徐曉艷，王宇，姜美婷，張悅，王洪達(dá)，田曉軒，楊文志

天津中醫(yī)藥大學(xué) 組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617

中藥在全球范圍內(nèi)被越來越多的國家所認(rèn)可，這同時(shí)也對中藥質(zhì)量提出了更高的要求。植物藥作為中藥來源的主體，其顯著特征是同緣或其他近緣品種往往含有相似的化學(xué)組成，這導(dǎo)致了中藥替代使用、非法添加等問題的出現(xiàn)，對臨床安全帶來一定隱患[1]。多基原中藥的精準(zhǔn)鑒別（如同屬或近緣品種中藥的品種區(qū)分、或同一植物的不同部位的區(qū)分、產(chǎn)地區(qū)分、生長年限區(qū)分、炮制品的區(qū)分、栽培采收存儲方法差異比較等）一直以來都是中藥分析的難點(diǎn)，特別是在復(fù)雜體系中藥配方中，由于不同品種間化學(xué)組成的高度相似性，鑒別非法摻偽非常困難[2]。多組學(xué)可以描述整個(gè)遺傳和代謝組信息，越來越多的研究者采用代謝組學(xué)等技術(shù)開展中藥的精準(zhǔn)鑒別。此外，隨著生物技術(shù)和科學(xué)手段的不斷進(jìn)步，分子鑒定因其能夠在基因?qū)用嫔蠝?zhǔn)確判斷植物的真?zhèn)味玫搅藦V泛的應(yīng)用。

1 人參屬中藥概述

五加科人參屬藥用植物因其顯著的補(bǔ)益作用而受到廣泛關(guān)注，是全球廣受歡迎的中草藥或滋補(bǔ)品，已有數(shù)千年的藥用歷史。目前，除作為臨床制劑被廣泛使用外，其還是多種保健產(chǎn)品、功能性食品和化妝品的重要原料[2]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版共收錄了7 種人參屬來源的中藥：人參Panax ginsengC.A.Meyer、紅參、西洋參P.quinquefoliusL.、三七P.notoginseng（Burk.）F.H.Chen、人參葉、竹節(jié)參P.japonicusC.A.Meyer、珠子參P.japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng。此外，人參花、三七莖葉、三七花、西洋參莖葉、西洋參花等不同部位樣品雖未被《中國藥典》2020 年版收錄，但同樣具有廣泛的藥理作用，在臨床上具備潛在的藥用價(jià)值[3]。然而，由于價(jià)格高且需求量大，人參屬產(chǎn)品的摻假現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。人參皂苷是其最常見的生物活性成分，結(jié)構(gòu)的高度相似性使得人參同屬不同品種或不同部位（根/根莖、葉、花等）的區(qū)分，特別是提取物或用于中成藥的人參提取物的鑒別非常困難。建立快速、有效、準(zhǔn)確的鑒別方法對中藥材及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制至關(guān)重要。

2 中藥鑒別常用方法

中藥化學(xué)成分復(fù)雜且不同化學(xué)成分在含量、極性、相對分子質(zhì)量方面差異明顯，這給多來源中藥的品種鑒別和質(zhì)量控制帶來重大挑戰(zhàn)。從中藥材、飲片、提取物到成方制劑，系統(tǒng)愈發(fā)復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒別、保證中藥質(zhì)量就愈發(fā)困難。當(dāng)前，用于中藥材品種鑒定及真?zhèn)窝芯康姆椒òㄐ誀睢@微、光譜、色譜及分子鑒定等[4]。傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)一般是通過觀察中藥材的形態(tài)特征和感官特征對其進(jìn)行鑒定，是經(jīng)過實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)積累而形成的鑒定手段。光譜鑒定主要是以中藥材中不同成分的特殊吸收峰為判斷依據(jù)，應(yīng)用紅外、熒光、紫外等方法檢測其光譜特征，從而確定藥材真?zhèn)蔚囊环N鑒別方法。色譜法以其高效快速、選擇性好、靈敏度高的特點(diǎn)，已成為鑒別藥材品種和真?zhèn)蔚闹匾侄?。此外，色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用分析技術(shù)在中藥的分析評價(jià)中發(fā)展迅速，已應(yīng)用于各種中藥的化學(xué)成分分析、產(chǎn)地鑒定及品種鑒定[4]。分子鑒定技術(shù)是指通過直接分析遺傳物質(zhì)DNA 的多態(tài)性來推斷遺傳變異，從而實(shí)現(xiàn)物種鑒定的方法[5]。近年來，分子鑒定技術(shù)正逐漸成為中藥材的主要鑒定手段，并逐步擴(kuò)展至中藥正品與偽品鑒別、遺傳多樣性鑒別、中藥產(chǎn)地鑒別和中藥年限鑒別等[6]。多組學(xué)技術(shù)與分子鑒定相結(jié)合，優(yōu)勢互補(bǔ)（圖1），在中藥精準(zhǔn)鑒別方面具有良好的發(fā)展前景。

圖1 基于多組學(xué)差異表征與分子鑒定技術(shù)的中藥精準(zhǔn)鑒別研究策略

3 基于多組學(xué)差異表征的精準(zhǔn)鑒別技術(shù)

組學(xué)技術(shù)能夠獲得一個(gè)生命體、組織或器官、單細(xì)胞的全部DNA 序列信息、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)及代謝產(chǎn)物信息，是一門新興并具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)，具有高靈敏度、高通量的優(yōu)勢[7]。當(dāng)前應(yīng)用于中藥的多組學(xué)技術(shù)主要包括代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、多肽組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等，表1 匯總了部分基于組學(xué)技術(shù)的人參屬中藥鑒別信息。組學(xué)技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠查看由于某些擾動而導(dǎo)致的系統(tǒng)全局變化，將樣本當(dāng)作一個(gè)大的系統(tǒng)，通過對樣本進(jìn)行提取、研究和分析，可以全面化地獲得樣本差異[7]，可以作為實(shí)現(xiàn)整體評價(jià)的有力工具，不同于傳統(tǒng)的單個(gè)指標(biāo)和多指標(biāo)評價(jià)模式，這更符合中藥多組分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的整體作用特點(diǎn)。

表1 基于組學(xué)差異分析技術(shù)的人參屬中藥鑒別特征匯總

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是對生命周期中特定時(shí)刻病理或生理狀態(tài)下的細(xì)胞、組織、器官或有機(jī)體中存在的蛋白質(zhì)的表達(dá)情況進(jìn)行的系統(tǒng)研究。將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域，研究對象為中藥材時(shí)，可以繪制不同產(chǎn)地及其不同藥用部位的中藥蛋白質(zhì)表達(dá)譜，研究蛋白質(zhì)組成的差異。現(xiàn)階段蛋白質(zhì)組學(xué)在研究中主要的技術(shù)手段有凝膠電泳、色譜分離、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管色譜、質(zhì)譜、微流控芯片、X射線晶體、蛋白質(zhì)芯片、核磁共振法（NMR）成像等[27]。Sun 等[8]進(jìn)行了基于蛋白質(zhì)組學(xué)的野生人參與栽培人參氨基酸代謝差異研究，發(fā)現(xiàn)野生人參中14種氨基酸含量高于栽培人參，與氨基酸代謝相關(guān)的酶及其衍生物在野生人參中有較高的積累。與硫類氨基酸合成相關(guān)的蛋白質(zhì)，如甲硫氨酸合成酶，在野生人參中的積累也較高。此外，野生人參中糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)的酶及其中間產(chǎn)物含量高于栽培人參。研究結(jié)果從氨基酸水平揭示了野生人參與栽培人參蛋白組的差異，為進(jìn)一步研究野生人參的藥用功能提供了參考。

3.2 多肽組學(xué)

多肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的延伸，主要從結(jié)構(gòu)和功能等多方面系統(tǒng)探究生物體中內(nèi)源性多肽的組成及特性。部分植物肽被認(rèn)為是可能的藥物先導(dǎo)或有潛力作為植物生物學(xué)研究、系統(tǒng)發(fā)育或物種鑒定的生物標(biāo)志物[9]。植物藥肽類樣品的制備多采用溶劑超聲提取，利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（UPLC-HRMS）和肽組學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)肽序列的鑒定與差異分析。趙楠等[10]采用基于UPLC-HRMS 的多肽組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)研究了人參主根、支根、須根和蘆頭4 個(gè)部位的多肽組成。不同部位的多肽組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多肽的種類及含量在主根與其他部位間差異最為顯著，篩選出25 個(gè)在人參不同部位穩(wěn)定表達(dá)的多肽標(biāo)志物，揭示了人參多肽結(jié)構(gòu)多樣性，提供了除人參皂苷外的化學(xué)基礎(chǔ)研究新思路。通過UPLC-HRMS 和多肽組學(xué)技術(shù)對山地栽培人參的新型多肽生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，共鑒定52 種高可信度的多肽，并篩選出20 種山地栽培人參與栽培人參差異表達(dá)的特征多肽[28]。結(jié)果表明，除了人參皂苷外，多肽也可作為人參屬中藥品種鑒定和質(zhì)量控制的潛在生物標(biāo)志物。

3.3 脂質(zhì)組學(xué)

脂質(zhì)研究在人參屬中藥質(zhì)量控制中受到關(guān)注，脂質(zhì)組分析能夠?yàn)橹兴幍馁|(zhì)量差異提供依據(jù)。盡管在脂類組學(xué)中已經(jīng)報(bào)道了各種分析技術(shù)，但液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）因具有較高的靈敏度和適用性，目前仍是最受歡迎的方法?；诩{升電噴霧離子化質(zhì)譜法（NanoESI-MS）的脂質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行人參屬中藥脂類物質(zhì)分析，共鑒定出30 種化合物，其中三酰甘油、磷脂酰甘油、單半乳糖二酰甘油等為區(qū)分不同品種、栽培年限和生長部位的生物標(biāo)志物[11]。Shi 等[12]基于超高效合相色譜/離子淌度-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPC2/IMQTOF-MS）非靶標(biāo)脂質(zhì)組學(xué)差異分析技術(shù)對3 種人參屬中藥的脂質(zhì)組進(jìn)行了綜合分析和比較，對60 批人參、西洋參、三七樣品進(jìn)行模式識別化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，最終揭示了24種脂質(zhì)差異成分，其中以三酰甘油類最為重要，構(gòu)建的平臺可顯著提高脂質(zhì)組學(xué)研究中脂類的色譜分離和鑒定可靠性。

3.4 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是對一個(gè)生物系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究的分析技術(shù)，通常采用高效液相色譜法（HPLC）、NMR、LC-MS和氣相色譜（GC）-MS等，對生物系統(tǒng)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析[29]。代謝組學(xué)技術(shù)分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，兩者的區(qū)別在于前者有目的地監(jiān)督目標(biāo)代謝物，后者為全范圍監(jiān)測代謝物，通常用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。靶向代謝組學(xué)著重對設(shè)定好的目標(biāo)代謝物進(jìn)行定性、定量檢測分析和研究，具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢，如常用的多重反應(yīng)離子監(jiān)測模式。非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)能夠獲取中藥整體化學(xué)成分信息，在同等水平上發(fā)掘不同組別之間的差異成分，是目前具有相似化學(xué)組成中藥材鑒別區(qū)分的利器[30]，已被廣泛應(yīng)用于人參屬中藥的鑒別，顯示出整體性的優(yōu)勢。

基于LC-MS 的代謝組學(xué)作為一種強(qiáng)大的高通量技術(shù)，在區(qū)分人參屬中藥不同品種方面具有潛力[13-15]。李樂樂[7]通過非靶向代謝組學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了對不同品種人參莖葉樣品的區(qū)分，并發(fā)現(xiàn)了包括越南人參皂苷R3、人參皂苷F3和人參皂苷F5等鑒別標(biāo)志物。此外，同時(shí)使用了反相液相色譜（RPLC）-MS和親水作用色譜（HILIC）-LC-MS 篩選分析標(biāo)志物，從皂苷、氨基酸和寡糖3 種類型化合物層面上區(qū)分人參和西洋參，為人參等中藥材的鑒別提供了新的依據(jù)?；陔p中性丟失過濾-母離子列表改進(jìn)數(shù)據(jù)依賴性采集模式掃描技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合對中藥人參、西洋參、三七中丙二酸酰化皂苷進(jìn)行系統(tǒng)表征并發(fā)掘鑒別標(biāo)志物，通過多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)潛在的標(biāo)志物可區(qū)分人參、西洋參與三七，其中最重要的是3個(gè)丙二酰人參皂苷m-Rb1、丙二酰人參皂苷m-Rd、丙二酰人參皂苷m-Rc[16]?；贚C-MS 的代謝組學(xué)分析，揭示了人參皂苷Rf、人參皂苷F3和竹節(jié)參Ⅳ是區(qū)分竹節(jié)參、珠子參和姜狀三七的重要鑒別標(biāo)志物[13]。此外，將傅里葉變換紅外光譜分析與多元分析相結(jié)合，能夠發(fā)現(xiàn)不同栽培年限或栽培品種人參葉的代謝差異，此外還發(fā)現(xiàn)傅里葉變換紅外光譜中多糖區(qū)和酰胺區(qū)的定量、定性修飾有可能成為關(guān)鍵代謝標(biāo)志物[17]。

多水平多糖表征能夠?yàn)槿藚ⅰ⑽餮髤?、三七的區(qū)分提供有益的信息[31]。本課題組基于分級表征策略，從多糖、部分酸水解寡糖與完全水解單糖3 個(gè)水平首次揭示源自人參屬6 種根類中藥（人參、紅參、西洋參、三七、竹節(jié)參、珠子參）所含多糖組分的化學(xué)組成，提出一種“排阻范圍反向精細(xì)表征策略”，實(shí)現(xiàn)多糖指紋譜的整體表征，利用離子淌度LC-MS 非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)，探究寡糖組的細(xì)微差別[18]。

揮發(fā)油也是中藥中一類重要的活性成分，在不同人參屬中藥中表現(xiàn)出差異[32]?；诜前邢虼x組學(xué)差異分析技術(shù)，通過對90 批人參屬來源不同中藥樣品進(jìn)行分析，揭示了236種差異離子，發(fā)現(xiàn)了36種差異揮發(fā)性成分，這有助于不同品種的鑒別區(qū)分[33]。Zhang 等[19]采用GC-MS 和多元統(tǒng)計(jì)分析對人參、三七、西洋參的脂肪酸進(jìn)行了表征和比較，結(jié)果表明肉豆松酸、十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸、二十二烯酸11種脂肪酸在3種中藥中含量差異明顯，表明每種植物脂肪酸類型不同。根據(jù)脂肪酸的絕對含量和相對含量進(jìn)行主成分分析和層次聚類分析，用于品種區(qū)分，有助于確保其安全性和有效性。

除了不同的品種外，對人參屬中藥同一品種的不同部位或不同品種的相同部位也進(jìn)行了鑒別比較。通過UPLC/四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（Q-TOFMSE）對全株人參5個(gè)不同部位進(jìn)行了代謝組比較研究，發(fā)現(xiàn)了能夠區(qū)分根、莖/葉、花、漿果和種子的人參皂苷Re、人參皂苷Rc、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rf、人參皂苷F1、人參皂苷Ro、人參皂苷Ra1、人參皂苷Rg1、越南人參皂苷Vina-R4等11個(gè)標(biāo)志物，并通過“同株樣品-市售樣品”標(biāo)志物交叉驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)耐用標(biāo)志物（固有差異、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定），以耐用標(biāo)志物為變量構(gòu)建基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)辨別模型，實(shí)現(xiàn)了人參不同部位之間及人參根摻假品的鑒別[20]。用于區(qū)分西洋參根、葉和花的主要皂苷涉及20 種，其中丙二酰人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Ro、丙二酰人參皂苷Rb2和丙二酰人參皂苷Rb1異構(gòu)體最為重要[21]。一種基于UPLC/離子淌度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（IM-QTOF-MS）的非靶向代謝組學(xué)方法揭示了區(qū)分人參花、三七花和西洋參花的6 種鑒別標(biāo)志物，人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra1/人參皂苷Ra2的異構(gòu)體和Ra3的異構(gòu)體可作為三七花的特異性標(biāo)志物，所得結(jié)果有助于準(zhǔn)確區(qū)分3 種人參屬植物的花蕾[22]。

基于HPLC、NMR 的代謝組學(xué)技術(shù)在區(qū)分人參屬中藥不同產(chǎn)地及炮制品中也有應(yīng)用，建立的UPLC-Q-TOF-MS 和UPLC-MS/MS 化學(xué)圖譜與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，用于人參皂苷及其白參、黑參和紅參氨基酸的快速、靈敏的成分分析，有助于快速區(qū)分和鑒別含有相似化學(xué)成分的復(fù)雜中藥[23]。此外，NMR 代謝組學(xué)可以同時(shí)區(qū)分不同品種的人參和不同產(chǎn)地栽培的同一品種的多個(gè)樣品[34-35]。應(yīng)用基于NMR 的代謝物組學(xué)分析方法有效地區(qū)分了來自韓國和中國的人參。發(fā)現(xiàn)7 種潛在鑒別標(biāo)志物，其中戊二酸、琥珀酸、蘋果酸、膽堿、葡萄糖和蔗糖在韓國人參樣品中高表達(dá)，而谷氨酰胺在中國人參樣品中含量豐富。因此，基于NMR的代謝組學(xué)方法適用于不同產(chǎn)地人參樣品的鑒別[24]。此外，區(qū)域切除NMR 氫譜和多步主成分分析相結(jié)合的方法也被用于探究野生、栽培西洋參和亞洲人參代謝物差異，證實(shí)了該技術(shù)在不同品種人參樣品鑒別分析中的有效性[25]。

4 人參屬植物分子鑒定技術(shù)

傳統(tǒng)鑒定方法的理論基礎(chǔ)建立于分類群的性狀特征分析，這些性狀特征與環(huán)境緊密相關(guān)。從分子遺傳學(xué)角度來看，物種性狀特征的差異可追溯到基因型的差異，即在DNA 水平上的差異。因此，對基因組序列差異的比較研究無疑為植物的分類和鑒定提供了合理的方法。隨著生命科學(xué)不斷取得突破，分子生物學(xué)物種鑒定方法應(yīng)運(yùn)而生，此類方法應(yīng)用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，在中藥原植物及其藥材和飲片的鑒定中取得快速發(fā)展。眾多新興的分子技術(shù)為鑒別人參屬中藥提供了便利條件（各類分子鑒定技術(shù)的信息見表2），以下主要從基于DNA序列分析的序列分子鑒定技術(shù)和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的DNA指紋鑒定方法兩方面進(jìn)行綜述。

表2 常用分子鑒定技術(shù)特點(diǎn)及用途

4.1 基于DNA序列分析的序列分子鑒定技術(shù)

4.1.1 DNA 條形碼技術(shù) 隨著基因組方法的不斷發(fā)展，分子鑒定技術(shù)受到廣泛關(guān)注，其中DNA 條形碼技術(shù)廣為應(yīng)用[37-42]。DNA 條形碼是廣泛使用的基于分子和計(jì)算的識別系統(tǒng)，旨在識別生物標(biāo)本并將其分配給特定的物種，可以被認(rèn)為是一個(gè)綜合分類系統(tǒng)的核心，是生物多樣性研究中的一種技術(shù)。在目前基于基因組的方法中，Hebert 等[43]提出的DNA條形碼在現(xiàn)有物種的識別和未知物種的發(fā)現(xiàn)方面已有廣泛應(yīng)用。該技術(shù)是通過比較基因組中相對較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA 片段，對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。該鑒定技術(shù)操作主要步驟為樣品采集、DNA 提取、條形碼基因區(qū)域片段擴(kuò)增、DNA序列測序及分析。

Liu等[44]以大樣本數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，開發(fā)了一個(gè)27 bp（5' -ATCACTCCTTTGCGGGAGTCGAGGCGG-3'）的西洋參特異分子序列。BLAST 結(jié)果表明，此段序列為西洋參所特有，可以用于人參屬藥材的鑒定。廖保生等[45]依據(jù)三七的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，開發(fā)了1 段三七所特有的分子序列（5'-AACCCATCATTCCCTCGCGGGAGTCGATGCGGA GG-3'），此段特異序列可以用于三七的鑒別。林鳳越等[46]利用基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）序列的DNA條形碼技術(shù)鑒別人參與西洋參的種子，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)物種ITS2序列長度分別為226、230 bp，且最大種內(nèi)遺傳距離遠(yuǎn)小于種間遺傳距離。采用MEGA 5.0 對樣品的ITS2 序列建立鄰接（NJ）樹，結(jié)果顯示，人參與西洋參收集的各序列分別聚集為1 支，能夠明顯區(qū)分2 個(gè)物種。黃玉玲等[41]發(fā)現(xiàn)ITS 片段和psbA-trnH片段可用于三七、姜狀三七及屏邊三七的分子鑒定，matK序列可用于三七和屏邊三七的鑒別。以上研究結(jié)果均表明，DNA 條形碼技術(shù)為人參屬藥用植物的分子鑒定開辟了新道路。

4.1.2 位點(diǎn)特異性PCR 擴(kuò)增 PCR 是指在體外將某一DNA 片段擴(kuò)增，以獲得大量的目的DNA 片段。一般PCR 運(yùn)行30 個(gè)循環(huán)，即可得到幾百萬條目的DNA 片段。位點(diǎn)特異性PCR 鑒定（擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)或位點(diǎn)特異性PCR）是基于DNA 序列分析和PCR擴(kuò)增的一種鑒定方法，通過比較DNA 序列，找到相互區(qū)別又穩(wěn)定存在的變異位點(diǎn)（通常為堿基變異位點(diǎn)，如SNP位點(diǎn)），并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)鑒定的目的。

Wang 等[47]通過核糖體外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)上存在的SNP 位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了三七和人參鑒別。蔣超等[48]通過多重位點(diǎn)特異性PCR 分析人參屬的ITS、18S 和matK序列，發(fā)現(xiàn)人參、三七和西洋參分別出現(xiàn)約250、500、1000 bp 的特異性條帶；利用BioEdit 軟件校對分析特異性SNP位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)三七花ITS序列第57、68、70、522 位分別為胸腺嘧啶（T）、T、鳥嘌呤（G）、T的特異性SNP位點(diǎn)，其他人參屬植物均為胞嘧啶（C）、C、腺嘌呤（A）、A；采用多重位點(diǎn)特異性PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明人參所有部位均擴(kuò)增獲得250 bp 的特異性條帶，三七獲得約500 bp 的特異性條帶，西洋參獲得約1000 bp的特異性條帶，人參屬其他植物包括竹節(jié)參、珠子參、羽葉三七均無條帶。Chen 等[49]建立了一種基于SNP 的快速鑒別方法，基于ITS2、matK和psbA-trnH3 個(gè)區(qū)域的DNA 條形碼進(jìn)行分析，揭示了人參屬藥用植物的種內(nèi)變異特征。人參和西洋參ITS2 的種間核苷酸多樣性由2 個(gè)SNPs位點(diǎn)（32、43 bp）表示，C 和T 在32位和43位的組合為人參，T 和C 的組合為西洋參，西洋參32 bp 和三七28、140、207 bp 4 處SNP 位點(diǎn)可作為西洋參與其他三七種植物的鑒別依據(jù)。Wu 等[50]在功能性達(dá)馬烯二醇合成酶（DS）基因中發(fā)現(xiàn)6個(gè)新的SNP位點(diǎn)，用于人參和西洋參的鑒定，結(jié)果表明，基于DS基因上SNP 位點(diǎn)的巢式PCR 對檢測人參產(chǎn)品中的微量摻假具有較高的靈敏度和有效性。Nguyen 等[51]從人參屬植物葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)獲得了7種特異性SNP位點(diǎn)，并篩選出18個(gè)dCAPS標(biāo)記用于鑒定人參、西洋參、三七、竹節(jié)參、越南人參P.vietnamensisHa &Grushv.、屏邊三七P.stipuleanatusH.T.Tsai &K.M.Feng和三葉人參P.trifoliusClare Hydock。該研究為人參品種的鑒定提供了寶貴的遺傳信息和實(shí)用的標(biāo)記體系，對人參產(chǎn)業(yè)的規(guī)范具有重要意義。

4.2 基于PCR技術(shù)的DNA指紋鑒定方法

以PCR 為基礎(chǔ)的DNA 指紋鑒定方法主要包括RAPD、標(biāo)記位點(diǎn)測序（STS）、特征擴(kuò)增區(qū)段測序（SCAR）、RP-PCR、寡核苷酸引物PCR（OP-PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCR-PCR）、小寡核苷酸DNA分析（SODA）、DAF、AFLP 等。雖然以上技術(shù)往往存在操作步驟繁瑣、工作量大、結(jié)果重復(fù)性差等缺點(diǎn)，但無需測序工作，實(shí)驗(yàn)周期較短，且可獲得大量種下變異信息。

王戎博等[52]利用人參的unigene為人參和西洋參之間的內(nèi)含子長度多態(tài)性開發(fā)了一種分子標(biāo)記，從而建立多重PCR 體系來鑒定人參和西洋參。劉麗等[36]利用RAPD標(biāo)記研究了人參、西洋參與三七之間的遺傳關(guān)系。通過PCR擴(kuò)增分析基因的DNA指紋信息，根據(jù)不同引物PCR擴(kuò)增的電泳模式，篩選出6個(gè)具有特定條帶的引物：A-12、B-05、C-07、C-12、F-07、F-08。引物F-07和C-12可以區(qū)分人參與西洋參、三七種；引物B-05 和A-12 可以區(qū)分三七；引物C-07 和F-08 可以區(qū)分西洋參。以引物C-12 和F-07 的擴(kuò)增結(jié)果為例，人參在600、488 bp處具有特異性標(biāo)記，而西洋參和三七沒有這樣的條帶?；赑CR的DNA指紋鑒定方法在人參屬植物鑒別中的廣泛應(yīng)用，凸顯該技術(shù)在鑒別方面的可行性。

5 中成藥中人參屬中藥的精準(zhǔn)鑒別

中藥復(fù)方或中成藥由于藥味增加與使用輔料等原因，其化學(xué)組成更為復(fù)雜，此外由于原藥材的表觀性狀、DNA 分子、顯微特征等被破壞，中藥提取物與中成藥（特別是提取后入藥）在所有中藥應(yīng)用形式（中藥材、飲片、提取物、單方制劑、成方制劑）中真?zhèn)舞b別的難度最大。中成藥鑒別比單一中藥更具挑戰(zhàn)性，如何區(qū)分中藥復(fù)方制劑中的同屬中藥更是一項(xiàng)難度很大的工作。

5.1 多組學(xué)差異表征技術(shù)在中成藥鑒別中的應(yīng)用

非靶向代謝組學(xué)結(jié)合先進(jìn)質(zhì)譜掃描方法可以提供可靠的鑒別信息，使中成藥中藥味的準(zhǔn)確鑒定成為可能。Zhang等[53]基于人參皂苷正離子源內(nèi)裂解產(chǎn)物離子選擇性監(jiān)測的新穎中藥特征圖譜采集技術(shù)，在Vion IM-QTOF（高分辨）與QTrap 4500（低分辨）2 種質(zhì)譜儀上通過靶向監(jiān)測4 種苷元產(chǎn)物離子，建立了7 種人參屬來源中藥（人參、紅參、人參葉、西洋參、三七、竹節(jié)參、珠子參）的對照特征圖譜。繼而通過非靶向代謝組學(xué)差異分析構(gòu)建“鑒別標(biāo)志物”，并成功用于15 種中成藥中人參屬中藥（人參、西洋參、三七、紅參）的鑒別。此外，Li 等[26]采用基于UPLC/IM-QTOF-MS結(jié)合非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，對三七、三七葉、三七花樣本進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，確定了27 個(gè)潛在的標(biāo)記，建立了區(qū)分3 個(gè)部位的鑒別標(biāo)志物。然后，基于UPLC I-Class/Vion IMSQTOF 系統(tǒng)地選擇離子監(jiān)測的12 種鑒別標(biāo)志物的靶向監(jiān)測，可以同時(shí)準(zhǔn)確地從腦得生片、沈陽紅藥膠囊、心可舒片、頸痛顆粒等15 種不同的中成藥中鑒別三七，建立的方法可有助于鑒別中藥復(fù)方中以葉或花的非法替代。Yang 等[15]提出了基于LC-MS 代謝組表征和多元數(shù)據(jù)分析的指紋圖譜的一種多指標(biāo)檢測方法來有效地區(qū)分人參、三七、西洋參，并在復(fù)方制劑中對其進(jìn)行鑒定。采用LC-MS 指紋圖譜方法對人參屬樣品的提取離子流圖中的40 個(gè)主要人參皂苷進(jìn)行分析，利用模式識別化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對樣品進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)17 個(gè)診斷化學(xué)標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)除了已知的人參皂苷Rf 和24(R)-擬人參皂苷F11外，人參皂苷Rs1可能成為區(qū)分人參和西洋參的新標(biāo)志物。通過對上述多個(gè)診斷指標(biāo)的監(jiān)測，用這些標(biāo)志物鑒別了40 種不同中藥復(fù)方制劑中的人參、三七和西洋參。以上研究結(jié)果表明，利用組學(xué)差異分析技術(shù)通過大樣本同時(shí)比較易混淆品種，構(gòu)建每味中藥的鑒別標(biāo)志物，進(jìn)而基于發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物建立新的分析方法，通過一法實(shí)現(xiàn)多種中成藥中人參類中藥的鑒別，可以為含有相似化學(xué)組成的中藥提供一種可靠的鑒別方法。

5.2 分子鑒定技術(shù)在中成藥鑒別中的應(yīng)用

與人參屬單味藥相比，中成藥的成分往往相對復(fù)雜，因而對中成藥中成分進(jìn)行鑒定亦有很大難度。目前已有學(xué)者使用分子技術(shù)對中成藥中人參類成分進(jìn)行鑒定[54-55]。程春松等[56]使用多重等位基因特異性PCR（MAS-PCR），在SNP基礎(chǔ)上對人參的ETS基因設(shè)計(jì)3 種特征性引物ETSR（5'-TTTGCAAGTCGTGTGAGTTG-3'）、AgF（5'-GTGTTGGCA TAGTGTACGTTA-3'）、PgF（5'-AGAGCAGTAAGCCTTGGAAAAT-3'）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在人參類制劑中發(fā)現(xiàn)人參的特征條帶為388 bp，西洋參的特征條帶為501 bp。魏妙潔等[57]建立基于ITS2序列的DNA條形碼分子技術(shù)對中成藥三七片的人參屬藥用成分進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七、人參、西洋參ITS2 序列分別為28、28、19 條，長度均為230 bp；三七與人參、三七與西洋參的序列間均存在7 個(gè)穩(wěn)定的SNP 位點(diǎn)。Lou等[58]基于TaqMan探針對中成藥中的三七進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示25 批三七中成藥中所有樣品均可檢測到三七的熒光信號。分子鑒定技術(shù)在含人參屬植物中成藥中成功應(yīng)用可為建立其他中成藥及中藥材的精準(zhǔn)鑒別技術(shù)提供基礎(chǔ)。

6 總結(jié)與展望

組學(xué)是一種潛在的強(qiáng)大分析技術(shù)，能夠區(qū)分人參屬不同品種、不同生長部位、不同年限、不同種植地區(qū)及假冒摻偽，該技術(shù)具有快速和高通量的優(yōu)點(diǎn)，能夠在大樣本分析的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒別。然而也存在一些局限性，組學(xué)多數(shù)需要依靠先進(jìn)的技術(shù)平臺，如GC-MS、LC-MS 和NMR；此外，缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，代謝物鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度也受質(zhì)疑。當(dāng)前研究多數(shù)集中在主要活性物質(zhì)，未來需要更深入地研究中藥中更多組分，可以對所有成分進(jìn)行表征，以捕捉整個(gè)化學(xué)信息，并掌握多類具有代表性的化學(xué)標(biāo)志物，從而找到可靠的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒別。此外，隨著高通量測序技術(shù)各種數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)軟件的飛速發(fā)展，人參基因組學(xué)將在中藥材基原物種鑒定中得到廣泛應(yīng)用，這有助于實(shí)現(xiàn)中藥材準(zhǔn)確、快速鑒定，推動中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展和更完善的數(shù)據(jù)分析方法的提出，多組學(xué)日后將在推動中藥精準(zhǔn)鑒別的相關(guān)研究中占據(jù)一席之地。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，迄今為止，已出現(xiàn)了多種分子標(biāo)記技術(shù)并廣泛應(yīng)用于基因庫構(gòu)建、基因定位、作物遺傳育種及植物親緣鑒定等研究領(lǐng)域。但由于DNA 分子鑒定方法在中藥中應(yīng)用較晚，《中國藥典》2020 年版中采用相關(guān)技術(shù)對中藥材進(jìn)行鑒別的案例較少，分子技術(shù)對人參屬中藥材不同部位之間的應(yīng)用尚不完善。無論是從該技術(shù)本身出發(fā)，還是從其研究對象思考，都需要進(jìn)一步發(fā)展，從而促進(jìn)DNA 分子技術(shù)在中藥材鑒別中的應(yīng)用。分子鑒別技術(shù)具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿?，對中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，單靠一種方法很難對中藥進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，將分子鑒定與多組學(xué)技術(shù)鑒別結(jié)合，既可從分子水平上對藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確判斷，又能為藥材質(zhì)量優(yōu)劣的評價(jià)提供理論依據(jù)，具有良好的發(fā)展前景。實(shí)現(xiàn)中藥精準(zhǔn)鑒別、保證藥品質(zhì)量，對提高中藥鑒定科學(xué)水平、保障臨床療效用藥安全、維持藥材市場秩序、推動中藥標(biāo)準(zhǔn)化、促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)向好發(fā)展具有重要科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。