王巧, 陳芝喜

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.超聲影像科,2.輸血科,湖南衡陽 421001

冠狀病毒是一類有包膜,基因組較大的正鏈RNA病毒,能夠感染果子貍、蝙蝠、蛇和老鼠等多種動(dòng)物以及人類,能夠通過動(dòng)物傳染給人類,導(dǎo)致爆發(fā)性流行[1-2]。2019年底由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情席卷全球[3]。

SARS-CoV-2含有核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白、包膜(envelop,E)蛋白、刺突(spike,S)蛋白和膜(membrane,M)蛋白4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[4]。N蛋白在SARS-CoV-2感染早期大量表達(dá),誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答,參與SARS-CoV-2的入侵、復(fù)制以及干預(yù)宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[5-6]。雖然已有研究報(bào)道了N蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)等性質(zhì),但是其他的生物學(xué)特性未見報(bào)道[7]。本文使用生物信息學(xué)軟件分析SARS-CoV-2 N蛋白的固有無序結(jié)構(gòu)域及其結(jié)合序列位點(diǎn)等生物學(xué)特性,純化得到全長(zhǎng)N蛋白并測(cè)定其免疫學(xué)活性,為新冠病毒的疫苗研發(fā)和快速診斷提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存;編碼全長(zhǎng)N蛋白的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N由上海捷瑞生物工程有限公司合成;鎳2+(Ni2+)親和層析試劑盒購(gòu)自美國(guó)通用電氣公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;所有生化試劑都為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 N蛋白的生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得7種能夠感染人冠狀病毒的N蛋白氨基酸序列即SARS-CoV-2(GenBank:MN908947.3)、HCoV-229E(GenBank:KU291448.1)、HCoV-OC43(GenBank:KU131570.1)、HCoV-NL63(GenBank:KY862074.1)、HCoV-HKU1(GenBank:MH940245.1)、SARS-CoV(GenBank:NC_004718.3)和MERS-CoV(GenBank:MH734115.1)。使用Clustal Omega進(jìn)行序列比對(duì)。使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 N蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用Pondr和IUPred軟件預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 N蛋白的固有無序結(jié)構(gòu)域(intrinsically disordered protein,IDP)。使用MoRFchib軟件預(yù)測(cè)SARS-CoV-2 N蛋白的分子識(shí)別特征序列。使用IEDB網(wǎng)站分析SARS-CoV-2 N蛋白的B細(xì)胞表位。

1.3 N蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3),挑取陽性單克隆至卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng),待細(xì)菌在600 nm波長(zhǎng)處光密度(optical density,OD)值增加到0.6時(shí),加入終濃度0.1 mmol/L IPTG于28 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h以誘導(dǎo)N蛋白表達(dá)。收集細(xì)菌置于冰上超聲破碎后,12 000 r/min離心20 min,將所獲得的上清用Ni2+親和層析法純化N蛋白,SDS-PAGE觀察純化效果,利用BCA法測(cè)定其水平。

1.4 N蛋白免疫小鼠及多克隆抗體制備

將18只8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為PBS組、佐劑組和N蛋白組,每組6只。PBS組和佐劑組分別注射PBS溶液和相應(yīng)的佐劑。N蛋白組初次免疫時(shí)將完全弗氏佐劑與N蛋白1∶1混勻,然后取100 μg N蛋白皮下注射。在第3周時(shí)將完全弗氏佐劑換成不完全佐劑,其他步驟與第1次免疫相同。第6周時(shí)按照第2次免疫方法進(jìn)行第3次免疫。最后一次免疫完2周后處死小鼠,分離抗血清和脾細(xì)胞。

1.5 血清抗體滴度檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)抗血清中抗N蛋白抗體的含量。將150 ng N蛋白加至96孔板中,4 ℃包被過夜,加入封閉液,室溫封閉2 h,微孔板中加入200 μL不同稀釋倍數(shù)的抗血清,并設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照,37 ℃孵育2 h;經(jīng)PBS洗滌后,每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋),37 ℃繼續(xù)孵育2 h,PBS洗滌后加入顯色劑,酶標(biāo)儀上測(cè)定其OD450值,并計(jì)算待測(cè)孔中的P/N值。P/N=(待測(cè)孔OD450-空白孔OD450)/(陽性對(duì)照孔OD450-空白孔OD450),當(dāng)P/N≥2.1時(shí)判定為陽性,產(chǎn)生陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)即為抗體滴度。

1.6 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

取100 μL 1×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液加入96孔板中,加30 μg N蛋白刺激細(xì)胞增殖,同時(shí)設(shè)置PBS為陰性對(duì)照組和加入40 μg刀豆球蛋白A(ConA)為陽性對(duì)照組,每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。將96孔板放入到37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h,然后加入10 μL MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,測(cè)定OD450值,計(jì)算脾細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)(simulate index,SI),判斷淋巴細(xì)胞增殖情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 N蛋白的序列比對(duì)

Clustal Omega軟件分析結(jié)果顯示,SARS-CoV-2與SARS-CoV的N蛋白的同源性高于97%,但與HCoV-229E和HCoV-NL63的N蛋白的同源性較低(圖1)。

圖1 不同冠狀病毒N蛋白的序列比對(duì)

2.2 SARS-CoV-2 N蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和固有無序結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

SARS-CoV-2 N蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有無規(guī)卷曲(C)、α螺旋(h)、β折疊(e)和β轉(zhuǎn)角(t),分別占55.13%、21.24%、16.71%和6.92%,說明該蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為無規(guī)卷曲和α螺旋。SARS-CoV-2 N蛋白在0～45、181～208位氨基酸區(qū)域?qū)儆贗DP(得分大于0.5的結(jié)構(gòu)域部分為IDP),該預(yù)測(cè)結(jié)果與其自身二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有大量無規(guī)卷曲相符合(圖2)。

圖2 SARS-CoV-2 N蛋白固有無序結(jié)構(gòu)A為Pondr軟件;B為IUPred軟件。藍(lán)色線條為固有無序結(jié)構(gòu)。

2.3 SARS-CoV-2 N蛋白的分子識(shí)別特征序列

SARS-CoV-2 N蛋白具有4個(gè)分子識(shí)別特征序列,分別在1～20位、82～98位、102～118位和403～409位氨基酸(圖3)。

圖3 SARS-CoV-2 N蛋白的分子識(shí)別特征序列藍(lán)色區(qū)域?yàn)榉肿幼R(shí)別特征序列。

2.4 SARS-CoV-2 N蛋白的B細(xì)胞表位序列

N蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。當(dāng)閾值設(shè)為0.5時(shí),SARS-CoV-2 N蛋白含有11個(gè)線性B細(xì)胞表位,具體線性B細(xì)胞表位的氨基酸序列見表1。

表1 SARS-CoV-2 N蛋白的B細(xì)胞表位序列

2.5 SARS-CoV-2 N蛋白的純化

重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N中目的基因長(zhǎng)度約為1 260 bp,與SARS-CoV-2 N蛋白的基因大小相符合(圖4A)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌,誘導(dǎo)重組菌表達(dá)N蛋白,得到蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為51.5 kDa,與理論相對(duì)分子質(zhì)量相符合。Ni2+親和層析純化得到純度較高的N蛋白(圖4B)。

圖4 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N的PCR驗(yàn)證(A)和SARS-CoV-2 N蛋白的表達(dá)與純化(B)

2.6 SARS-CoV-2 N蛋白多克隆抗體的制備

ELISA結(jié)果顯示,N蛋白組血清中特異IgG抗體滴度大于PBS組和佐劑組(P<0.05;圖5)。

圖5 血清中N抗體滴度a為P<0.05,與佐劑組和PBS組比較。

2.7 淋巴細(xì)胞增殖

N蛋白刺激小鼠脾細(xì)胞SI(1.92±0.21)明顯高于PBS組[(1.19±0.25),P<0.05],但與陽性對(duì)照組(2.12±0.29)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

研究表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E等多種冠狀病毒具有極強(qiáng)的傳染性,容易感染老年人、新生兒以及免疫功能低下的人群[8]。SARS-CoV-2現(xiàn)已與人類長(zhǎng)期共存,主要引起呼吸道感染,嚴(yán)重者導(dǎo)致器官衰竭、甚至死亡。迄今全球已有2億多確診患者,超過570萬死亡人數(shù)[8-10]。

SARS-CoV-2能編碼E、M、S和N 4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。E蛋白結(jié)構(gòu)尚不清楚,免疫原性較弱,但能夠誘導(dǎo)炎癥因子分泌,是SARS-CoV-2的毒力因子[11]。M蛋白能夠誘導(dǎo)患者發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答[11]。S蛋白識(shí)別人上皮細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2,介導(dǎo)SARS-CoV-2對(duì)宿主細(xì)胞的黏附,是疫苗開發(fā)的重要靶點(diǎn)[11]。N蛋白是冠狀病毒中最為豐富的蛋白之一,目前SARS-CoV-2已經(jīng)有Alpha、Beta、Delta和Omicron等多種突變株,但是這些突變株的N蛋白相對(duì)保守,點(diǎn)突變相對(duì)較少,故臨床上采用N蛋白用于冠狀病毒血清學(xué)診斷[12-13]。COVID-19患者體內(nèi)抗N蛋白抗體滴度較高,故N蛋白能夠用于恢復(fù)期患者的診斷[12-14]。本文結(jié)果顯示,SARS-CoV-2 N蛋白具有良好免疫原性,能夠誘導(dǎo)小鼠分泌高滴度特異性抗體,與文獻(xiàn)[15]報(bào)道結(jié)果相一致,同時(shí)N蛋白能夠刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖,這說明N蛋白能夠誘導(dǎo)宿主發(fā)生免疫應(yīng)答。

生物信息學(xué)是將計(jì)算機(jī)技術(shù)和生命科學(xué)相結(jié)合而形成的一門新科學(xué)。利用生物信息能夠預(yù)測(cè)和分析病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[9-10,16]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為蛋白質(zhì)只有折疊形成確定的三級(jí)結(jié)構(gòu)后才能發(fā)揮功能,但近年來發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)沒有三級(jí)結(jié)構(gòu),但是依舊具有重要的生物學(xué)功能,現(xiàn)在將這類蛋白質(zhì)稱為IDP。病毒蛋白中存在大量IDP,且是抗病毒的藥物作用靶點(diǎn)[17]。SARS-CoV-2M蛋白具有2個(gè)IDP,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可能參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等功能[18]。本研究預(yù)測(cè)得到SARS-CoV-2 N蛋白含有大量IDP。用MoRFchib軟件分析結(jié)果顯示,SARS-CoV-2 N蛋白有4個(gè)區(qū)域可能是分子識(shí)別特征序列,能夠參與識(shí)別和結(jié)合靶分子。SARS-CoV-2 N蛋白與其他冠狀病毒的N蛋白一樣,能夠通過IDP與核酸和靶蛋白發(fā)生相互作用[17-19]。

綜上所述,本文利用生物信息學(xué)方法分析了SARS-CoV-2 N蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、IDP結(jié)構(gòu)域、分子識(shí)別特征序列、B細(xì)胞表位等生物學(xué)性質(zhì),純化得到全長(zhǎng)N蛋白并測(cè)定其免疫學(xué)特性,為研究SARS-CoV-2致病機(jī)制以及診斷試劑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。