圖4C）。從紋狀體樹突分支總長(zhǎng)度看，KC 組大鼠紋狀體樹突分支總長(zhǎng)度最短，顯著低于WC組（P＜0.01），早期游泳干預(yù)后，KS 組和WS 組大鼠紋狀體樹突分支總長(zhǎng)度顯著大于KC 組（P＜0.05），與WC 組無顯著差異（圖4D）。這些結(jié)果表明，Shank3基因敲除導(dǎo)致大鼠紋狀體MSNs 樹突分支數(shù)量和總長(zhǎng)度減少，早期游泳干預(yù)改善了Shank3基因敲除對(duì)樹突分支數(shù)量和總長(zhǎng)度的影響，但對(duì)野生型大鼠無顯著作用。

圖4 早期游泳干預(yù)后大鼠紋狀體樹突形態(tài)Figure 4. Dendritic Morphology of Rat Striatum after Early Swimming Intervention

通過比較各組大鼠紋狀體樹突棘密度（樹突棘數(shù)量/10 μm）發(fā)現(xiàn)，KC 組大鼠樹突棘密度顯著低于WC 組（P＜0.01），早期游泳干預(yù)后，KS 組大鼠樹突棘密度顯著高于KC 組（P＜0.05），與WC 組無顯著差異（P＞0.05）。游泳干預(yù)后，WS 組大鼠紋狀體樹突棘密度也得到提高，顯著高于WC 組（P＜0.05），且顯著高于KC 組（P＜0.001）和KS 組（P＜0.01）（圖4F）。這些結(jié)果表明，Shank3基因敲除導(dǎo)致大鼠紋狀體樹突棘密度降低，早期游泳干預(yù)不僅能改善基因敲除對(duì)樹突棘密度的影響，還可以提高野生型大鼠的樹突棘密度。

2.4 紋狀體興奮性突觸后支架蛋白的表達(dá)情況

為了探討早期游泳對(duì)ASD 樣大鼠紋狀體興奮性突觸后支架蛋白的影響，本研究對(duì)紋狀體PSD 中興奮性突觸后支架蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)（圖5A）。結(jié)果顯示，在紋狀體PSD 組分中，各組間SHANK2 蛋白的表達(dá)水平無顯著差異（圖5B），KC 組大鼠紋狀體PSD95、Homer1 蛋白表達(dá)顯著低于WC 組（P＜0.05）和WS 組（P＜0.05）。早期游泳干預(yù)后，KS 組大鼠紋狀體PSD95 蛋白表達(dá)顯著高于KC 組（P＜0.05）。結(jié)果表明，Shank3基因敲除導(dǎo)致大鼠紋狀體PSD 中興奮性突觸后支架蛋白表達(dá)降低，早期游泳干預(yù)增加了紋狀體PSD 中PSD95 的表達(dá)。

圖5 早期游泳干預(yù)后大鼠紋狀體突觸后致密部支架蛋白表達(dá)Figure 5. Expression of Scaffold Protein in Rat Striatal Postsynaptic Density after Early Swimming Intervention

2.5 紋狀體興奮性突觸后受體蛋白的表達(dá)情況

為了探討早期游泳對(duì)ASD 樣大鼠紋狀體受體蛋白表達(dá)的影響，本研究進(jìn)一步對(duì)紋狀體PSD 中Glu 能受體和GABA 能受體蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)（圖6A）。結(jié)果顯示，在紋狀體PSD 組分中，KC 組大鼠AMPA 受體亞基GluA1、GluA2 表達(dá)顯著低于WC 組（P＜0.001，P＜0.01）和WS 組（P＜0.001）。早期游泳干預(yù)后，WS 組大鼠與WC組無差異，但KS 組大鼠GluA1、GluA2 表達(dá)均顯著高于KC 組（P＜0.05；圖6B、6C）。對(duì)NMDA 受體的3 個(gè)亞基NR1、NR2A 和NR2B 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，KC組大鼠紋狀體PSD 組分中NR1、NR2A、NR2B 表達(dá)均顯著低 于WC 組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）和WS 組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）。早期游泳干預(yù)后WS 組NMDA受體亞基表達(dá)與WC 組仍無差異，KS 組大鼠紋狀體PSD組分中NR1 表達(dá)略有升高，與WC 和WS 組相比無顯著差異（P＞0.05），KS 組NR2A、NR2B 表達(dá)顯著高于KC 組（P＜0.05）（圖6D、6E、6F）。4個(gè)組別的mGluR5蛋白表達(dá)（圖6G）與GABA 受體蛋白表達(dá)（圖6H）均無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 早期游泳干預(yù)后大鼠紋狀體突觸后致密部受體蛋白表達(dá)Figure 6. Expression of Striatal Postsynaptic Dense Part Receptor Protein after Early Swimming Intervention

3 討論

ASD 相關(guān)的致病因素眾多，包括參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的基因（MECP2、MEF2）、參與翻譯調(diào)節(jié)的基因（Staufen、FMRP）、細(xì)胞黏附分子（NLGN1、α-neurexin）和支架蛋白（Shank 家族、Homer1、PSD95）等（Gatto et al.， 2010）。相較于參與細(xì)胞分子調(diào)節(jié)過程的基因，支架蛋白的破壞性更加簡(jiǎn)單直接。Shank3是ASD 的一個(gè)重要致病基因（Genovese et al.， 2020）。關(guān)于Shank3基因不同外顯子缺失的動(dòng)物模型研究表明，Shank3基因缺失可以引起ASD樣癥狀（劉海鷹 等， 2018；劉加強(qiáng) 等， 2016）。本研究對(duì)Shank3基因11～21 號(hào)外顯子敲除大鼠進(jìn)行了行為學(xué)測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Shank3基因敲除大鼠不僅存在嚴(yán)重的重復(fù)刻板行為和焦慮情緒，并且在運(yùn)動(dòng)能力方面也存在缺陷，包括自主活動(dòng)度較低，肌肉力量和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力較差。結(jié)果證明，Shank3基因11～21 號(hào)外顯子敲除大鼠是典型的伴隨運(yùn)動(dòng)功能障礙的ASD 動(dòng)物模型。

3.1 Shank3基因?qū)y狀體突觸形態(tài)和功能的影響

ASD 的癥狀，特別是刻板行為和運(yùn)動(dòng)障礙與紋狀體腦 區(qū) 的 功 能 密 切 相 關(guān)（Peca et al.， 2011； Wang et al.，2017）。SHANK3 蛋白在紋狀體腦區(qū)的表達(dá)最為豐富（Monteiro et al.， 2017），定位于樹突和胞體中，可通過肌動(dòng)蛋白依賴的機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育（Halbedl et al.，2016），促進(jìn)樹突棘的形成并調(diào)節(jié)其數(shù)量（Grabrucker et al.，2011）。研究表明，Shank3基因突變與樹突分支異常有很強(qiáng)的相關(guān)性，神經(jīng)元胞體面積、軸突數(shù)目和長(zhǎng)度都受到Shank3基因突變的顯著影響（Kathuria et al.， 2018；Peca et al.，2011；Wang et al.， 2016）。研究團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)，Shank311～21 號(hào)外顯子缺失的大鼠模型海馬腦區(qū)樹突棘密度降低（Song et al.， 2019）。本研究對(duì)紋狀體MSNs 的樹突分支數(shù)量、樹突總長(zhǎng)度和樹突棘密度進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Shank311～21 號(hào)外顯子缺失大鼠紋狀體MSN 樹突分支數(shù)量、總長(zhǎng)度和樹突棘密度均顯著降低。突觸后的分子組分是突觸形態(tài)的基礎(chǔ)，因此，本研究進(jìn)一步對(duì)參與組成突觸后組分的支架蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)SHANK2 蛋白表達(dá)，探討Shank3基因敲除是否引起了SHANK2 蛋白的代償作用，結(jié)果顯示，SHANK2 蛋白表達(dá)并未發(fā)生變化。檢測(cè)興奮性突觸后的其他重要支架蛋白PSD95 和Homer1 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯 示，PSD95 和Homer1表達(dá)都有所降低，證實(shí)了Shank3基因敲除對(duì)MSNs 樹突發(fā)育的破壞。

在突觸受體表達(dá)方面，AMPA 受體在興奮性信息傳遞中起先導(dǎo)作用，在樹突棘結(jié)構(gòu)中含量豐富，其功能與樹突棘形態(tài)發(fā)育密切相關(guān)。NMDA 受體廣泛表達(dá)于錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元中，參與調(diào)節(jié)一些與動(dòng)作學(xué)習(xí)相關(guān)的復(fù)雜認(rèn)知和行為過程。有研究證明，Shank3基因不同位點(diǎn)的缺失會(huì)導(dǎo)致紋狀體Glu 能受體蛋白的改變（Peca et al.， 2011；Wang et al.，2016）。本研究對(duì)AMPA 受體亞基GluA1、GluA2，NMDA 受體亞基NR1、NR2A、NR2B，mGluR 亞基mGluR5 表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。與前人研究結(jié)果類似，Shank3基因敲除大鼠紋狀體GluA1、GluA2、NR1、NR2A、NR2B 的表達(dá)均降低。

3.2 早期游泳干預(yù)對(duì)Shank3敲除大鼠紋狀體突觸結(jié)構(gòu)可塑性的調(diào)控作用

運(yùn)動(dòng)作為神經(jīng)可塑性過程的有利刺激，在促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育、改善社會(huì)交往（Gopinath et al.， 2018）、提高執(zhí)行功能（陳愛國 等， 2021）和記憶能力（Erickson et al.， 2019）等方面的作用日益凸顯。游泳是生命早期可行的有效運(yùn)動(dòng)方案之一，在以往的動(dòng)物游泳干預(yù)研究中，干預(yù)時(shí)間通常設(shè)定在PND21 之后（Kim et al.， 2020；Ma， 2020）。然而，本研究對(duì)幼年期的ASD 模型動(dòng)物進(jìn)行游泳干預(yù)，選擇了PND8 到PND60 作為游泳干預(yù)時(shí)間，因?yàn)榇笫蟮腜ND8 大約相當(dāng)于人類的1～2 歲，大鼠的PND60 大約相當(dāng)于人類的成年期。本研究選擇這個(gè)干預(yù)時(shí)期與臨床ASD 的最早診斷時(shí)間相對(duì)應(yīng)，即ASD 癥狀最早出現(xiàn)是在出生后1～2 歲（Sturner et al.， 2017）。更重要的是，根據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的建議，早期干預(yù)可以顯著改善ASD 兒童的相關(guān)癥狀，對(duì)ASD 兒童的治療應(yīng)在ASD 癥狀出現(xiàn)后立即開始。

對(duì)游泳干預(yù)ASD 患者的研究表明，游泳可以改善ASD兒童的體能和耐力（Pan， 2011； Yanardag et al.，2013），并對(duì)其認(rèn)知功能如社會(huì)交往、情感和學(xué)習(xí)產(chǎn)生積極影響（Chu et al.， 2012； Ennis， 2011）。此外，游泳可以減 少ASD 兒童刻板行為的發(fā)生（Yilmaz et al.， 2004）。ASD 動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)干預(yù)研究也證明了運(yùn)動(dòng)可以改善ASD 動(dòng)物模型的癥狀，但這些研究的ASD 模型多為采用孕期藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型（Ghahremani et al.， 2022； Tu et al.，2023；Wang et al.， 2020）。然而ASD 的致病因素主要以遺傳因素為主，約占37%～90%（楊志亮 等， 2016）。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，突觸支架組分相關(guān)的Shank3基因缺陷的臨床ASD 患者占有較高比例，近10%（Uchino et al.， 2013），因此對(duì)Shank3基因敲除ASD 模型的干預(yù)研究具有重要意義。與藥物誘導(dǎo)的ASD 模型不同，Shank3敲除模型動(dòng)物的基因組中消除了Shank3基因的重要區(qū)段，因此難以通過非基因手段來恢復(fù)SHANK3 蛋白的正常表達(dá)，在此前提下的運(yùn)動(dòng)干預(yù)治療是否仍能逆轉(zhuǎn)基因缺陷導(dǎo)致的行為異常是本研究的重點(diǎn)。本研究對(duì)Shank3基因敲除動(dòng)物模型進(jìn)行了早期游泳干預(yù)，發(fā)現(xiàn)早期游泳改善了ASD 模型大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，主要表現(xiàn)在自主活動(dòng)能力、力量和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的提高，同時(shí)也改善了ASD 核心癥狀中的重復(fù)刻板行為，但并未改善焦慮情緒。

這些結(jié)果證明，早期游泳干預(yù)可以改善Shank3基因缺陷導(dǎo)致的行為異常。因此，本研究對(duì)與這些行為相關(guān)的紋狀體突觸形態(tài)、支架蛋白和受體蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，早期游泳干預(yù)顯著改善了Shank3基因敲除大鼠的紋狀體MSNs 樹突形態(tài)，表現(xiàn)在MSNs 樹突分支數(shù)和總長(zhǎng)度顯著增加，樹突棘密度顯著提高。表明早期游泳的多元感官刺激和運(yùn)動(dòng)練習(xí)顯著促進(jìn)了紋狀體MSNs 發(fā)育，改善突觸形態(tài)。這也為早期游泳改善與紋狀體相關(guān)的行為提供了形態(tài)學(xué)支持。進(jìn)一步探索新生成的樹突結(jié)構(gòu)主要是由哪些支架蛋白和受體蛋白的增加引起的，結(jié)果顯示，早期游泳干預(yù)顯著增加了Shank3基因敲除大鼠紋狀體興奮性突觸后支架蛋白中PSD95 的表達(dá)，并顯著提高了AMPA 受體亞基GluA1、GluA2 和NMDA 受體亞基NR2A 和NR2B 的表達(dá)。這些結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)在不改變SHANK3 和SHANK2 蛋白表達(dá)的情況下，仍能改善突觸形態(tài)及質(zhì)量，這可能與以下因素有關(guān)：1）Shank3基因有22 個(gè)外顯子，本研究的動(dòng)物模型只敲除了11～21 號(hào)外顯子，并未完全敲除，然而為排除其他Shank 家族蛋白的影響特異性檢測(cè)SHANK3 蛋白，我們使用的抗體為anti-SHANK3 （781-1009 和1260-1392氨基酸）（Song et al.，2019），并不能檢測(cè)殘缺的SHANK3 蛋白的情況，然而殘缺的SHANK3 蛋白仍可能發(fā)揮作用。2）興奮性突觸的形成并不絕對(duì)依賴于SHANK3 蛋白。興奮性突觸后的組成非常復(fù)雜，包括多個(gè)蛋白質(zhì)，如PSD95、Homer1、DLGAP1和SAPAPs 等（孟昀晨 等， 2021），它們均參與突觸的形成和維持，本研究中也發(fā)現(xiàn)了PSD95 蛋白的增加。

綜上所述，早期游泳引起的Shank3基因敲除大鼠紋狀體突觸結(jié)構(gòu)可塑性的變化，即樹突結(jié)構(gòu)、興奮性突觸后的支架蛋白與受體蛋白的改變，是早期游泳干預(yù)后Shank3基因敲除大鼠ASD 樣行為得到改善的重要機(jī)制，并提示早期游泳引起的紋狀體MSNs 突觸形態(tài)和功能的變化并不依賴于Shank3基因。

4 結(jié)論

Shank3基因敲除大鼠紋狀體樹突發(fā)育受損，興奮性突觸后PSD95、Homer1、GluA1、GluA2、NR1、NR2A 和NR2B受體表達(dá)降低，并出現(xiàn)ASD 樣癥狀，刻板行為與運(yùn)動(dòng)功能障礙。早期游泳干預(yù)對(duì)Shank3基因敲除大鼠的ASD 樣行為具有改善效果，主要通過上調(diào)紋狀體樹突分支數(shù)、樹突總長(zhǎng)度與樹突棘密度，及部分興奮性突觸后受體表達(dá)。此外，早期游泳引起的紋狀體形態(tài)和功能的變化并不依賴于Shank3基因。