曹燕妮，華 蓉，游金坤，代秋瓊，孫達鋒，**

（1.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；3.云南云菌科技（集團）有限公司，云南 昆明 650221）

松茸 [Tricholoma matsutake（S. Ito & S. Imai）Singer] 是一種稀有的食（藥） 用真菌，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 蘑菇綱（Agaricomycetes） 蘑菇目（Agaricales） 口蘑科（Tricholomataceae） 口蘑屬（Tricholoma），被譽為“菌中之王”[1]。國內(nèi)松茸主要分布于吉林、云南、四川和西藏地區(qū)[2]。

松茸菌肉肥厚、鮮嫩爽滑，富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸（全部必需氨基酸和10 多種非必需氨基酸），以及多糖、糖醇、萜類、皂苷、甾類、油脂、香豆素、生物堿、微量元素、維生素等多種物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值[3-6]。

麥角甾醇（ergosterol） 又稱麥角固醇，是真菌類的特征甾體，是真菌細(xì)胞膜中最豐富的天然脂質(zhì)，是構(gòu)成真菌細(xì)胞膜的重要組分，在確保細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性、膜通透性、物質(zhì)運輸、細(xì)胞活力等方面具有重要的生物學(xué)作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)麥角甾醇具有免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、利尿等功效[9-10]。

目前麥角甾醇的檢測方法主要有紫外分光光度法、薄層色譜掃描法、高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法、定量核磁共振法[11-12]。目前，文獻中食用菌麥角甾醇的檢測主要集中于香菇（Lentinula edodes）、白玉菇（Hypsizygus marmoreus）、姬松茸（Agaricus blazei）、黑木耳（Auricularia heimuer）、雞油菌（Cantharellus cibarius）、茶樹菇（Cyclocybe chaxingu）、冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）、靈芝（Ganoderma lingzhi）等常見的食（藥） 用菌，關(guān)于松茸中麥角甾醇的檢測報道較少?；诔咝б合嗌V-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法高靈敏度、高效分離能力的優(yōu)勢，通過液相色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化和方法學(xué)評價，建立UHPLC-MS/MS 法快速測定松茸中麥角甾醇含量的方法，旨在為松茸中有效成分的質(zhì)量評價和深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松茸采購于云南麗江市、香格里拉市、彌渡縣、雙柏縣、巍山縣、鶴慶縣、牟定縣、劍川縣、姚安縣、南華縣、楚雄彝族自治州中山鎮(zhèn)等11 個地區(qū)。收集樣品后于50 ℃烘干，粉碎過80 目篩后備用。

麥角甾醇（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司；無水乙醇（色譜純），上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Fortis 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（APCI 源），賽默飛世爾科技公司；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；T-214 型電子天平，美國丹佛儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精確稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg（精確至0.1 mg），用無水乙醇（色譜純） 溶解后定容至10 mL，即得到麥角甾醇質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取1.00 mL 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用無水乙醇（色譜純） 稀釋并定容至100 mL，即得到麥角甾醇質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：吸取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)中間液50、100、200、400、600、800、1 000 μL，使用無水乙醇（色譜純） 稀釋并定容至10 mL，搖勻，得到麥角甾醇質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、600、800、1 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用時配制。

1.3.2 松茸樣品前處理

準(zhǔn)確稱取松茸樣品0.2 g 于100 mL 平底燒瓶中，加入40 mL 無水乙醇（分析純），于80 ℃恒溫水浴中回流1 h[13]。回流完成后冰浴冷卻，將提取液全部轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用無水乙醇（分析純） 定容，離心后取上清液過0.45 μm 有機相濾膜作為待測液。不加試樣，按同一操作方法做空白試驗，每個樣品3 次重復(fù)。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為5 μL；選取100%甲醇、96%甲醇、100%乙腈3 種流動相。

質(zhì)譜檢測條件：選用大氣壓化學(xué)電離（APCI） 為離子源，正離子模式掃描，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM），電暈放電電流4 μA，離子傳輸管溫度350 ℃，霧化溫度300 ℃，鞘氣30 Arb，輔助氣10 Arb。

1.3.4 方法學(xué)驗證

1） 線性范圍和檢出限試驗。將1.3.1 中的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液采用1.3.3 中的儀器條件進行測定，以工作液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程。

參照標(biāo)準(zhǔn)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ 168-2020）[14]附錄A 中A.1.1 方法確定麥角甾醇的檢出限。

2） 精密度試驗。在線性范圍內(nèi)配制高（700 ng·mL-1）、中（370 ng·mL-1）、低（95 ng·mL-1） 3 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個濃度6 次重復(fù)，測定麥角甾醇濃度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（relative stardard deviation，RSD）。

3） 重復(fù)性試驗。稱取0.2 g 彌渡縣松茸試樣6份，按照1.3.2 制備樣品溶液，測定麥角甾醇含量并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

4） 加標(biāo)回收率試驗。稱取0.1 g 彌渡縣松茸試樣9 份，按照樣品麥角甾醇含量的80%、100%和120%添加標(biāo)準(zhǔn)品進行加標(biāo)回收試驗，每個添加量3次重復(fù)，按照1.3.2 制備樣品溶液，測定麥角甾醇含量并計算加標(biāo)回收率。

1.3.5 樣品中麥角甾醇含量計算

試樣中麥角甾醇含量（X，mg·g-1） 的計算公式為：

式中：c 為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的試液中麥角甾醇的濃度（ng·mL-1）；V 為試液的定容體積（mL）；f 為試液稀釋倍數(shù)；m 為試樣的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS 法檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 液相條件優(yōu)化

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 為固定相，選用相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進樣，比較了3 種不同流動相的洗脫效果。結(jié)果表明，采用100%甲醇作為流動相時，目標(biāo)物離子峰響應(yīng)強度較高，峰寬小、峰型更窄更尖銳，選擇100%甲醇作為流動相。麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖詳見圖1。

圖1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of ergosterol standard

2.1.2 質(zhì)譜分析參數(shù)優(yōu)化

麥角甾醇分子式為C28H44O，分子量為396.339，極性相對較弱，因此選擇大氣壓化學(xué)電離（APCI）作為離子源。麥角甾醇在質(zhì)譜一級掃描中主要生成[M+H-H2O]+準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)核比為379.379，獲得的麥角甾醇一級質(zhì)譜掃描圖譜見圖2。母離子信號穩(wěn)定后，進行子離子掃描，獲得的二級質(zhì)譜掃描圖譜見圖3。質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry detection parameter

圖2 麥角甾醇一級質(zhì)譜離子掃描圖譜Fig.2 First-order mass spectra of ergosterol

圖3 麥角甾醇二級質(zhì)譜離子掃描圖譜Fig.3 Second-order mass spectra of ergosterol

由圖2、圖3 和表1 可知，麥角甾醇母離子質(zhì)荷比為379.379，轟擊產(chǎn)生的離子碎片較多，根據(jù)信號強度和干擾程度，選擇二級特征離子質(zhì)荷比為69.05、125.08、309.25，選擇麥角甾醇的定量離子對質(zhì)荷比為379.379/69.05，定性離子對質(zhì)荷比為379.379/125.08 和379.379/309.25。

樣品進行前處理后，按照優(yōu)化的檢測條件得到松茸樣品中麥角甾醇的色譜圖見圖4。

圖4 松茸樣品中麥角甾醇色譜圖Fig.4 Chromatogram of ergosterol in Tricholoma matsutake sample

由圖4 結(jié)果表明，樣品中麥角甾醇在2.49 min出峰，與標(biāo)準(zhǔn)品保持一致，色譜圖基線平穩(wěn)，峰型對稱尖銳，峰前有少量雜峰，但不影響麥角甾醇的定性和定量分析。

2.2 線性范圍和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按照優(yōu)化的檢測條件測定，進行線性回歸分析，得到回歸方程Y=56.97X-553.5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度50～1 000 ng·mL-1范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品麥角甾醇濃度與峰面積線性關(guān)系良好，符合方法學(xué)要求。

空白試驗中未檢出目標(biāo)物，計算得出檢出限為5 ng·mL-1，定量限為20 ng·mL-1。

2.3 精密度試驗

配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照優(yōu)化的檢測條件測定麥角甾醇含量，精密度試驗結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果Tab.2 Test results of precision

由表2 可知，3 個濃度的RSD 值依次為2.76%、1.49%、1.45%，說明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗

6 份松茸試樣按照優(yōu)化的檢測條件測定麥角甾醇含量，重復(fù)性試驗結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.3 Test results of repeatability

試驗結(jié)果表明，6 次平行試驗結(jié)果的RSD 值為1.83%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 加標(biāo)回收率

3 個不同麥角甾醇添加量的加標(biāo)試樣按照優(yōu)化的檢測條件測定麥角甾醇含量，加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Tab.4 Test results of recovery rate

由表4 可知，3 個不同添加量的平均加標(biāo)回收率為90.1%～98.5%，RSD 值為1.57%～2.49%，說明該方法具有良好的回收率。

2.6 樣品分析結(jié)果

根據(jù)上述試驗條件，測定云南11 個不同產(chǎn)地松茸的麥角甾醇含量，結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地松茸中麥角甾醇的含量Tab.5 The content of ergosterol in Tricholoma matsutake from different regions

由表5 可知，云南11 個地區(qū)松茸子實體中麥角甾醇的含量為3.677 2～4.497 8 mg·g-1，平均含量為4.140 0 mg·g-1，不同產(chǎn)地松茸麥角甾醇含量的變異系數(shù)為7.3%，其中巍山縣松茸麥角甾醇含量最高，楚雄州中山鎮(zhèn)松茸的含量最低。

3 討論與結(jié)論

食用菌麥角甾醇常用的提取方法有閃式提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、加壓溶劑萃取法、超臨界流體CO2萃取法等[15]。供試樣品前處理采用無水乙醇回流提取，操作簡便、重復(fù)性好、成本低，但耗時較長，在下一步研究中可以進行提取方法的改進。

采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS），通過液相、質(zhì)譜條件優(yōu)化，建立了一種適用于松茸中麥角甾醇檢測的方法，并進行方法學(xué)考察。方法驗證表明，該方法在質(zhì)量濃度為50～1 000 ng·mL-1時線性關(guān)系良好，重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，麥角甾醇的檢測特異性良好。試驗結(jié)果顯示，該方法可在5 min 內(nèi)完成麥角甾醇的檢測，檢出限低、靈敏度高，在一定程度上提高了樣品分析效率，可以快速、準(zhǔn)確的測定松茸中麥角甾醇的含量。