摘要 為探究2C 型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C， PP2C）在木薯響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中的作用，利用木薯Arg7 葉片cDNA 擴(kuò)增MePP2CAa 基因，分析該基因序列、啟動(dòng)子活性、不同逆境和激素處理下的表達(dá)模式以及與ABA 受體PYLs 之間的互作關(guān)系。序列分析結(jié)果顯示，MePP2CAa 基因全長(zhǎng)1 311 bp，編碼436 個(gè)氨基酸，具有PP2C 家族的結(jié)構(gòu)域特征，與橡膠樹(shù)和麻風(fēng)樹(shù)的PP2C 序列同源性最高，分別為78.95% 和74.09%，在C 端保守；qRT-PCR 分析結(jié)果顯示，MePP2CAa 基因在木薯儲(chǔ)藏根中的表達(dá)顯著高于莖、葉中的表達(dá)量；不同逆境和激素處理結(jié)果顯示，甘露醇、NaCl、ABA、MeJA、低溫和SA 處理可以顯著誘導(dǎo)MePP2CAa 基因的表達(dá)；MePP2CAa 基因啟動(dòng)子序列分析顯示，啟動(dòng)子包含ABA 應(yīng)答元件（abscisic acid responsive element，ABRE）、MeJA 響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)元件等；酵母雙雜交結(jié)果顯示MePP2CAa 能夠與MePYL1 互作。以上結(jié)果表明，MePP2CAa 基因可能響應(yīng)木薯的非生物脅迫。

關(guān)鍵詞 木薯； 脫落酸； 2C 型蛋白磷酸酶； 非生物脅迫

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）01-0141-08

脫落酸（abscisic acid， ABA）在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要角色，涉及種子發(fā)芽、幼苗發(fā)育、植物生長(zhǎng)、開(kāi)花、性別分化和果實(shí)成熟等多個(gè)過(guò)程［1-3］，同時(shí)也參與植物對(duì)干旱、高鹽、寒冷和病原體侵染等非生物和生物脅迫反應(yīng)［4-5］。然而，ABA 信號(hào)通路相對(duì)復(fù)雜，直到2009 年，學(xué)者們才在擬南芥中闡明了ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心通路，該通路包括ABA 受體PYR/PYL/RCARs（ABA 信號(hào)的正向調(diào)節(jié)）、蛋白磷酸酶A（PP2CAs）亞家族（ABA 信號(hào)的負(fù)向調(diào)節(jié)）和蛋白激酶SnRK2s（ABA 信號(hào)的正向調(diào)節(jié)）［6］。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受干旱的影響，會(huì)導(dǎo)致作物生長(zhǎng)受阻，作物產(chǎn)量顯著降低［7-8］。激素是植物對(duì)非生物脅迫做出響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，其中ABA 是對(duì)干旱脅迫做出反應(yīng)的關(guān)鍵激素［9］。研究表明，當(dāng)植物面臨干旱脅迫時(shí)，會(huì)增加ABA 含量，同時(shí)也會(huì)改變?cè)S多基因的表達(dá)，這種反應(yīng)既有ABA 依賴的反應(yīng)，也有非ABA 依賴的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而ABREs 則是ABA 依賴反應(yīng)途徑中的主要反應(yīng)元件［10-12］。PP2C A 亞家族通常在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用［6， 13］，目前已經(jīng)在水稻［14-15］、玉米［16］、二穗短柄草［17］、棉花［18］等物種中鑒定出PP2C A 亞家族成員。研究表明，擬南芥中的abi1/abi2/hab1/ahg3/pp2ca 基因突變體可以通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)ABA 信號(hào)來(lái)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育［19-20］和應(yīng)激反應(yīng)［21-22］。異源過(guò)表達(dá)ZmPP2C 和ZmPP2CA10基因可以負(fù)調(diào)節(jié)ABA 信號(hào)傳遞，使轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)外源ABA 處理不敏感，而對(duì)鹽分和干旱脅迫的敏感性增加［23-24］；另外，過(guò)表達(dá)楊樹(shù)PP2C 基因也會(huì)負(fù)調(diào)節(jié)ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而使轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫更加敏感［25］。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是熱帶和亞熱帶地區(qū)一種重要的糧食作物，是全球第六大糧食作物，為7 億人提供碳水化合物［26-27］。木薯具有典型的抗旱特性，可以作為作物抗旱機(jī)制研究的理想材料［28］。目前關(guān)于木薯中PP2C 基因家族的研究相對(duì)有限［29］，該基因在非生物脅迫下的功能和調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，為了深入研究PP2C 基因在木薯抗逆過(guò)程中的功能，本研究克隆了MePP2CAa 基因，并對(duì)其編碼蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析MePP2CAa 基因的自激活和啟動(dòng)子活性，不同逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)模式，以及與ABA 受體PYLs 之間的互作關(guān)系，旨在為深入研究MePP2CAa基因的功能提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

試驗(yàn)品種為木薯Arg7，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。采集大田種植環(huán)境下木薯葉片（90 d）、莖（90 d）和儲(chǔ)藏根（R1 90 d、R2 150 d、R3 210 d、R4 270 d）材料；選取扦插后60 d 長(zhǎng)勢(shì)一致的木薯Arg7 幼苗進(jìn)行不同激素和脅迫處理試驗(yàn)，① 100 μmol/L MeJA、100 μmol/L SA、100 μmol/LABA 處理后分別在0、2、6、12、24 h 采集葉片；② 300mmol/L NaCl和200 mmol/L 甘露醇處理后分別在0h、2 h、6 h、3 d和14 d采集葉片；③ 4 ℃處理后分別在0、2、6、12、48 h 采集葉片。采樣后迅速放入液氮速凍，于?80 ℃超低溫冰箱中保存，用于RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量分析。

1.2 基因克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)中的木薯序列（Manes.02G128000），設(shè)計(jì)引物MePP2CAa-F/MePP2CAa-R（表1），以葉片cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。利用Ex?PASy ProtParam （http：//web. expasy. org/protparam/）對(duì)MePP2CAa 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，運(yùn)用SOPMA 和SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy. org/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，利用BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源序列的搜索，利用MEGA-X 中的MUSCLE方法進(jìn)行序列比對(duì)，采用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 啟動(dòng)子克隆和序列分析

從Phytozome（https：//phytozome-next. jgi. doe.gov/）中獲取木薯MePP2CAa 基因上游1 500 bp 啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)MePP2CAaP-F/MePP2CAaP-R 引物擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域（表1），利用PlantCARE（https：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）對(duì)MePP2CAa 基因啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析。

1.4 啟動(dòng)子活性分析

將pGreenⅡ 0800-LUC-MePP2CAaP 載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將菌體用注射煙草的重懸液調(diào)整至OD600 為1.0，25 ℃恒的煙草嫩葉下表皮，培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行雙熒光素酶含量的測(cè)定，計(jì)算LUC/REN 值，每個(gè)樣品6 次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 基因表達(dá)分析

根據(jù)MePP2CAa 序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qMePP2CAa-F 和qMePP2CAa-R（表1），分析MePP2CAa 基因在不同激素和脅迫處理中的表達(dá)情況，MeTUB 為內(nèi)參基因，使用2－△△Ct法［26］計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 轉(zhuǎn)錄激活和互作分析

將載體pGBKT7-MePP2CAa 轉(zhuǎn)化到酵母中，取200 μL 涂板至一缺培養(yǎng)基（SD/?Trp），29℃培養(yǎng)48～96 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用液體SD/? Trp 培養(yǎng)基活化陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落，用ddH2O 稀釋至合適濃度，取2 μL 菌落水溶液分別點(diǎn)于SD/?Trp、SD/?His 和SD/?His/X-α-gal 培養(yǎng)基，29 ℃培養(yǎng)觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

構(gòu)建MePYLs 和MePP2CAa 基因的酵母表達(dá)載體。以pGADT7-T 和pGBKT7-53 作為陽(yáng)性對(duì)照、pGADT7-T 和pGBKT7-Lam 作為陰性對(duì)照，將陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒組合、陰性對(duì)照質(zhì)粒組合以及構(gòu)建的重組質(zhì)粒組合（引物見(jiàn)表1）兩兩轉(zhuǎn)化到AH109 酵母感受態(tài)中培養(yǎng)觀察蛋白的互作情況。挑取SD/?Trp/?Leu培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，挑取原始菌落進(jìn)行10 倍稀釋，吸取稀釋后菌落水溶液2 μL，點(diǎn)于SD/?Trp/?Leu和SD/?Trp/?Leu/?Ade/?His 培養(yǎng)基，29 ℃培養(yǎng)觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 MePP2CAa 基因克隆

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，木薯PP2C 基因（Manes.02G128000）可以受到ABA 和PEG 的誘導(dǎo)表達(dá)（圖1A、B）。根據(jù)Manes.02G128000 序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度1 311 bp 的片段（圖1C），經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該片段編碼436 個(gè)氨基酸，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該蛋白含有PP2C 家族結(jié)構(gòu)域（圖1D），因此命名為MePP2CAa 基因。MePP2CAa 蛋白的分子式為C2030H3298N602O647S31，理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，MePP2CAa 蛋白的分子質(zhì)量為47.48 ku，理論等電點(diǎn)為6.08，不穩(wěn)定系數(shù)為54.24，屬不穩(wěn)定蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)MePP2CAa 基因序列包含4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子。

2.2 MePP2CAa 氨基酸序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)序列查找與MePP2CAa 蛋白序列相似性較高（gt;65%）的蛋白序列，序列比對(duì)結(jié)果顯示，MePP2CAa 蛋白序列與橡膠樹(shù)PP2C（XP_021649290.1）和麻風(fēng)樹(shù)PP2C（KDP42204.1）一致性最高，分別為78.95% 和74.09%（圖2），表明不同物種間PP2C 蛋白序列具有較高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，大戟科植物木薯MePP2CAa 和橡膠樹(shù)HbPP2C24 親緣關(guān)系較近，位于同一分支（圖3）。

2.3 MePP2CAa 基因啟動(dòng)子的活性分析

通過(guò)PCR 獲得MePP2CAa 基因1 500 bp 的啟動(dòng)子序列，利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MePP2CAa 基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示，該基因的啟動(dòng)子除了包含基本的核心啟動(dòng)子元件，還包括2 個(gè)ABRE 順式調(diào)控元件、2 個(gè)MeJA 響應(yīng)元件及1 個(gè)干旱誘導(dǎo)元件。為了驗(yàn)證克隆得到的MePP2CAa 基因啟動(dòng)子是否具有活性，進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，克隆得到的MePP2CAa 基因啟動(dòng)子具有較高的活性，能夠有效啟動(dòng)下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。

2.4 MePP2CAa 基因的表達(dá)分析

木薯儲(chǔ)藏根、莖、葉3 種組織中MePP2CAa 基因的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示（圖5），MePP2CAa 基因在儲(chǔ)藏根中的表達(dá)明顯高于葉和莖。MePP2CAa 基因在儲(chǔ)藏根中的表達(dá)隨著發(fā)育時(shí)間的增加而上升，在R2（150 d）階段達(dá)到最高水平，隨后呈下降趨勢(shì)。為了探究MePP2CAa 基因的表達(dá)是否受脅迫誘導(dǎo)，檢測(cè)了不同脅迫和激素處理?xiàng)l件下葉片中MePP2CAa基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，NaCl 處理和甘露醇處理?xiàng)l件下，MePP2CAa 基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在14 d 時(shí)達(dá)到最高（圖6A、B）；冷處理下，MePP2CAa 基因的表達(dá)量在48 h 達(dá)到最高（圖6C）。MeJA 和ABA 處理下，MePP2CAa 基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，分別在6 h 和10 h 達(dá)到最高（圖6D、E）；而在SA處理下，MePP2CAa 基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)先降低后增加，在24 h 達(dá)到最高（圖6F）。以上結(jié)果表明MePP2CAa 基因可受到不同逆境和激素處理的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.5 MePP2CAa 與PYLs 基因的互作驗(yàn)證

MePP2CAa 基因自激活檢測(cè)結(jié)果如圖7 所示，pGBKT7-MePP2CAa 能夠在SD/?Trp 和SD/?His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且在SD/?His/X-α-gal 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出藍(lán)色，表明MePP2CAa 具有一定的自激活活性。因此，構(gòu)建pGADT7-MePP2CAa 載體用于酵母雙雜交試驗(yàn)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中PP2CA 亞家族成員可以與PYLs 家族成員互作。為證明MePP2CAa 參與了ABA 信號(hào)通路的調(diào)控，本研究構(gòu)建了MePYL1-MePYL4 基因酵母表達(dá)載體，分析了MePP2CAa 與MePYL1-MePYL4 的互作關(guān)系，結(jié)果如圖8 所示，所有組合在SD/?Trp/?Leu 培養(yǎng)基上都表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)。在SD/?Trp/?Leu/?Ade/?His培養(yǎng)基上，pGADT7-MePP2CAa+pGBKT7-Me?PYL1 和pGADT7-T+pGBKT7-53 陽(yáng)性對(duì)照有菌落形成；而pGADT7-MePP2CAa+pGBKT7-Me?PYL2/MePYL3/MePYL4 組合及pGADT7-T+pGBKT7-Lam 陰性對(duì)照則沒(méi)有菌落產(chǎn)生，表明MePP2CAa 與MePYL1 存在相互作用。

3 討論

ABA 在植物中發(fā)揮著重要的作用，幫助植物適應(yīng)不同的環(huán)境變化和應(yīng)對(duì)脅迫。Umezawa 等［6］在擬南芥中鑒定了ABA 受體及其核心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（ABA 受體PYR/PYL/RCARs、蛋白磷酸酶PP2CAs 和蛋白激酶SnRK2s）。在沒(méi)有ABA 存在的情況下，PP2CAs 會(huì)抑制SnRK2s 對(duì)下游靶蛋白的磷酸化，而一旦ABA 出現(xiàn)，PYL 和PP2CAs 會(huì)相互結(jié)合，SnRK2s 被釋放，磷酸化其他靶標(biāo)蛋白，并進(jìn)一步激活A(yù)BA 信號(hào)傳導(dǎo)通路［6］。PP2CAs 在ABA 信號(hào)傳導(dǎo)通路中扮演著關(guān)鍵的角色，深入研究其功能顯得尤為重要。本研究成功克隆了1 個(gè)PP2CA 亞家族成員MePP2CAa。通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，MePP2CAa基因在木薯Agr7 的不同組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)。在儲(chǔ)藏根、莖和葉中均表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，尤其是在儲(chǔ)藏根中的表達(dá)水平最為顯著。這一結(jié)果表明MePP2CAa 基因可能在木薯儲(chǔ)藏根的生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PP2C 基因在其他作物的不同組織中也存在不同的表達(dá)模式，比如小麥TaPP2C-a10 基因在葉片和種子的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但在種子開(kāi)花后20 d 的表達(dá)水平最高［30］。同樣，二穗短柄草BdPP2CA6 基因在根、莖、葉和芽中也有表達(dá)，但以莖中的表達(dá)水平最高［31］。這些結(jié)果表明PP2C 基因的表達(dá)水平與植物不同組織的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程之間存在密切關(guān)系。

植物中的A 類PP2C 基因通常對(duì)各種逆境脅迫表現(xiàn)出響應(yīng)。擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，A 類PP2C 基因在對(duì)ABA 信號(hào)的負(fù)調(diào)控方面表現(xiàn)出相似的功能，參與擬南芥的氧化脅迫反應(yīng)［32-33］和抗冷脅迫的響應(yīng)［34］。對(duì)于重要作物水稻和玉米，A 類PP2C 基因在應(yīng)對(duì)如高鹽、干旱和低溫等非生物逆境也呈現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)［14， 23-24］。本研究的結(jié)果顯示，MePP2CAa 基因可以被低溫、甘露醇、NaCl、ABA、MeJA 和SA 誘導(dǎo)，這與筆者所在課題組前期RNA-seq 試驗(yàn)結(jié)果［35］相符。然而，與此相反，F(xiàn)sPP2C2 基因的超表達(dá)在增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抵抗力的同時(shí)，也提高了對(duì)ABA 信號(hào)的敏感性［36］；AtPP2CG1 基因的超表達(dá)也被證明能夠提高植株對(duì)高鹽脅迫的抵抗力和對(duì)ABA信號(hào)的敏感性［37］。本研究中，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)明確了MePP2CAa 和MePYL1 蛋白存在相互作用，這進(jìn)一步證實(shí)了MePP2CAa 屬于PP2C A 亞家族，并可能參與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，MePP2CAa 基因可能通過(guò)ABA 信號(hào)通路來(lái)響應(yīng)非生物脅迫，但MePP2CAa 在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控作用尚不明確。這些結(jié)果可為進(jìn)一步解析MePP2CAa 基因在ABA 信號(hào)通路中的功能提供參考。

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（責(zé)任編輯：葛曉霞）