張夢丹，周文華，龔佳格，李鵬，高潔，李建國

（1.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619；2.中國輻射防護研究院/藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室/中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點實驗室，山西 太原 030006）

鈾（uranium，U）存在于巖石、土壤及水、食物和空氣中，是天然存在的重要放射性錒系元素。近年來，大量天然鈾經提煉濃縮成富集鈾作為核工業(yè)中的重要核燃料，也被用于紡織業(yè)和制造業(yè)等其他領域［1］。自然界中，鈾有+3，+4，+5 和+6 共4 種價態(tài)，其中難溶性的四價態(tài)和易溶性的六價態(tài)化合物較為穩(wěn)定［2］。鈾主要通過皮膚接觸、呼吸和飲食等途徑進入人體［3］。鈾會迅速轉移到血液中，以UO22+的形式與血液中的檸檬酸鹽、碳酸氫鹽和蛋白質形成絡合物［4-5］，經過血液循環(huán)通過腎小球過濾，結合在近端小管上皮部位導致近端小管損傷和腎功能衰竭［6-7］。隨著時間延長，鈾會大量附著于骨，影響骨的正常代謝和功能［8］。目前螯合療法被認為是減少鈾等錒系元素內污染的最有效的方法之一，而臨床除1.4%碳酸氫鈉可用外，僅有美國FDA 批準的二乙胺五乙酸鹽用于鈾促排，但其與鈾酰的螯合物存在體內不穩(wěn)定及無法進入細胞等問題，促排效果均不理想［3，9］。因此，尋找高效、低毒的鈾促排劑一直是研究者努力的目標。由中國輻射防護研究院自主設計合成的鄰苯二酚類促排劑N1，N2-雙（2，3-二羥基-4，6-二磺酸芐基）亞乙基二胺鈉鹽〔N1，N2-bis（2，3-dihydroxy-4，6-disulfonic acid benzyl）ethylenediamine sodium salt，NBED〕對钚、銅和鉛等具有較好的促排效果［10］。前期研究表明，ICR 小鼠ig 給予NBED能顯著降低腎和骨內鈾含量［11］。本研究將從動物水平進一步研究iv給予NBED對鈾的促排效果，并從熱力學水平探討NBED促排鈾的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

NBED 由中國輻射防護研究院合成，相對分子質量為712.52，為黃色粉末，相對純度為95%（用蒸餾水稀釋）；二乙烯三胺五乙酸鈣鈉鹽（DTPACaNa3，批號：20190-605）由軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所贈送；醋酸鈾?！睠4H6O6U（H2O）2，批號：U3873101B〕（用蒸餾水稀釋），上海吉至生化科技有限公司；硝酸（優(yōu)級純，批號：20200911），國藥集團化學試劑有限公司；H2O2（分析純，批號：20200531），天津歐博凱化工有限公司；KCl（分析純，批號：20180502）和KOH（分析純，批號：20170327），天津市風船化學試劑科技有限公司；HCl（分析純，批號：100620200602），湖南爾康制藥股份有限公司；超純水，Milli-Q超純水處理系統制備。

Milli-Q型超純水處理系統，美國Millipore公司；ZDJ-5B 型全自動電位滴定儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；NexION-5000型電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀，英國Perkin Elmer 公司；BSA124S 電子天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司。

1.2 動物、分組和給藥

48 只SPF 級ICR 雄性小鼠，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，質量合格證號：110011210106756516，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于中國輻射防護研究院藥物安全評價中心SPF 級動物房內，小鼠自由攝食、飲水。本實驗所用動物及相關處置符合動物福利的要求，且在實驗開展前通過中國輻射防護研究院實驗動物管理和使用倫理委員會批準。

據隨機數字表將小鼠隨機分為6 組：正常對照組、鈾染毒組、鈾染毒+DTPA-CaNa3150 mg·kg-1組（劑量與臨床劑量相當，配體/鈾摩爾比158∶1）、鈾染毒+NBED 45，90和180 mg·kg-1組（配體/鈾摩爾比分別為26∶1，52∶1 和104∶1）。所有小鼠均于實驗前適應性喂養(yǎng)7 d。禁食過夜后，于第8 天開始實驗。除正常對照組外，其余各組每只小鼠尾靜脈iv 給予醋酸鈾?！蚕喈斢赨（Ⅵ）0.03 mg〕［11］，隨后立即尾靜脈iv給予相應藥物；正常對照組iv給予生理鹽水。給藥2 h后，小鼠可攝食、飲水。

1.3 lCP-MS測定小鼠組織中鈾含量

給藥24 h 后，脫臼處死小鼠，取兩腎、股骨、脾、肝和股骨外側肌肉，于80 ℃恒溫干燥至恒重；研磨均勻后，分別取0.02 g于燒杯中（因肝、脾和肌肉中鈾蓄積量較少，將三者合并為一組樣本處理），加入硝酸5 mL，于電加熱板150 ℃下消解至澄清；加入1 mL H2O2繼續(xù)消解至無色透明。當溶液剩0.5～1.0 mL時停止加熱，經稀硝酸0.5 mol·L-1稀釋后，采用ICP-MS法［1］測定腎、股骨和肝+脾+肌肉中的鈾含量（以每克干組織計）。ICP測定條件為：射頻入射功率為1600 W，霧化氣流速為1.03 L·min-1，輔助氣流速為1.3 L·min-1，等離子氣流速為16.25 L·min-1，溶液穩(wěn)定時間為50 s。每種樣品平行測定3次。

1.4 電位滴定法測定不同pH 條件下NBED 的解離常數

取71.2 mg NBED（0.1 mmol）加入電位滴定儀樣品池中，用移液管取0.1 mol·L-1KCl 溶液25 mL加入樣品池中并不斷攪拌，待NBED 溶解后滴加0.1 mol·L-1HCl 溶液2 mL。利用動態(tài)滴定模式滴定，即根據所測電動勢的變化決定加入KOH溶液的體積，共滴加4 mL KOH 溶液后停止實驗。得到1 組滴加體積與相應電動勢的數據，用Hyperquad 2013 軟件擬合得到累積形成常數lgβ0lh［12］值，并根據式①～⑤計算得到NBED 的解離常數pKas［12］。實驗平行進行3次，取平均值。

式中，n為NBED 數，S為配體NBED（表示為L）結合的H+數，K為平衡常數，β為累積形成常數。

1.5 電位滴定法測定NBED與鈾酰的絡合常數

取14.24 mg NBED（20 μmol·L-1）和4.24 mg醋酸鈾酰（10 μmol·L-1）加入樣品池中，用移液管取25 mL 0.1 mol·L-1KCl 加入樣品池中攪拌至溶解后，手動控制加入2 mL 0.1 mol·L-1HCl 溶液。后續(xù)同1.4 處理，根據式⑥～⑦計算得到NBED 與鈾酰的絡合常數［12］。實驗平行進行3 次，取平均值。然后，基于計算結果利用Hyss 軟件得到不同pH 條件下UO22+配體不同絡合形式的分布曲線圖。

式中，m，l和n分別為溶液中UO22+，NBED和H+比率。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 NBED降低鈾染毒小鼠組織中鈾含量

表1 結果表明，與鈾染毒組相比，DTPA-CaNa3（150 mg·kg-1）及各劑量NBED均可顯著降低腎內鈾含量（P＜0.01），且NBED 180 mg·kg-1效果最佳；DTPA-CaNa3150 mg·kg-1（P＜0.05）和NBED 90，180 mg·kg-1（P＜0.01）顯著降低骨鈾含量，NBED 45 mg·kg-1無明顯作用；DTPA-CaNa3和NBED 180 mg·kg-1顯著降低肝+脾+肌肉內鈾含量（P＜0.01），其余劑量NBED 無明顯作用；與陽性對照相比，鈾染毒+NBED 180 mg·kg-1組腎、骨、肝+脾+肌肉鈾含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Efficacy of uranium removal from mice by N1，N2-bis（2，3-dihydroxy-4，6-disulfonic acid benzyl）ethylenediamine sodium salt（NBED）

2.2 不同pH條件下NBED的解離常數

NBED 的解離常數pKas，pKa1，pKa2，pKa3，pKa4，pKa5和pKa6分別為10.09，9.68，9.70，8.21，7.26 和4.84。表明NBED 在pH 10.09 時達到解離平衡；在低pH 條件下會被質子化，pH 4.84 時達到質子化平衡。由圖1 可知，在生理pH 條件下（pH 7.4），約有22.3% LH5（L 表示配體NBED），59.8% LH4和17.85% LH3存在于0.1 mol·L-1KCl 溶液中，LH4為主要存在形式。表明在生理環(huán)境下，NBED 主要進行二級解離。

Fig.1 Species distribution of NBED at different pH determined by potentiometric titration.The solution contains 1×10-3 mol·L-1 NBED.L：deprotonated NBED ligand.

2.3 NBED與鈾酰的絡合常數

由圖2 可知，在pH 為3～11 范圍內，NBED 與鈾酰絡合物存在4 種形式，分別是logβ111（12.5）和logβ101（9.8），logβ102（15.3），logβ1-12（6.5）。在pH 7.4時，該體系下溶液中游離鈾酰離子濃度為2.693×10-10mol·L-1，pUO2為9.57；大約有75.3%（UO2）L22-，21.7%（UO2）L 和2.956%（UO2）L2H-13-存在于0.1 mol·L-1KCl溶液中。表明NBED對鈾酰具有較強的親和力，且在人體生理環(huán)境下主要以2∶1的形式形成（UO2）L22-復合物，并排出體外。

Fig.2 Species distribution of UO22+/NBED systems at different pH determined by potentiometric titration.The solution contains 1×10-4 mol·L-1 UO22+and 1×10-3 mol·L-1 NBED.

3 討論

本研究結果表明，NBED可顯著降低腎、骨、肝、脾和肌肉內鈾蓄積量，且優(yōu)于DTPA-CaNa3。以NBED 口服劑量300 mg·kg-1折算得靜脈給藥劑量為180 mg·kg-1，該劑量NBED 能分別減少腎、骨、肝+脾+肌肉中66.5%，54.8%，38.2%的鈾蓄積量，促排效果優(yōu)于口服給藥，ICR 小鼠ig 給予NBED 300 mg·kg-1可使腎和骨內鈾含量分別降低44.3%和18.8%［11］。DTPA-CaNa3臨床折算劑量為150 mg·kg-1，其促排效果與NBED 90 mg·kg-1相當。連有磺酸基的鄰苯二酚類促排劑（CAMS）被認為是對骨鈾促排最有效的配體［13］。Durbin 等［13］篩選出的對鈾有較好促排效果的CAMS 類促排劑5-LICAM（S），當配體/鈾摩爾比為91∶1 時，立即ip給藥，24 h可顯著降低腎鈾62%、骨鈾49%。HOPO類配體是目前報道的促排鈾效果最強的一類化合物，其中5-LI-1-Cm-3，2-HOPO（配體/鈾摩爾比92∶1）立即ip 給藥后，24h 可顯著降低腎鈾82.7%、骨鈾39.0%［13］。表明NBED是較佳的骨鈾促排劑。

鈾的電子層構型是［Rn］5f36d17s2，因5f 和6d雜化軌道的影響，U與O形成雙鍵，使其具有較強的惰性［14］。因此，螯合劑只能從空間位阻最小的赤道平面提供電子進入5f 和6d 的空軌道進行配位［15］。UO22+可以與O，N，S，I 等多種原子配位，但本質上屬于硬酸，更容易與O 配位，如羧基、羥基、磷酸基等［16］。本研究所自主設計合成的NBED 是由線性氨基烷鏈連接2 個鄰苯二酚結構單元組成，空間結構上提供的H和O原子可使NBED更好的與U（Ⅵ）配位。熱力學水平研究NBED的解離常數和NBED與鈾酰的絡合常數發(fā)現，在生理條件下，NBED主要以LH5，LH4和LH3形式存在，其比例分別為22.3%，59.8%和17.85%，主要以失去2 個氫的LH4形式存在；在生理條件下，NBED 與鈾主要有3 種絡合形式，分別為75.3%（UO2）L22-，21.7%（UO2）L 和2.956%（UO2）L2H-13-，NBED 與鈾酰主要以2∶1 螯合存在。即在生理條件下，2 個NBED 分子鄰苯二酚上的酚羥基共失去4個氫原子，從而產生4個O原子占據鈾酰的5f和6 d的空軌道進行配位。

綜上所述，新型促排劑NBED 在體內主要以失去2 個氫的LH4 形式存在，與鈾酰主要以2∶1 的螯合形式形成NBED-鈾酰復合物排出體外，且NBED靜脈給藥能顯著降低腎、骨、肝、脾和肌肉內鈾含量，促排效果優(yōu)于DTPA-CaNa3，與目前正在研究的其他促排藥相比，對骨鈾的促排效果更顯著。由此可見，NBED是一種有前景的新型促排劑，對鈾具有較好的促排效果。后續(xù)可基于其對骨較好的促排效果進行進一步機制和結構優(yōu)化研究。