熊 燕,陳 菲,李 黎,付俊生,韓 輝,曲彥婷

(黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所,黑龍江 哈爾濱 150040)

野薔薇(RosemultifloraThunb.)為薔薇科薔薇屬植物,兼具觀賞性及藥用價(jià)值,且抗性強(qiáng),是現(xiàn)代月季的主要親本之一[1]。 花朵作為野薔薇重要觀賞性狀,是現(xiàn)代月季遺傳改良、培育月季新品種重要的因素。 因此,對野薔薇花瓣發(fā)育的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 多年來對于野薔薇的研究多集中于再生體系建立、根活性成分研究、抗白粉病研究等方面[2～6],野薔薇花基因的挖掘和利用等分子生物學(xué)方面的研究還很少[7]。

在野薔薇花瓣的發(fā)育過程中,其花瓣表型會(huì)發(fā)生明顯的變化。 花芽形成后,花芽逐漸膨大,含綠色花瓣。 隨后花瓣顏色開始變?yōu)榈S色,花芽逐漸擴(kuò)大。 而后花蕾停止生長,萼片輕微開裂,露出內(nèi)部的黃白色花瓣;幾天后花朵完全開放,通過花瓣細(xì)胞擴(kuò)張,花瓣已經(jīng)擴(kuò)大到最大尺寸,完全白色。 近年來對于花瓣擴(kuò)展的研究,主要在小花草玉梅(Anemonerivularis)、金花茶(Camellianitidissima)等觀賞植物中[8,9],對于野薔薇花瓣擴(kuò)展的相關(guān)研究甚少。 隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展,從大規(guī)模的基因數(shù)據(jù)中,找到各個(gè)階段的差異基因,從而揭示花瓣擴(kuò)張相關(guān)機(jī)理成為可能。 本研究于2021 年在黑龍江省科學(xué)院自然生態(tài)研究所進(jìn)行,對4 個(gè)階段野薔薇花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,以揭示花瓣擴(kuò)展相關(guān)基因在野薔薇花瓣伸展調(diào)控中的關(guān)系,為薔薇屬觀賞植物遺傳改良,培育新品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以野薔薇(RosemultifloraThunb.)花為材料進(jìn)行花瓣轉(zhuǎn)錄組研究,根據(jù)發(fā)育過程中觀察到的花瓣表型變化,將發(fā)育過程分為4 個(gè)典型階段,以“花狀態(tài)_顏色”命名:花蕾中花瓣為綠色(green petals in the flower bud(FB_GP))、花蕾中花瓣開始變色(colour changing petals in the flower bud(FB_CP))、花蕾中花瓣為黃白色(yellowish-white petals in the flower bud(FB_YP))、開放花瓣為白色(white petals of the open flower(OF_WP))(圖1)。 每個(gè)發(fā)育階段采集6 朵花的花瓣為一個(gè)樣本,立即冷凍在液氮中。

圖1 野薔薇開花的4 個(gè)階段Figure 1 Four flowering stages of Rose multiflora Thunb.

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取

野薔薇花瓣RNA 采用Thermo Fisher GeneJET RNA Purification Mini Kit 試劑盒提取。

1.2.2 cDNA 文庫構(gòu)建和RNA-seq

野薔薇花瓣cDNA 文庫構(gòu)建及RNA-seq 參考Wang ZM 的方法。 并參考Zhang J 的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析[10,11]。 應(yīng)用BlaxtX,將Unigene 序列在蛋白數(shù)據(jù)庫NR、Swiss-Prot、GO、KEGG 和COG 中進(jìn)行比對。

1.2.3 野薔薇花瓣差異基因篩選

利用RPKM 值來衡量基因的表達(dá)量[12,13],RPKM 值計(jì)算方法如下:

統(tǒng)計(jì)4 個(gè)時(shí)期的花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以差異倍數(shù)(log2 fold change≥2)和顯著性水平(P-value)為標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)開花過程的先后順序進(jìn)行兩兩比對,獲得了FB_CP vs.FB_GP,FB_YP vs.FB_CP,OF_WP vs.FB_YP 的3 個(gè)比較組,并對表達(dá)基因的上下調(diào)關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本RNA 的制備及檢測

以野薔薇花瓣為材料進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,根據(jù)發(fā)育過程中觀察到的花瓣表型變化,分別提取4 個(gè)不同發(fā)育階段花瓣RNA,GX 檢測結(jié)果結(jié)果顯示,RNA 樣品均能滿足測序建庫要求(圖2)。

圖2 野薔薇花瓣總RNA 檢測Figure 2 Detection of total RNA from Rosa multiflora petals

2.2 Unigen 功能分析

本研究有89 872 條基因序列在8 個(gè)數(shù)據(jù)庫中具有匹配結(jié)果,最終獲得52 865(58.8%)個(gè)有注釋信息的Unigenes。 8 985(54.5%)個(gè)基因序列注釋到NR 數(shù)據(jù)庫,47 417(52.8%)個(gè)基因序列注釋到eggNOG 數(shù)據(jù)庫,33 537(37.3%)個(gè)基因序列注釋到Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫,32 192(35.8%)個(gè)基因序列注釋到Pfam 數(shù)據(jù)庫,31 640(35.2%)個(gè)基因序列注釋到GO 數(shù)據(jù)庫,30 244(33.7%)個(gè)基因序列注釋到KOG 數(shù)據(jù)庫,21 685(24.1%)個(gè)基因序列注釋到KEGG,15 475(17.2%)個(gè)基因序列注釋到COG 數(shù)據(jù)庫(表1)。

表1 Unigene 注釋統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics table of unigene annotates

通過Unigene 序列相似性對組裝得到的Unigene 與NR 數(shù)據(jù)庫比對。 在NR 數(shù)據(jù)庫中48 985 個(gè)Unigene 比對到了相似序列,45.72%的Unigene 為低同源性,分布介于1.0×10-11～1.0×10-50之間,而54.28%的序列具有高度同源性,E-value 低于1.0×10-50(圖3,A)。 匹配序列相似度達(dá)到80%以上的Unigene 有35 171(71.8%),相似度低于60%的Unigene 有6 301(12.86%)(圖3,B)。 功能注釋匹配物種中,與月季匹配的物種前3 位為野草莓(Fragaria vescasubsp.vesca)(36.17%)、粳稻(OryzasativaJaponica)(13.65%)、棉花(Gossypiumhirsutum)(4.04%)(圖3,C)。

圖3 Nr 分類圖Figure 3 Classification diagram of Nr

2.3 野薔薇開花各階段差異基因分析

對代表花瓣表型主要變化的3 個(gè)比較組(FB_CP vs FB_GP,FB_YP vs FB_CP,OF_WP vs FB_YP)的差異基因進(jìn)行比較。 FB_CP 階段與 FB_GP 階段比較中,其中上調(diào)基因873 個(gè),下調(diào)基因750 個(gè);FB_YP 階段與FB_CP 階段比較中,上調(diào)基因934 個(gè),下調(diào)基因1 056 個(gè);花瓣生長的OF_WP 與FB_YP 階段比較,上調(diào)基因1 650 個(gè),下調(diào)基因1 248 個(gè),此階段差異基因增加,上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)量均有所增加(圖4 A)。 FB_CP vs FB_GP 階段花瓣為綠色;FB_YP vs FB_CP 代表花瓣由綠色變?yōu)辄S白色,但花朵未完全開放;而OF_WP vs FB_YP 代表了花瓣的生長過程,花瓣由黃白色全部變?yōu)榘咨?比較各個(gè)階段的特異差異基因分別為642、902、1 899(圖4 B)。

圖4 差異表達(dá)基因Figure 4 Different expressed genes

代表花瓣表型主要變化的3 個(gè)比較組,包含了6 個(gè)擴(kuò)展基因家族基因,其中花瓣擴(kuò)增階段(OF_WP vs FB_YP)α-expansins(c27913.graph_c0、c37172.graph_c0)顯著下調(diào),α-expansins(c28742.graph_c0)顯著上調(diào)。 而葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移/水解酶XTH 也參與了細(xì)胞擴(kuò)張和細(xì)胞壁纖維的疏松,6 個(gè)基因在野薔薇花瓣中被標(biāo)注為XTH,4 個(gè)基因(c36042.graph_c3、c35650.graph_c4、c29942.graph_c0、c35065.graph_c0)在OF_WP vs FB_YP 階段上調(diào)表達(dá)。代表花瓣表型主要變化的3 個(gè)比較組,還包括參與細(xì)胞壁合成、修飾和水解的基因,如5 個(gè)木糖苷酶(XYL),其中c30953.graph_c、0c35470.graph_c0、c34590.graph_c0 3 個(gè)基因在3 個(gè)比較組中都為上調(diào)表達(dá)。 纖維素合成酶(CES)、聚半乳糖醛酸酶(PG),這些基因都可能參與了野薔薇花瓣的擴(kuò)展。 在OF_WP vs FB_YP 比較組有2 個(gè)XYL基因(c30953.graph_c0、c35470.graph_c0)、2 個(gè)PG基因(c32184.graph_c0、c29723.graph_c1)的表達(dá)量為FB_YP 階段的2 倍以上(表2)。

表2 不同開花階段花瓣擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)Table 2 Expression of genes related to petal expansion at different flowering stages

3 結(jié)論與討論

花瓣是花卉重要的觀賞器官,從花瓣原基形成,進(jìn)入細(xì)胞增殖時(shí)期,再通過細(xì)胞擴(kuò)展和分化,形成成熟花器官[14]。 花瓣的生長主要通過花瓣細(xì)胞的擴(kuò)展,使花瓣達(dá)到最終的大小,而這一過程伴隨著細(xì)胞膨壓改變、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞壁物質(zhì)重新合成等生理活動(dòng)[15]。 本研究通過對野薔薇花瓣發(fā)育過程中4 個(gè)典型階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,比對各個(gè)不同階段影響花瓣伸展的差異基因。 轉(zhuǎn)錄組分析組裝得到52 865 個(gè)單基因(Unigenes),通過對NR數(shù)據(jù)庫的比對,功能注釋匹配物種中,與野薔薇匹配的物種前 3 位為野草莓(Fragariavescasubsp.vesca)(36.17%)、粳稻(OryzasativaJaponica)(13.65%)、棉花(Gossypiumhirsutum)(4.04%)。

花瓣的生長主要通過花瓣細(xì)胞的擴(kuò)展,使花瓣達(dá)到最終的大小,而這一過程伴隨著細(xì)胞膨壓改變、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞壁物質(zhì)重新合成等生理活動(dòng)[15]。 本研究對花瓣開放的3 個(gè)比較組(FB_CP vs FB_GP,FB_YP vs FB_CP,OF_WP vs FB_YP)的差異基因比較,各階段的差異基因分別為642、902、1 899 個(gè),比對各個(gè)不同階段影響花瓣伸展的差異基因,花蕾變色期到花蕾花瓣黃白色階段及花蕾花瓣黃白色到花瓣開放白色階段,花瓣擴(kuò)展相關(guān)基因相關(guān)差異基因表現(xiàn)為上調(diào),在花蕾花瓣黃白色到花瓣開放白色階段差異基因的表達(dá)量明顯升高,表明花瓣擴(kuò)展相關(guān)基因在野薔薇完整花發(fā)育階段有重要的作用。 與菟葵(Eranthisstellata)、櫻桃(Cerasus×yedoensis)、白菜(Brassicacampestrisssp.pekinensis)、深山含笑(Michelia maudiae)等植物花瓣富集分析有類似的結(jié)論[16～19]。

植物擴(kuò)展蛋白(EXP)包括α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、類 α-expansin(EXLA) 和 類 β-expansin(EXLB)[20～21]。 花器官控制花朵開放過程,尤其是花瓣的擴(kuò)展[22],不同的EXP基因家族成員在植物花開放花瓣擴(kuò)展過程中的表達(dá)有差異[23]。 本研究鑒定出了6 個(gè)擴(kuò)展蛋白基因(EXP)基因,其中包括2 個(gè)RmEXPA1,1 個(gè)RmEXPA6 表現(xiàn)為在花瓣擴(kuò)展期表達(dá)量升高的趨勢,同唐菖蒲(Gladiolusgrandiflorus)、桂花(Osmanthusfragrans)的EXPA1 表達(dá)量在花蕾期較低,花瓣顯著伸展期增加的趨勢相類似[24,25]。 而RmEXPA11 則表現(xiàn)為在整個(gè)花瓣開放過程中持續(xù)降低的趨勢,同月季中RhEXPA3 的表達(dá)模式較為類似[26]。 而6 個(gè)木葡糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(XET/XTH)基因在花瓣開放前期都表現(xiàn)為表達(dá)量升高,在花瓣最后開放的過程中表達(dá)量降低,與番茄(Lycopersiconesculentum)DpXTHs基因花瓣早期表達(dá)量相同,推測XET/XTH基因與花瓣的早期生長密切相關(guān)[27]。 本研究通過對不同開花階段花瓣擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)分析,得到花瓣擴(kuò)展可能受EXP,XTH基因家族及細(xì)胞壁合成、修飾和水解相關(guān)基因XYL,CES的作用。