關(guān)鍵詞：鐵抑制素-1；小鼠肺泡巨噬細(xì)胞；丙酮醛；鐵死亡

糖尿?。―M）是一種以高血糖為主要特征的全身慢性代謝性疾病，其患病率逐年上升，常導(dǎo)致心血管、腎、眼以及肺部感染等多器官的長(zhǎng)期損害。其中糖尿病合并肺炎是糖尿病在呼吸系統(tǒng)的重要并發(fā)癥。糖尿病易感肺炎的機(jī)制復(fù)雜，主要包括以下幾點(diǎn)：高糖微環(huán)境可使宿主的肺泡巨噬細(xì)胞（AM）免疫功能產(chǎn)生缺陷。糖尿病晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）如丙酮醛等顯著增加，并導(dǎo)致肺通氣及彌散功能受損，進(jìn)而易發(fā)感染。我國(guó)糖尿病合并肺炎高發(fā)、機(jī)會(huì)性感染病原體致病增多但檢出率低、重癥肺炎多見且病死率高，導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此對(duì)糖尿病合并肺炎的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探討和挖掘，改善患者預(yù)后是非常迫切的。

丙酮醛（MG）又稱之為甲基乙二醛，其最主要的來源是糖酵解途徑，如糖酵解中間體二羥丙酮磷酸和甘油醛3-磷酸去除磷酸基。MG雖然是機(jī)體正常代謝產(chǎn)物，但在2型糖尿?。═2D）患者體內(nèi)濃度高于正常水平，并有研究證實(shí)高濃度的MG會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增加，線粒體損傷和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致鐵死亡。在細(xì)胞死亡中，鐵死亡是一種新型的細(xì)胞死亡形式，依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵的蓄積和脂質(zhì)過氧化。鐵死亡在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如：糖尿病腎病小鼠中鐵死亡相關(guān)的標(biāo)志物發(fā)生了變化，如脂質(zhì)過氧化物積累的關(guān)鍵標(biāo)志物長(zhǎng)臉?；o酶A合酶4（ACSL4）升高；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子降低。Feng的研究揭示，鐵死亡可能通過缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α/HO-1途徑加重糖尿病小鼠腎小管損傷和纖維化；高糖通過上調(diào)TRIM46（一種含三方基序46蛋白，參與多種類型癌細(xì)胞的增殖，包括肺癌和乳腺癌）、誘導(dǎo)泛素化和加速GPX4（谷胱甘肽過氧化物酶4）清除來誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）的鐵死亡等，說明鐵死亡與高糖有一定相關(guān)性。而針對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞鐵死亡而言，雖然有研究表明MG通過活性氧誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的鐵死亡，但關(guān)于MG通過誘導(dǎo)AM鐵死亡從而影響肺的免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生的研究尚未見報(bào)道。本研究通過MG誘導(dǎo)小鼠來源的肺泡巨噬細(xì)胞（MH-S）發(fā)生鐵死亡，檢測(cè)鐵死亡相關(guān)因子及指標(biāo)，確定糖尿病晚期糖基化終末產(chǎn)物MG與AM發(fā)生鐵死亡的相關(guān)性，同時(shí)驗(yàn)證鐵死亡抑制劑鐵抑制素-1（FER-1）是否有效抑制MG所誘導(dǎo)的AM的鐵死亡，結(jié)果可能成為預(yù)防糖尿病肺部并發(fā)癥新的治療靶點(diǎn)。

1材料和方法

1.1材料

MH-S小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司）；脂質(zhì)氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天）；細(xì)胞亞鐵比色法測(cè)試盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；抗GPX4抗體（Abcam）；抗ACSL4抗體（ABclonal）；鐵抑制素-1（MedChemExpress）；小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1 MH-S細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)MH-S細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組（單獨(dú)用1640培養(yǎng)基處理MH-S細(xì)胞24 h）；MG組（用含90μg/mL MG的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h）；MG+FER-1組（用含90μg/mL MG與10μmol/L FER-1的1640培養(yǎng)基共同培養(yǎng)細(xì)胞24 h）；FER-1組（用含10μmol/L FER-1的1640培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞24h）。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 于60 mm皿中培養(yǎng)MH-S細(xì)胞，密度達(dá)標(biāo)后給予不同處理；用預(yù)冷的PBS充分沖洗、吸干，加入裂解液后置于冰上作用30 min，冰上刮取皿中蛋白，4℃、12000 r/min離心10 min，吸取離心后上清液，用BCA法計(jì)算各組上清液中蛋白的濃度。SDS-PAGE電泳分離各組蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉30 min，加入抗GPX4抗體（1：2000）以及抗ACSL4抗體（1：10 000）；4℃搖床孵育過夜，冷TBST液充分漂洗膜5次，10 min/次；Ⅱ抗（1：10000）于室溫聊孵育1h，TBST充分-彩洗3次，10 min肷，利用發(fā)光試劑ECL顯色，曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4線粒體膜電位檢測(cè) 將MH-S細(xì)胞以40×10⁴接種于6孔板培養(yǎng)，根據(jù)不同分組干預(yù)后，PBS潤(rùn)洗2～3次，每孔加入JC-1（1：200）染色劑覆蓋細(xì)胞，37℃培養(yǎng)20 min，再用PBS潤(rùn)洗3次，熒光顯微鏡拍照，后用圖像分析軟件評(píng)估圖片熒光強(qiáng)度的平均值（平均熒光強(qiáng)度MFI，反映線粒體膜電位的高低）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 MDA試劑盒檢測(cè) 取MH-S細(xì)胞以40×10⁴種于6孔板，設(shè)置對(duì)照組、MG組、MG+FER-1組與FER-1組。根據(jù)MDA檢測(cè)試劑盒說明書步驟，用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，將100μL待測(cè)樣品與200μL檢測(cè)工作液混勻，100℃加熱15 mino將樣品水浴冷卻至室溫，1000r/min離心10 min。取上清200μL于96孔板中，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值A(chǔ)_532nm。

1.2.6細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè) 將MH-S細(xì)胞以40×10⁴接種于6孔板，不同干預(yù)后，PBS潤(rùn)洗3次，每孔加入10μmol/L的DCFH-DA染色液500μL覆蓋細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS沖洗3次，每個(gè)分組的貼壁細(xì)胞于熒光分光光度計(jì)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，應(yīng)用Graph Pad Prism軟件分析每個(gè)A值的熒光強(qiáng)度（488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7亞鐵離子檢測(cè) 按照實(shí)驗(yàn)分組給與不同干預(yù)后，取收集好的MH-S細(xì)胞按約1×10⁶/0.2 mL裂解液置于搖床裂解10 min，15000×g離心10min后收集不同分組標(biāo)本；按照亞鐵離子比色法檢測(cè)試劑盒操作說明，將裂解的樣品與混液A混勻，37℃孵育10 min，冷卻至室溫后加入鐵離子檢測(cè)試劑，常溫孵育30 min，測(cè)定吸光度A_593nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵離子濃度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graph Pad Prism 8.0.1對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較變量之間的差異采用單因素方差分析，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1 MG呈劑量依賴性誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的鐵死亡

應(yīng)用MG誘導(dǎo)建立損傷模型，與對(duì)照組相比，90μg/mL MG作用于MH-S細(xì)胞24h，GPX4下降（Plt;0.001）；而ACSL4的表達(dá)明顯上調(diào)（Plt;0.01，圖1）。

2.2 10μmol/mL鐵死亡抑制劑挽救90μg/mL MG所誘導(dǎo)的鐵死亡

應(yīng)用10μmol/mL鐵死亡抑制劑（FER-1）與MG共同處理小鼠肺泡巨噬細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示FER-1能夠抑制MG對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞GPX4的下調(diào)作用以及ACSL4的上調(diào)作用，與MG組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖2）。

2.3 FER-1抑制MG對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS生成的促進(jìn)作用

MG干預(yù)MH-S細(xì)胞24h，使DCFH-DA染色的貼壁肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯升高，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.0001，圖3）。應(yīng)用10μmol/mL FER-1與MG共同干預(yù)肺泡巨噬細(xì)胞24 h可明顯減少ROS的生成，與MG組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.0001，圖3）。

2.4 MDA檢測(cè)

使用BODIPY 581/591 C11探針直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化水平，結(jié)果顯示MG處理過后引起脂質(zhì)過氧化水平增加。而FER-1與MG共培養(yǎng)處理過后MDA的脂質(zhì)過氧化水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.0001，圖4）。單獨(dú)FER-1處理MH-S細(xì)胞24h對(duì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的基礎(chǔ)水平無明顯影響（Pgt;0.05）。

2.5 FER-1對(duì)抗MG誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞線粒體損傷

MG干預(yù)MH-S細(xì)胞24h，肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的MFI值（反映MMP水平）降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.0001）。應(yīng)用10μmol/mL FER-1與MG共同處理肺泡巨噬細(xì)胞24 h可減少M(fèi)MP的丟失，使MFI升高，與MG組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001，圖5）。單獨(dú)FER-1處理肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)MMP無明顯影響。

2.6 FER-1抑制MG誘導(dǎo)的鐵離子增多

與對(duì)照相比，MG處理小鼠肺泡巨噬細(xì)胞24 h鐵離子增多（Plt;0.001）；在MG作用的同時(shí)，加用10μmol/mLFER-1處理肺泡巨噬細(xì)胞24h，亞鐵離子減少，與MG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001，圖6）。

3討論

MG通過AEG/RAGE誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞發(fā)生凋亡，并具有濃度依賴性，但MH-S細(xì)胞凋亡率在濃度為0.8mmol/L時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)1.6 mmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。對(duì)這一結(jié)果最接近的解釋是，高濃度的MG會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞嚴(yán)重壞死。細(xì)胞凋亡是一種非溶解性的，且在免疫反應(yīng)上相對(duì)沉默的細(xì)胞死亡方式，而鐵死亡是一種是溶解性的，且促炎的細(xì)胞死亡方式。在鐵死亡中，細(xì)胞抗氧化能力降低，致使脂質(zhì)過氧化與代謝功能障礙，脂質(zhì)活性氧（ROS）增多。GPX4和ACSLA蛋白被認(rèn)為是鐵死亡的關(guān)鍵標(biāo)志物，其中，GPX4蛋白在鐵死亡過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，其功能是將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇，從而抑制脂質(zhì)過氧化，因此GPX4也被看作是抵抗鐵死亡的重要蛋白。不飽和脂肪酸（PUFA）是脂質(zhì)過氧化的主要靶標(biāo)之一，但是將PUFA摻人磷脂中需要ACSL4，所以ACSIA在鐵死亡中起到了促進(jìn)作用。本研究通過不同濃度的MG處理MH-S，檢測(cè)細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平；結(jié)果MG濃度為90μg/mL的條件下，GPX4蛋白水平下降；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞ACSL4的水平升高，表明在MH-S細(xì)胞中，MG是影響鐵死亡的關(guān)鍵蛋白。

FER-1是一種通過小分子文庫(kù)高通量篩選分離的合成化合物，通過抑制脂質(zhì)過氧化來抵抗鐵死亡的發(fā)生，或通過清除起始烷氧基自由基和其他重排產(chǎn)物來抑制鐵死亡的發(fā)生。為了明確FER-1是否對(duì)MG誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞的GPX4和ACSL4蛋白水平產(chǎn)生影響，本研究發(fā)現(xiàn)在FER-1 10μmol/mL的濃度下，GPX4蛋白水平回升，ACSL4蛋白水平降低；同時(shí)還檢測(cè)了不同組細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化物水平，其中MG組脂質(zhì)過氧化物水平升高，而在MG+FER-1處理組脂質(zhì)過氧化物水平降低。過往的研究表明，MG可以修飾賴氨酸和精氨酸等游離氨基以產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），它與免疫球蛋白超家族的跨膜受體RAGE相互作用，啟動(dòng)對(duì)組織損傷和炎癥的免疫反應(yīng)，RAGE也能激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和ROS。本研究通過檢測(cè)細(xì)胞活性氧含量發(fā)現(xiàn)，MG組中細(xì)胞活性氧的含量顯著上升，而在使用FER-1處理后，其含量顯著下降。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源，其產(chǎn)生的ROS通過促進(jìn)脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致鐵死亡Lin等發(fā)現(xiàn)，線粒體融合過程中ROS和脂肪酸供應(yīng)的增加會(huì)促進(jìn)鐵死亡，所以線粒體的穩(wěn)定性在維持細(xì)胞內(nèi)活性氧水平發(fā)揮著重要作用，而線粒體膜電位檢測(cè)是評(píng)估線粒體穩(wěn)定性可靠指標(biāo)。本研究通過熒光強(qiáng)度檢測(cè)線粒體的膜電位，結(jié)果顯示，MG誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞中線粒體膜電位失衡，而在使用FER-1處理后，膜電位恢復(fù)到對(duì)照組水平。PUFA脂質(zhì)的過氧化是由促進(jìn)芬頓反應(yīng)的不穩(wěn)定鐵池驅(qū)動(dòng)的，所以亞鐵離子水平也是判斷鐵死亡的重要標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過比色法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子的水平，在MG組，亞鐵離子含量增加，而FER-1處理后亞鐵離子水平降低。

總之，我們通過鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)證實(shí)，MG作為獨(dú)立因素可以誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生?？赡艿臋C(jī)制是高濃度的MG通過AGE/RAGE通路激活MH-S細(xì)胞內(nèi)炎癥和活性氧相關(guān)通路，導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧增加、GPX4蛋白消耗、亞鐵離子水平增加，ACSL4上調(diào)，從而使得更多的胞膜磷脂過氧化，最終胞內(nèi)高濃度的脂質(zhì)過氧化物促使MH-S細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生，這一結(jié)果很可能是糖尿病合并肺炎的主要原因之一，而上述過程可以被FER-1所挽救。