摘" " 要：為查清山西省呂梁市中陽縣某豬場從山東購買的保育仔豬大量出現(xiàn)的急性死亡、關(guān)節(jié)發(fā)炎、呼吸困難、高熱等癥狀的病原，無菌采集病豬并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床剖檢，隨后采集血液、淋巴結(jié)、肺、腎臟和脾臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，做出初步判斷，制定綜合防治策略，病情得到控制。本研究采用靈敏度和準(zhǔn)確度較高的實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)定性檢測病料樣品中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）和副豬嗜血桿菌（HPS）。結(jié)果表明：中陽縣某豬場保育仔豬為 PCV2 與 HPS 混合感染?；谠\斷結(jié)論對保育豬免疫治療程序和消毒進(jìn)行合理調(diào)整，綜合防治13 d后，豬群無新增發(fā)病率和新增死亡率，最大程度地減少了經(jīng)濟(jì)損失。本研究為豬場后續(xù)的治療與預(yù)防提供了診斷依據(jù)。

關(guān)鍵詞：保育仔豬；豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）；副豬嗜血桿菌?。℉PS）；混合感染；診療

中圖分類號：S855.3；S828" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.06.008

Diagnosis and Treatment of Co-infection of Porcine Circovirus Type 2 and Haemophilusparasuis in the Care of Piglets

XUE Yipeng，WU Xin

（College of Animal Science，Shanxi Agricultural University，Taiyuan， Shanxi 030032，China）

Abstract： In order to identify the pathogens causing acute death， arthritis， breathing difficulties， and high fever in a large number of piglets purchased from Shandong by a pig farm in Zhongyang County， Lyuliang City， Shanxi Province， this study collected diseased pigs aseptically and brought them back to the laboratory for clinical dissection. Subsequently， blood， lymph nodes， lungs， kidneys， and spleen were collected for laboratory diagnosis， and a preliminary judgment was made. A sensitive and accurate technique， Real time PCR， was used to qualitatively detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， African swine fever virus （ASFV）， porcine circovirus type 2 （PCV2）， swine fever virus （CSFV）， porcine pseudorabies virus （PRV）， and hemophilusparasuis （HPS） in diseased samples. The results showed that PCV2 and HPS mixed infection was confirmed.Based on diagnostic conclusions， adjust the immunization program of the pig farm to maximize the economic losses caused by the occurrence of diseases. The research results provide diagnostic basis for the subsequent treatment and prevention of pig farms.

Key words： nursery pigs; Porcine circovirus type 2 （PCV2）; Haemophilusparasuis disease （HPS）; mixed infection; diagnosis and treat

圓環(huán)病毒是一類小型的非囊膜病毒，具有環(huán)狀的二十面體單鏈 DNA 基因組，可在不同的動(dòng)物間引起感染[1-3]。最早發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒是豬圓環(huán)病毒 1 型（Porcine Circovirus 1， PCV1）和豬圓環(huán)病毒 2 型（Porcine Circovirus 2，PCV2）[4-5]。PCV1 無致病性[6]；PCV2 流行最廣泛且具有致病性，可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome， PMWS）、呼吸系統(tǒng)疾病、豬皮炎腎病綜合征（Porcine Dermatitis Nephrotic Syndrome， PDNS）等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcine Circovirus Associated Disease， PCVAD），已在全球各地的養(yǎng)豬場廣泛傳播[7-9]；豬圓環(huán)病毒3型（Porcine Circovirus3， PCV3）和豬圓環(huán)病毒4型（Porcine Circovirus4， PCV4）分別于 2016 年和 2019 年首次被鑒定，屬于新發(fā)豬病，與 PCV2 癥狀相似，同樣可引起機(jī)體的免疫抑制[10-13]。PCV2、PCV3 和PCV4可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，通常會(huì)造成其他病原體的繼發(fā)感染與混合感染，如副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis， HPS）和豬支原體肺炎（Mycoplasma suis pneumonia， MHP）等，且混合感染對于疾病的嚴(yán)重程度有協(xié)同作用，例如PCV2為基礎(chǔ)病導(dǎo)致的 HPS 和MHP 混合感染會(huì)引起更加嚴(yán)重的肺炎，癥狀多為流鼻涕、氣短、發(fā)熱、咳嗽等，發(fā)病程度、致病性和死亡率均有所提高[14]。斷奶仔豬的大量死亡會(huì)使養(yǎng)殖場面臨巨大的經(jīng)濟(jì)損失，影響?zhàn)B豬業(yè)供需平衡。因此，精確診斷疾病的混合感染情況對疾病的治療和預(yù)防具有重要意義。本研究針對山西省呂梁市中陽縣某豬場引進(jìn)的保育仔豬大量出現(xiàn)的急性死亡、關(guān)節(jié)發(fā)炎、呼吸困難、高熱等癥狀，通過臨床檢查和剖檢癥狀檢查，結(jié)合病毒檢測，確診為PCV2 和 HPS 混合感染，根據(jù)診斷結(jié)果提出了具體的治療和預(yù)防措施，病豬群無新增發(fā)病率和新增死亡率，有效控制了病原的傳播，為后期該類疾病的防治提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑及儀器有核酸提取試劑盒（病毒DNA/RNA）（科前，武漢）、核酸保存液（凡濟(jì)，上海）、ASFV 實(shí)時(shí)熒光 PCR 核酸檢測試劑盒（明日達(dá)，北京）、CSFV核酸檢測試劑盒（明日達(dá)，北京）、PRRSV核酸檢測試劑盒（明日達(dá)，北京）、PRV核酸檢測試劑盒（明日達(dá)，北京）、PCV2 核酸檢測試劑盒（明日達(dá)，北京）、HPS 實(shí)時(shí)熒光 PCR 核酸檢測試劑盒（明日達(dá)，北京）、全自動(dòng)組織研磨儀（凈信，上海）、CFX96實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測系統(tǒng)（伯樂，美國）。

1.2 發(fā)病背景

山西省呂梁市中陽縣某豬場從山東某地購買40日齡仔豬600余頭，在豬場內(nèi)隔離1周后出現(xiàn)高熱（39.5～40 ℃）、精神不振、食欲減退，個(gè)別豬皮膚潮紅、被毛凌亂；發(fā)病后期，關(guān)節(jié)腫脹、后肢運(yùn)動(dòng)困難，頻繁咳嗽并伴有腹式呼吸、呼吸頻率加快等呼吸困難癥狀；通常站立不起并發(fā)生抽搐后死亡，死亡時(shí)口吐白沫；發(fā)病率為40%，死亡率高達(dá)65%。發(fā)病期間，使用恩諾沙星、替米考星和磺胺嘧啶鈉進(jìn)行注射治療，治療效果并不理想。購買仔豬前，未檢測病原及抗體病。病豬發(fā)生高熱和死亡后，將抽出的血液送至滄州邁克拜爾生物科技有限公司動(dòng)物疫病檢測中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測。

1.3 送檢病豬臨床剖檢癥狀

送檢病豬不愿走動(dòng)、精神沉郁，皮膚黏膜紫紺、喘息，體溫40.5 ℃，腹股溝淋巴結(jié)腫大，關(guān)節(jié)一側(cè)腫大。隨后無菌采集病豬并帶回實(shí)驗(yàn)室，對送檢病豬進(jìn)行頸動(dòng)脈放血處死，剖檢各組織的病變情況。

1.4 病料采集及病毒核酸提取

無菌采集適量的血液和淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟組織，組織放置于裝有 1 mL 病毒核酸保存液的無酶 EP 管內(nèi)，使用全自動(dòng)組織研磨儀研碎后，離心5 min（8 000 r·min-1），取 200 μL上清液進(jìn)行病毒核酸提取；依次加入蛋白酶 K10 μL和裂解液 200 μL，溫度55 ℃，孵育裂解 10 min；再加入 200 μL核酸結(jié)合液混勻，放入吸附柱中，離心60 s（13 000 r·min-1）；加入500 μL漂洗液后離心（13 000 r·min-1），重復(fù)1次，轉(zhuǎn)移至1.5 mL無酶 EP 管內(nèi)，開蓋常溫放置 3～5 min，直至過濾膜充分干燥；加入 50 μLDEPC水，室靜置30～60 s后，離心（12 000 r·min-1）60 s，收集核酸于-20 ℃條件下保存。

1.5 可疑病原的核酸檢測

根據(jù) ASFV （批號：20221039）、CSFV （批號：20211024）、PRRSV （批號：20211110）、PRV （批號：20211006）、PCV2 （批號：20211005）和 HPS （批號：20211115）實(shí)時(shí)熒光 PCR 核酸檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用Bio rad CFX 96 實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測系統(tǒng)檢測可疑病原核酸。

1.6 實(shí)施綜合防治措施后豬群發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計(jì)

本研究檢出陽性病原，將免疫治療方案和消毒程序做出相應(yīng)調(diào)整，綜合防治1周后，統(tǒng)計(jì)未發(fā)病仔豬總體數(shù)量、新增發(fā)病仔豬數(shù)量、新增死亡仔豬數(shù)量，計(jì)算新增發(fā)病率和新增死亡率，分析防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及剖檢結(jié)果

從臨床癥狀可明顯觀察到病豬左后肢關(guān)節(jié)腫脹，病豬剛開始為側(cè)臥，驅(qū)趕時(shí)發(fā)出尖叫聲，驚嚇起身后單側(cè)跛行前行（圖1-A）。對送檢病豬進(jìn)行頸動(dòng)脈放血處死，剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔、腸道表面和間隙出現(xiàn)淡黃色蛋皮樣纖維素性滲出物，心臟表面也有少量的滲出物和偽膜，心葉出血嚴(yán)重并實(shí)質(zhì)性病變；肺臟病變嚴(yán)重，肺間葉出血嚴(yán)重并實(shí)質(zhì)性病變，內(nèi)部氣體充實(shí)，切面有漿液滲出物，呈現(xiàn)較為典型的“橡皮肺”，非對稱性，因此未檢測出豬肺炎支原體（如圖1-B）；腸系膜淋巴結(jié)呈“葡萄串”樣[15]，圖1- C 、圖1- D 可見腹腔和腸壁有淡黃色纖維性滲出物，腸道已出現(xiàn)粘連，屬于典型的 HPS 感染。

2.2 檢測結(jié)果與分析

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法檢測血清、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)中的病毒，共檢測5種疑似病毒類疾病核酸（ASFV、PRRSV、CSFV、PRV和PCV2）和1 種細(xì)菌類疫病核酸（HPS）。檢測結(jié)果顯示，前4種病毒類核酸在5個(gè)組織中均為陰性，PCV2病毒在5個(gè)組織中均為陽性，HPS 在肺臟、淋巴結(jié)和血清中為陽性，因此確診為 PCV2 和 HPS 混合感染（圖2）。PCV2 檢測結(jié)果顯示，在血清中病毒核酸含量較低（CT 值為36.21），組織中淋巴結(jié)病毒核酸含量最高（CT 值為24.66），詳細(xì)病毒核酸含量數(shù)據(jù)見表1；HPS 檢測結(jié)果顯示，在淋巴結(jié)中細(xì)菌核酸含量最高（CT 值為27.18），血清中細(xì)菌核酸含量最低（CT 值為34.04），詳細(xì)細(xì)菌核酸含量數(shù)據(jù)見表1。

2.3 實(shí)施綜合防治措施后豬群發(fā)病率和死亡率

在病豬中檢測出PCV2 和 HPS 混合感染后，通過改善環(huán)境、調(diào)整消毒程序和對癥用藥等措施，1周后仔豬的新增發(fā)病率由40%下降至12.01%，新增死亡率由65%下降至29.73%。隨著用藥時(shí)間的延長，新增發(fā)病率和新增死亡率有逐步下降的趨勢。用藥13 d后，發(fā)病率和死亡率降至零，PCV2 和 HPS 混合感染的病情得到有效控制（如表2所示）。

3 討論與結(jié)論

本研究根據(jù)臨床癥狀觀察、解剖后各臟器的病理變化，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室先進(jìn)的分子技術(shù)診斷，最終確定該豬場保育仔豬出現(xiàn)大規(guī)模的急性死亡的原因是以PCV2為基礎(chǔ)病導(dǎo)致的病豬機(jī)體天然免疫力降低，繼發(fā)感染 HPS。依據(jù)診斷結(jié)果，豬場應(yīng)避免低溫、潮濕等惡劣環(huán)境，保證適宜仔豬生長的溫濕度和衛(wèi)生條件，及時(shí)調(diào)整免疫治療方案和消毒程序，在病豬隔離和空豬舍全面消毒的基礎(chǔ)上，全群緊急補(bǔ)免勃林格 PCV2 基因工程疫苗，發(fā)病豬使用泰樂菌素、磺胺嘧啶鈉和強(qiáng)力霉素注射治療，連續(xù)用藥1周，并加入黃芪多糖等中藥進(jìn)行保健治療，并在飼料中摻入適量益生菌，提高機(jī)體天然免疫力。綜合防治13 d后，豬群發(fā)病率和死亡率均降至0，證明2 種病原在豬場內(nèi)的感染和傳播已得到基本控制。

研究表明，HPS 寄生在豬鼻、咽、喉上呼吸道內(nèi)，通過空氣傳播感染，對斷奶后10 d左右的仔豬尤為敏感[16-17]。在豬群中，HPS 的致病作用影響其他多種全身性疾病的嚴(yán)重程度，如HPS與支原體肺炎混合感染，會(huì)加深肺部炎癥的發(fā)病程度，同時(shí)加快呼吸道綜合征的發(fā)病速度[18-20]。HPS 的血清型眾多，目前有15 種以上血清型，且20%分離株尚無法定型，各血清型之間的交叉免疫保護(hù)較低[21]。因此，實(shí)驗(yàn)室需檢測并確定HPS的血清型。

面對當(dāng)前豬病種類繁多、臨床癥狀不明顯、隱形感染和混合感染的情況下，在現(xiàn)代豬病診斷過程中，基層獸醫(yī)往往根據(jù)臨床癥狀或剖檢結(jié)果進(jìn)行診斷確診，之后使用大量藥物和抗生素進(jìn)行治療，常導(dǎo)致治療效果不理想、疾病反復(fù)發(fā)生、養(yǎng)殖戶花費(fèi)巨大。由于忽視了PCV2 和 PRRSV 等免疫抑制類基礎(chǔ)性病毒病的存在，無法做到有效的免疫防控。因此，當(dāng)前豬病的診斷，在具備豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的同時(shí)，必須結(jié)合高靈敏性、高準(zhǔn)確率的實(shí)驗(yàn)室診斷（如熒光 PCR 技術(shù)和數(shù)字 PCR 技術(shù)）。在診斷過程中，樣品采集的類型也非常重要。由本研究各器官檢測數(shù)據(jù)可以看出，不同類型病毒和細(xì)菌在不同組織中的載量并不相同，如 PCV2 在免疫器官（淋巴結(jié)、脾臟）、實(shí)質(zhì)性器官（腎臟）和功能性器官（肺臟）中載量均較高，而在血清中載量較低，這與該病毒的組織嗜性有關(guān)，且結(jié)果印證了 PCV2 感染嚴(yán)重時(shí)可引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。本案例中，雖然HPS 臨床表現(xiàn)較嚴(yán)重，但僅可在肺臟和淋巴結(jié)中檢出且載量較高，在血清中載量較低，這一結(jié)果也同樣印證了該類細(xì)菌的組織嗜性。以上結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室診斷過程中，病料樣品采集的類型是影響診斷結(jié)果的關(guān)鍵性因素。因此，在使用如熒光 PCR 等實(shí)驗(yàn)室診斷檢測方法的同時(shí)，需加強(qiáng)前期樣品采集的培訓(xùn)與經(jīng)驗(yàn)，尤其是針對一些病原載量低或呈現(xiàn)感染的病例進(jìn)行診斷檢測時(shí)，樣品的采集很大程度上決定了診斷檢測的正確性。對于細(xì)菌分離鑒定存在檢測周期長、人為因素影響較大等缺點(diǎn)，本研究采用的熒光 PCR 檢測方法可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏檢測，是細(xì)菌性疾病診斷的新技術(shù)。

引種時(shí)，養(yǎng)殖場必須對引種豬群做全面的檢測，清楚了解引種豬群的健康狀況，避免引入新的病原。引種入場隔離期間，應(yīng)加入抗應(yīng)激類藥物，做好豬群日常保健，降低應(yīng)激反應(yīng)，提高天然免疫力；對于異常豬快速診斷并迅速處置，避免傳染性病原在豬群內(nèi)擴(kuò)散傳播。同時(shí)，加強(qiáng)隔離圈舍內(nèi)外消毒等，在確保新引種豬群健康的情況下方可混群。

PCV系列和HPS感染是仔豬生長階段常發(fā)生的2種疾病，其流行性均與不良應(yīng)激顯著相關(guān)，尤其是和豬舍衛(wèi)生、溫濕度、豬群數(shù)量、空氣環(huán)境等關(guān)系密切。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引進(jìn)保育豬的出生豬場規(guī)模較大，但豬場基礎(chǔ)設(shè)施條件較差。尤其是仔豬場的養(yǎng)豬設(shè)施較為陳舊，防寒措施未能及時(shí)跟進(jìn)，保溫效果不理想，新豬舍環(huán)境保溫較好，與之前豬舍相比溫差太大，導(dǎo)致引種保育豬寒冷應(yīng)激。分析結(jié)果顯示，本次疫情中，仔豬生病死亡的誘因是不良應(yīng)激反應(yīng)，PCV和HPS感染則是引起豬場仔豬死亡的直接原因。根據(jù)調(diào)查結(jié)果，筆者給出了有效的治療方案，疫病感染和傳播得到基本控制。筆者認(rèn)為，臨床診斷結(jié)合熒光 PCR 檢測方法可快速、靈敏確診病例。豬場養(yǎng)殖豬群中，HPS感染的主要原因是各種不良應(yīng)激。因此，在仔豬養(yǎng)殖過程中，應(yīng)避免各類惡劣環(huán)境引起豬群不良應(yīng)激，危害豬群健康。此外，基于科學(xué)、準(zhǔn)確診斷后的疫苗免疫防治也是一種防控傳染病的安全、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的技術(shù)措施，依據(jù)豬場的狀況合理運(yùn)用，可有效避免傳染性疾病的大規(guī)模發(fā)生。

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