陳 珣，肇 瑩，龔 娜，劉國(guó)麗，馬曉穎，肖 軍

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161）

金針菇（Flammulina velutipes） 學(xué)名毛柄金錢菌，又稱毛柄小火菇，屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes） 傘菌目（Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 金針菇屬（Flammulina），因其菌柄纖細(xì)而被稱為金針菇，是生活中常見的一種食用菌[1]。我國(guó)金針菇栽培歷史悠久，且其生長(zhǎng)周期短，原料來源廣，經(jīng)濟(jì)效益高，既適用于家庭栽培，又能進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，是一種發(fā)展?jié)摿艽笄抑档猛茝V的食用菌[2]。

金針菇屬于低溫型恒溫結(jié)實(shí)性菌類，溫度對(duì)其菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育有重要的影響。菌絲的培養(yǎng)溫度不僅影響菌絲的生長(zhǎng)速度，而且直接影響菌絲的生物量。在金針菇栽培生產(chǎn)中，菌絲生物量與后期出菇產(chǎn)量有直接關(guān)系[3]。溫度條件的篩選主要是以菌絲的生長(zhǎng)速度為標(biāo)準(zhǔn)，特別是在菌絲生長(zhǎng)階段，將菌絲在平板上生長(zhǎng)速度最快時(shí)的溫度作為生產(chǎn)中的發(fā)菌溫度。

試驗(yàn)研究了不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，通過比較菌絲在不同溫度下的生長(zhǎng)差異，得出菌絲生長(zhǎng)的最適溫度。菌絲在不同溫度下的生長(zhǎng)差異反映了構(gòu)成菌絲的細(xì)胞在不同溫度下的生長(zhǎng)分裂速度，也是菌絲代謝酶活性的間接反應(yīng)，可以為研究溫度對(duì)食用菌子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響奠定基礎(chǔ)[4]。以此為切入點(diǎn)，以64 株金針菇菌株為試驗(yàn)材料，通過觀察和分析不同溫度條件下金針菇菌株菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度，探討培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，依此篩選出低溫型、高溫型和廣溫型菌株。利用聚類熱圖分析確定金針菇菌株間的親緣關(guān)系，為金針菇生產(chǎn)和新品種選育提供依據(jù)；篩選出優(yōu)異基因型，為金針菇品質(zhì)育種提供雜交親本。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株信息見表1 所示。

表1 供試菌株Tab.1 Test strains

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，蒸餾水1 L。培養(yǎng)基配好后，裝于500 mL三角瓶，0.1 MPa 滅菌30 min，滅菌后倒入培養(yǎng)皿冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)方法

將64 株金針菇菌株母種平板培養(yǎng)基活化后，用6 mm 的打孔器取大小相同的圓形菌塊接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)。設(shè)置7 個(gè)培養(yǎng)溫度，分別在溫度為5、10、15、20、25、30、35 ℃條件下培養(yǎng)，每種溫度條件設(shè)置3 次重復(fù)[5]。記錄菌絲生長(zhǎng)天數(shù)、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)，計(jì)算不同溫度下的菌絲生長(zhǎng)速度。

平板接種后3～4 d，采用“十”字劃線法，沿菌絲生長(zhǎng)邊緣劃線，測(cè)定其直徑，之后每隔2 天進(jìn)行一次測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。菌絲生長(zhǎng)速度（V，mm·d-1） 的計(jì)算公式為[6]：

式中：S 為菌絲長(zhǎng)度（mm）；D 為菌絲生長(zhǎng)天數(shù)（d）。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)通過Excel 2013 軟件進(jìn)行處理分析。采用Clust Vis 軟件進(jìn)行聚類熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇菌株不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)勢(shì)調(diào)查

不同金針菇菌株在相同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)情況見圖1，同一金針菇菌株在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況見圖2 和表2。

圖2 金針菇菌株3-Y4 金在不同溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)情況Fig.2 Mycelium growth situation of Flammulina velutipes strain 3-Y4 jin under different temperature conditions

表2 金針菇菌株不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)勢(shì)Tab.2 Mycelial growth potential of Flammulina velutipes strains under different temperature conditions

由圖1 可知，不同金針菇菌株25 ℃溫度條件下菌絲生長(zhǎng)勢(shì)不同。1 號(hào)菌株和12 號(hào)菌株生長(zhǎng)勢(shì)較弱，生長(zhǎng)速度緩慢；8 號(hào)菌株、27 號(hào)菌株、28 號(hào)菌株生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，但生長(zhǎng)速度一般；而30 號(hào)菌株、31 號(hào)菌株、32 號(hào)菌株和33 號(hào)菌株生長(zhǎng)速度較快，但生長(zhǎng)勢(shì)一般。由此可見，不同金針菇菌株在相同溫度下生長(zhǎng)勢(shì)與生長(zhǎng)速度表現(xiàn)不同。在圖2 可知，12 號(hào)金針菇菌株3-Y4 金在不同溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)勢(shì)不同，在20 ℃溫度條件下表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)勢(shì)和較快的生長(zhǎng)速度，說明該菌的最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃。

由表2 可知，35 ℃溫度條件下僅菌株白金針2號(hào)菌絲生長(zhǎng)，其他金針菇菌株在該溫度條件下均不生長(zhǎng)，該菌株在5～35 ℃整體長(zhǎng)勢(shì)較好。金針菇菌株1 號(hào)、46 號(hào)、48 號(hào)、53 號(hào)在任何溫度條件下菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)均較弱。金針菇菌株7 號(hào)、8 號(hào)、27 號(hào)、28號(hào)、60 號(hào)在30 ℃以下生長(zhǎng)勢(shì)較好，說明這些菌株具有較好的生長(zhǎng)能力。金針菇菌株12 號(hào)除了在25 ℃溫度條件下菌絲生長(zhǎng)稀疏外，其他溫度條件下（低于30 ℃） 菌絲均生長(zhǎng)旺盛濃密，表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)能力，可能是由于試驗(yàn)接種過程中選取的打孔位置不同，使菌株在25 ℃溫度條件下生長(zhǎng)勢(shì)較弱。

2.2 金針菇菌株不同溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)速度統(tǒng)計(jì)

64 株金針菇菌株在不同溫度條件下的平均生長(zhǎng)速度統(tǒng)計(jì)見表3、表4。

表3 金針菇菌株在不同溫度條件下的生長(zhǎng)速度Tab.3 Growth rate of Flammulina velutipes strains under different temperature conditions

表4 不同溫度下菌絲生長(zhǎng)速度評(píng)價(jià)Tab.4 Evaluation of mycelial growth rate at different temperatures

由表3、表4 可知，供試菌株菌絲在5～30 ℃均可生長(zhǎng)，35 ℃溫度條件下僅32 號(hào)金針菇菌株生長(zhǎng)。5～30 ℃供試菌株的平均生長(zhǎng)速度隨溫度上升而增高，達(dá)到一定溫度后開始降低，不同菌株的生長(zhǎng)速度最快時(shí)的溫度不同，多為20 ℃和25 ℃。5 ℃時(shí)菌株平均生長(zhǎng)速度為4.16 mm·d-1，4 號(hào)菌株白金生長(zhǎng)速度最高為6.17 mm·d-1，初步篩選為耐低溫菌株。30 ℃時(shí)菌株平均生長(zhǎng)速度為6.43 mm·d-1，耐受性最強(qiáng)的菌株為白金針2 號(hào)（菌株編號(hào)32），其生長(zhǎng)速度最高為15.8 mm·d-1，其次是43 號(hào)菌株J1 和9 號(hào)菌株1-Y4，且白金針2 號(hào)在35 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速度為2.67 mm·d-1，初步篩選其為耐高溫菌株。綜合考慮不同溫度下各菌株的生長(zhǎng)速度，白金針2號(hào)在10～30 ℃生長(zhǎng)速度均較優(yōu)，且35 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度良好，初步篩選為廣溫型菌株。

2.3 金針菇菌株不同生長(zhǎng)溫度條件下生長(zhǎng)速度聚類熱圖分析

熱圖是近年被廣泛應(yīng)用的一種統(tǒng)計(jì)方法，可以簡(jiǎn)單地聚合大量數(shù)據(jù)，將結(jié)果以一種漸進(jìn)的色帶直觀地展現(xiàn)出來，突出顯示數(shù)據(jù)的疏密和頻率的高低程度。將64 個(gè)金針菇菌株在不同溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)速度通過聚類熱圖分析后，其結(jié)果見圖3、表5。

圖3 64 個(gè)金針菇菌株聚類熱圖Fig.3 Cluster heat map of 64 Flammulina velutipes strains

表5 基于聚類熱圖分析金針菇菌株的分類Tab.5 Grouping of Flammulina velutipes strains based on heatmap plot analysis

由圖3、表5 可知，按照不同溫度下菌絲生長(zhǎng)速度可將64 個(gè)金針菇菌株劃分為5 類，第一類（Ⅰ） 包含20 個(gè)菌株，這類菌株在20 ℃和25 ℃生長(zhǎng)速度較快，隨溫度升高生長(zhǎng)速度先升后降。第二類（Ⅱ） 包含1 個(gè)菌株，該菌株為32 號(hào)菌株白金針2 號(hào)，在10～30 ℃生長(zhǎng)速度均較高，說明該菌株具有較好的溫度適應(yīng)能力。第三類（Ⅲ） 包含19 個(gè)菌株，這類菌株隨溫度升高生長(zhǎng)速度先升后降，但在25 ℃生長(zhǎng)速度最快。第四類（Ⅳ） 包含10 個(gè)菌株，這類菌株生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)先升后降又升的趨勢(shì)，在5～20 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度升高，25 ℃溫度條件下生長(zhǎng)速度下降，30 ℃溫度條件下生長(zhǎng)速度又上升，出現(xiàn)此類現(xiàn)象可能與試驗(yàn)誤差有關(guān)。第五類（Ⅴ） 包含14 個(gè)菌株，這類菌株除62 號(hào)菌株，其他菌株均為野生金針菇菌株，此類菌株除在20 ℃和25 ℃條件下生長(zhǎng)速度較快外，其他溫度條件生長(zhǎng)速度均較慢，也可以發(fā)現(xiàn)野生菌株的生長(zhǎng)速度普遍低于栽培菌株的生長(zhǎng)速度，說明野生金針菇菌株只有在適宜的溫度條件下才能較好的生長(zhǎng)，具有較高的溫度選擇性。

3 結(jié)論與討論

食用菌栽培生產(chǎn)過程主要可以分為2 個(gè)階段，即營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段，在形態(tài)上有菌絲體和子實(shí)體之分，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段即為菌絲生長(zhǎng)階段，生殖生長(zhǎng)階段即為子實(shí)體分化階段[7]。

食用菌生長(zhǎng)溫度是其生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子，溫度的高低主要影響食用菌菌絲生長(zhǎng)速度[8]。食用菌菌絲在不同的條件下生長(zhǎng)狀態(tài)有所不同，通常菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)、色澤等菌落形態(tài)特征存在差別，同時(shí)菌絲顯微結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生細(xì)微變化，包括菌絲直徑、菌絲細(xì)胞的分隔情況、菌絲鎖狀聯(lián)合情況、菌絲細(xì)胞內(nèi)液泡、細(xì)胞核情況等[9]。通過對(duì)64 個(gè)金針菇菌株在不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度相關(guān)性不大。通過不同溫度下菌絲生長(zhǎng)速度篩選出的低溫型菌株4號(hào)白金，其菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)較好、菌絲略密，在5 ℃溫度條件下生長(zhǎng)速度最快。篩選出高溫型和廣溫型菌株白金針2 號(hào)的菌絲，其生長(zhǎng)勢(shì)一般，但在10～30 ℃溫度條件下生長(zhǎng)速度最快。因此，在菌株篩選中不能僅從菌絲生長(zhǎng)勢(shì)判斷，還要結(jié)合生長(zhǎng)速度綜合判斷菌株優(yōu)劣。通過對(duì)菌株生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度的綜合評(píng)價(jià)，初步篩選出4 號(hào)低溫型菌株白金，32 號(hào)高溫型和廣溫型菌株白金針2 號(hào)。

在食用菌雜交育種時(shí)，一般選擇菌絲生長(zhǎng)速度較快、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)的菌株作為雜交親本，然而，有些菌絲生長(zhǎng)速度較慢或生長(zhǎng)勢(shì)稍弱的菌株也可能具備其他優(yōu)良生產(chǎn)性狀。因此，科學(xué)地選擇雜交親本仍需要進(jìn)行更加細(xì)致入微的系統(tǒng)研究。

在雜交育種中，雜交親本的選擇對(duì)育種的成敗起著至關(guān)重要的作用。因此要進(jìn)行有效的雜交育種必須了解種間雜交和種內(nèi)雜交菌株的親緣關(guān)系，同時(shí)，要廣泛收集和保存食用菌遺傳資源[10]。聚類熱圖的原理是將個(gè)體樣品或者對(duì)象變量按相似程度距離遠(yuǎn)近劃分類別，使得相似性較強(qiáng)的元素聚為同一類。目的在于使類間元素的同質(zhì)性最大化和類間元素的異質(zhì)性最大化。龐杰等[7]利用35 種食用菌菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體分化溫度的研究結(jié)果，通過聚類分析將29 種食用菌溫度類型劃分為四大類。通過對(duì)64株金針菇菌株不同溫度下的生長(zhǎng)速度進(jìn)行聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類菌株菌絲生長(zhǎng)速度均隨溫度的升高先升后降，Ⅳ類菌株菌絲生長(zhǎng)速度則出現(xiàn)隨溫度的升高先升后降又升的現(xiàn)象，但不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最大值普遍在20 ℃和25 ℃，說明20～25 ℃是金針菇菌株的最佳生長(zhǎng)溫度。白金針2 號(hào)單獨(dú)成為一個(gè)類群，說明與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可作為金針菇育種的雜交親本。利用聚類熱圖對(duì)64 株金針菇菌株進(jìn)行類群劃分，依此鑒定金針菇菌株之間的親緣關(guān)系，該方法可以對(duì)菌株之間的親緣關(guān)系進(jìn)行初步判斷，后續(xù)可以考慮結(jié)合拮抗試驗(yàn)、多種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，為金針菇菌株新品種選育和雜交育種提供依據(jù)。