桂志明 黃健 李世豪 吳昊開 汪前亮

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，湛江 524001

膀胱癌作為泌尿系最常見的惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第9 位及病死率第13 位［1］，其極易復(fù)發(fā)并伴隨著較差的預(yù)后，使臨床治療困難。目前，針對膀胱癌尚無較好的藥物治療策略，仍以手術(shù)切除為主，但淺表性膀胱癌電切術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%，其中10%～20%患者可進(jìn)一步發(fā)展為浸潤性膀胱癌［2］。但傳統(tǒng)意義上的放化療則往往治療效果不佳，不論是針對膀胱癌細(xì)胞的腫瘤殺傷指數(shù)偏低，或是治療不良反應(yīng)偏大，使這種治療手段無法在臨床獲益［3］?；谶@一現(xiàn)狀，研究新的治療策略，開發(fā)新的治療藥物，提高臨床治療效果，已極為迫切。目前，臨床上藥物治療膀胱癌除了絲裂霉素C 及表柔比星等化療藥物外，還有一些較好的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)，卡介苗可通過刺激患者免疫進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展，是非肌層浸潤性膀胱癌最有效的治療方法，此外，部分中藥及腺相關(guān)病毒也在近年來展現(xiàn)出足夠的治療潛力，有望為膀胱癌的治療提供助力［4］。尤其是中藥，在近年來，逐漸在腫瘤治療領(lǐng)域展露光彩，但因缺乏系統(tǒng)性的研究框架，未能深入揭示中藥治療腫瘤的功能機(jī)制。較單靶點(diǎn)藥物而言，傳統(tǒng)中藥（TCM）具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的強(qiáng)大優(yōu)勢［5］。此外，與化學(xué)合成的藥物相比，TCM 以其天然產(chǎn)物的身份往往更易于人體吸收，且在很大程度上對機(jī)體是無害的，這極大彌補(bǔ)了其他治療藥物不良反應(yīng)大的巨大缺陷［6］。丹參作為著名藥材應(yīng)用于臨床治療中，尤其在心腦血管方面具備悠久的使用歷史，療效顯著［7］。隨著研究深入，丹參在癌癥治療中的作用日益凸顯，大量文獻(xiàn)對此進(jìn)行了報道［8-10］，但并未系統(tǒng)闡明丹參在膀胱癌治療中的作用機(jī)制。隨著生物大數(shù)據(jù)的精確性不斷提高以及生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與藥理學(xué)的不斷融合，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示中藥有效成分及精準(zhǔn)靶點(diǎn)的Network 模式已被認(rèn)為是一種極具潛力的研究方法［11-15］。本研究基于這一方法，深入分析丹參的有效活性成分及其潛在分子靶點(diǎn)，結(jié)合膀胱癌患者的癌癥基因圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集，進(jìn)行預(yù)后及風(fēng)險回歸分析等，確定其治療靶點(diǎn)，并在體外細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為丹參治療膀胱癌提供詳細(xì)的分子機(jī)制基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料

膀胱癌細(xì)胞系：5637、T24、J82、UMUC3（ATCC 細(xì)胞庫）；正常膀胱上皮細(xì)胞：SV-HUC-1（ATCC 細(xì)胞庫）。抗體：脂肪酸合成酶（FASN）（Proteintech；10624-2-AP）。丹參提取物：扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司購買。培養(yǎng)液：1640培養(yǎng)基（GIBCO）；DMEN 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（GIBCO）；MEM 培養(yǎng)基（GIBCO）；FBS（胎牛血清，依客賽）；L-Glutamine 200mM（100X）（GIBCO）。耗材：培養(yǎng)皿（耐思NEST），Transwell 小室（REF，353097）。研究時間：2022 年1 月至2023年6月。

2.方法

2.1.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選丹參有效成分及分子靶點(diǎn) 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲得丹參的成分信息，根據(jù)生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選有效藥物成分，通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）收集有效成分的治療靶點(diǎn)并在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析。

2.2.基因本體論（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析 通過WebGestalt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.webgestalt.org/）對這些分子靶點(diǎn)進(jìn)行GO 與KEGG 功能分析，并對前十位的通路進(jìn)行可視化。

2.3.TCGA膀胱癌數(shù)據(jù)集篩選 從TCGA數(shù)據(jù)集（https：//tcga-data.nci.nih.GOv/tcga/）下載截至2023年7月11日前膀胱癌患者的RNA-seq測序數(shù)據(jù)及臨床資料，包括生存狀態(tài)等臨床信息，納入上述獲得的藥物分子靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)后分析（P＜0.05），篩選存在預(yù)后價值的丹參-疾病基因，同時應(yīng)用“l(fā)imma”包分析這些基因在癌與癌旁組織中的差異表達(dá)（P＜0.05）。

2.4.風(fēng)險回歸模型構(gòu)建 本研究納入TCGA 數(shù)據(jù)集共408 個膀胱癌樣本，隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測試集，各204 個。訓(xùn)練集用于構(gòu)建丹參-疾病基因的風(fēng)險回歸模型，測試集用于驗(yàn)證所建立的模型?；谙惹矮@得的44 個具有預(yù)后價值的靶點(diǎn)，使用R 軟件包“glmnet”進(jìn)行l(wèi)asso-Cox 回歸分析。進(jìn)而從TCGA 數(shù)據(jù)集中篩選出18 個與肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）患者的總生存率顯著相關(guān)的丹參-疾病基因，基于這些基因成功建立風(fēng)險模型。使用以下公式計(jì)算風(fēng)險評分：風(fēng)險評分=coe（fRNA1）×expr（RNA1）+coe（fRNA2）×expr（RNA2）+……+coe（fRNA18）×expr（RNA18），coef 表示與存活相關(guān)的RNA 系數(shù)，expr（RNA）表示RNA 的表達(dá)。根據(jù)中位風(fēng)險評分建立包括低風(fēng)險組和高風(fēng)險組的亞組。

2.5.關(guān)鍵蛋白FASN 驗(yàn)證 在獲得風(fēng)險基因后，進(jìn)一步結(jié)合其風(fēng)險系數(shù)，基因表達(dá)水平與預(yù)后信息進(jìn)行篩選，確定FASN 是最顯著高風(fēng)險基因后，在常見膀胱癌細(xì)胞系中進(jìn)行Western blot 蛋白檢測：細(xì)胞培養(yǎng)至80%時停止生長，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗后加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取。以7.5%的SDS-PAGE 分離膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后加入標(biāo)記FASN 和GAPDH 抗體在4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 清洗聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后再加入對應(yīng)的二抗（Rabbit）室溫下孵育1 h，TBST清洗后借助ECL顯影液進(jìn)行顯影。

2.6. 細(xì)胞分組和處理 取生長至對數(shù)期的J82 細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%時進(jìn)行處理，分別加入丹參提取物（1 mg/ml）與PBS（陰性對照）進(jìn)行處理。

2.7.細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力檢測 細(xì)胞增殖：取生長狀態(tài)好的細(xì)胞進(jìn)行鋪板（96 孔板），然后加入丹參提取物處理，分別在24 h、48 h、72 h 進(jìn)行MTT 檢測細(xì)胞增殖情況；侵襲：首先將細(xì)胞在六孔板中進(jìn)行鋪板，待細(xì)胞生長至70%時進(jìn)行藥物處理，待細(xì)胞長至90%時進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞橫向遷移能力變化；侵襲：同樣取正常細(xì)胞，在細(xì)胞長至70%進(jìn)行藥物處理，待細(xì)胞長滿后用胰酶消化，提前在Transwell 小室內(nèi)部進(jìn)行基質(zhì)膠處理，然后在小室內(nèi)加入5×103個藥物處理過的細(xì)胞與正常細(xì)胞，待24 h后取出小室以棉球擦除小室內(nèi)部未穿過的細(xì)胞，以結(jié)晶紫染色拍照，觀察細(xì)胞侵襲能力變化。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究結(jié)果采用SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間比較。

結(jié)果

1.構(gòu)建丹參-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將丹參有效成分及其靶點(diǎn)信息輸入Cytoscape_v3.8.2進(jìn)行可視化分析，得到藥物-有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，其中丹參有效成分65個，靶點(diǎn)270個（圖1）。

2.丹參靶點(diǎn)的功能富集分析

在獲得丹參靶點(diǎn)信息后，進(jìn)行GO 與KEGG 功能富集分析，結(jié)果顯示其主要富集在氮代謝、膀胱癌、內(nèi)分泌抵抗、催乳素信號通路、前列腺癌及其他癌癥等通路上，展現(xiàn)出丹參在膀胱癌及其他癌癥中的治療潛力（圖2）。

圖2 丹參有效靶點(diǎn)的GO功能富集分析（A）及KEGG功能富集分析（B）

3.膀胱癌有效靶點(diǎn)預(yù)測

將270個藥物靶點(diǎn)輸入膀胱癌TCGA 數(shù)據(jù)集中（Tumor：408 比Normal：19），結(jié)合患者預(yù)后信息進(jìn)行篩選，其中44 個基因在膀胱癌中具有預(yù)后價值（P＜0.05），接著基于“l(fā)imma”R 包分析其在膀胱癌與癌旁之間的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，其中33個基因存在差異表達(dá)（圖3）。

圖3 44個基因預(yù)后信息（A）及44個基因在膀胱癌與癌旁中的表達(dá)水平（B）

4.基于18個基因構(gòu)建風(fēng)險回歸模型

研究基于其中的18 個基因在膀胱癌測序數(shù)據(jù)集中建立風(fēng)險回歸模型，其測試集（204 例）曲線下面積（AUC）=0.819，驗(yàn)證集（204 例）AUC=0.661，具備預(yù)測價值（圖4）。MAOA、NR1H3、PTPN6、PDE10A、CASP9、POLB及EED是低風(fēng)險基因，而MMP9、HCAR2、ADRA2C、PSMB5、SUZ12、FASN、MAP2K1、PGR、SLC6A2、HTR2B、ABCC9 則是高風(fēng)險基因，研究結(jié)合患者臨床信息發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險基因在TNM 高等級患者中表達(dá)水平更高（圖5）。研究進(jìn)一步分析這些基因在癌與癌旁間的表達(dá)，結(jié)果顯示，MAOA 作為低風(fēng)險基因在癌中顯著低表達(dá)，而HCAR2、FASN、MMP9及PSMB5則作為高風(fēng)險基因在癌中顯著高表達(dá)，其中又以FASN系數(shù)最高（圖6）。預(yù)后信息同樣顯示其預(yù)后較差。總生存率：HR=1.66，無復(fù)發(fā)生存期：HR=2.61，可作為促癌基因進(jìn)行后續(xù)研究分析（圖7）。

圖4 基因構(gòu)建風(fēng)險回歸模型。A：10倍交叉驗(yàn)證的LASSO回歸圖譜；B：18個基因的LASSO系數(shù)圖譜；Kaplan-Meier對高風(fēng)險和低風(fēng)險人群中MIBC的生存分析（C：測試集：D：驗(yàn)證集）；風(fēng)險評分模型ROC（E：測試集：F：驗(yàn)證集）

圖6 風(fēng)險基因在癌與癌旁中的表達(dá)水平分析

5.丹參可抑制FASN 表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖侵襲及遷移能力

在常見膀胱癌細(xì)胞系及正常膀胱上皮細(xì)胞中檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 在J82 細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，而丹參提取物在10 mg/L 時不影響膀胱上皮細(xì)胞生長但可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞生長，并可抑制其增殖、侵襲及遷移能力（圖8）。

討論

隨著我國對中醫(yī)藥發(fā)展創(chuàng)新的日益重視，探索中藥在多種疾病尤其是腫瘤領(lǐng)域中的治療效用是重要方向，而科學(xué)的研究理念結(jié)合先進(jìn)技術(shù)手段可以更深入挖掘其間機(jī)制。丹參不僅可作為心腦血管治療藥物，其在腫瘤治療中同樣具備顯著治療作用。Zhou 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅰ可通過使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/蛋氨酸合成酶通路失活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬并最終減弱卵巢癌的惡性生物學(xué)特性；Chen 等［17］研究顯示，丹參多糖可通過激活Toll樣受體介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路進(jìn)而激活癌癥患者的T細(xì)胞免疫，緩解腫瘤患者免疫微環(huán)境抑制狀態(tài)。Cao等［18］研究同樣顯示，丹參提取物-二氫丹參酮能通過調(diào)節(jié)胱天蛋白酶與細(xì)胞色素C 進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖；而在泌尿系惡性腫瘤中，丹參同樣發(fā)揮著重要作用。Park 等［19］研究報道，從丹參中分離出來的主要成分-隱丹參酮可通過Bcl-2 和MAPK 調(diào)節(jié)使DU145 前列腺癌細(xì)胞對Fas（APO1/CD95）介導(dǎo)的凋亡敏感。Chen 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，丹參的水性成分丹酚酸B 可抑制YAP1 和Hippo 信號的激活，從而消除了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并導(dǎo)致N-鈣黏蛋白表達(dá)降低，同時下調(diào)SNAIL1 和TWIST，并伴有高剪切應(yīng)力誘發(fā)的腎癌細(xì)胞凋亡。這些研究均顯示出丹參在腫瘤治療中的潛力，而在膀胱癌中，則分別發(fā)現(xiàn)了丹參酮ⅡA 及隱丁胺酮（CTT）均具有治療作用［21-22］。截至目前，其在膀胱癌中的功效及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法及TCGA 等大數(shù)據(jù)分析，丹參提取物具備一定的抗癌活性，可通過抑制FASN 的表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲能力。FASN 處于激活狀態(tài)時，是一種具有7 種不同催化活性的同型二聚體，可在肝臟中產(chǎn)生脂質(zhì)后輸出到代謝活躍的組織或儲存在脂肪組織中。免疫組織化學(xué)染色表明FASN 水平與乳腺腫瘤大小直接相關(guān)［23］，且FASN在肺癌和前列腺癌中高表達(dá)，是乳腺癌和前列腺癌的預(yù)后不良指標(biāo)［24-26］。FASN作為癌癥和代謝綜合征診療中的一個潛在靶標(biāo)已受到越來越多的關(guān)注［27-28］。Xiong 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 在膀胱癌正常組織和腫瘤組織中表達(dá)存在差異，并且與生存相關(guān)，可獨(dú)立預(yù)測MIBC 進(jìn)展，與免疫細(xì)胞浸潤顯著相關(guān)，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FASN 低表達(dá)的患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)往往更好。而Deng 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以靶向Clusterin 進(jìn)而通過SREBP-1c/FASN 軸調(diào)控脂肪生成并抑制膀胱癌細(xì)胞生長。這些研究展現(xiàn)出FASN 作為促癌基因在膀胱癌這重要功能。本研究在前期數(shù)據(jù)分析中顯示，丹參可下游作用于FASN并在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步揭示其調(diào)控關(guān)系，即丹參提取物可抑制FASN表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌惡性表型。

本研究表明丹參提取物可抑制FASN 表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞系惡性表型，其有望作為一味中藥應(yīng)用于臨床上膀胱癌的預(yù)防或治療；本研究通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯矿w系結(jié)合大數(shù)據(jù)挖掘及實(shí)驗(yàn)技術(shù)等證明了丹參提取物在膀胱癌治療中的功能機(jī)制，同樣為后續(xù)藥物研發(fā)提供了新的研究策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 桂志明：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，起草文章，獲取研究經(jīng)費(fèi)；黃?。悍治?解釋數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；李世豪：實(shí)施研究；吳昊開：分析/解釋數(shù)據(jù)；汪前亮：采集數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)