摘" 要： 選用水稻、碗蓮及梭魚草為實驗材料，研究了無磷洗衣粉對于喜水植物生長及其種子萌發(fā)的影響. 實驗設5個處理，即清水對照、2種低濃度無磷洗衣粉溶液（質量分數(shù)0.02％，0.05％）和2種高濃度無磷洗衣粉溶液（質量分數(shù)0.10％，0.30％）. 研究發(fā)現(xiàn)：（1） 隨著無磷洗衣粉濃度的增大，碗蓮和水稻種子發(fā)芽率降低，芽長縮短，根系生長停滯、萎縮，根尖變黑，發(fā)育性狀變差；（2） 隨著無磷洗衣粉溶液濃度增大，梭魚草植株高度變矮，葉片發(fā)黃，健康程度下降，生長受到抑制，植株有枯萎跡象. 選取2個與水稻根部生長發(fā)育有關的基因OsDREB2B和OsARF12，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過無磷洗衣粉溶液處理的水稻幼苗根系中，這兩個基因的表達量明顯低于清水組. 研究結果表明：無磷洗衣粉對喜水植物生長及其種子萌發(fā)有抑制作用，無磷洗衣粉并非是含磷洗衣粉的完美替代，依然對生態(tài)有著副作用，需要進一步開發(fā)環(huán)境友好型替代產(chǎn)品.

關鍵詞： 無磷洗衣粉； 喜水植物； 萌發(fā)率； 生長； 生理指標

中圖分類號： Q 947.9" " 文獻標志碼： A" " 文章編號： 1000-5137（2024）06-0763-09

The effect of nonphosphorus washing powder on the germination and growth of hydrophilous plant seeds

LIU Rong1?， TAN Haotian2?， ZHENG Si2*， MING Feng1*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China；

2.Shanghai High School， Shanghai 200237， China）

Abstract： In order to explore the effects of nonphosphorus washing powder on different hydrophilous plants， rice （Oryza sativa L.）， water lily （Nelumbo noucifera Gaertn） and Pontederia cordata L. were selected as experimental materials to study the effects of nonphosphorus washing powder on the growth and seed germination of hydrophilous plants. Five treatments were set up in the experiment， namely， clean water control， two low concentration solution （mass fraction 0.02%， 0.05%） and two high concentration solution （mass fraction 0.10%， 0.30%） of nonphosphorus washing powder. The results showed that： （1） With the increase of nonphosphorus washing powder concentration， the germination rate of water lily and rice seeds decreased， the bud length shortened， the root growth stagnated and shrank， the root tip turned black， and the development characteristics became worse； （2） With the increase of the concentration of phosphate-free washing powder solution， the height of the plant became shorter， the leaves turned yellow， the health of the plant declined， the growth was inhibited， and the plant showed signs of wilting. Two genes related to the growth and development of rice roots， OsDREB2B and OsARF12， were selected. It was found that the expression levels of these two genes in the roots of rice seedlings treated with nonphosphate washing powder solution were significantly lower than those in the clean water group. The results show that nonphosphorus washing powder can inhibit the growth and seed germination of water-loving plants. Nonphosphorus washing powder is not a perfect substitute for phosphorus-containing washing powder， but still has side effects on the ecology. So it is necessary to further develop environmentally friendly alternative products.

Key words： nonphosphate laundry detergent； hydrophilous plant； germination rate； growth； physiological index

0" 引 言

含磷洗衣粉中大量使用三聚磷酸鈉，含磷污水被排放到河流湖泊中后會使水中的磷含量升高，水體出現(xiàn)富營養(yǎng)化［1］，導致水生生物過量繁殖，生態(tài)失衡［2］. 世界各國紛紛采取限磷、禁磷措施，以保護人類賴以生存的水域環(huán)境［3］. 例如20世紀70年代中期，日本家用洗衣粉帶入湖泊等地表水中的磷的比例普遍較高（質量分數(shù)20%左右），為此，日本各地方政府采用政策法規(guī)限制（如日本茲賀縣《琵琶湖富營養(yǎng)化防止條例》等），逐步削減家用洗衣粉中的磷含量，至1988年，日本無磷洗衣粉的產(chǎn)量已占洗衣粉總產(chǎn)量的97%（其中98%的無磷洗衣粉是以4A沸石為助劑），成為至1998年世界上洗滌劑行業(yè)中無磷化程度最高的國家之一［4］.

有研究者根據(jù)《地表水環(huán)境質量標準》（GB 3838—2002）中的規(guī)定［5-7］，在2019—2021年對上海奉賢海灣旅游區(qū)的15條河道、18個斷面，根據(jù)各項水質檢測指標的數(shù)據(jù)大小進行分析研究. 結果表明：2020年彭公塘水中總磷（TP）的含量最高，推測原因是周邊居民存在在河道內(nèi)進行日常清洗活動的現(xiàn)象. 2021年金匯塘水中的TP含量較2020年的有所上升，這可能是因為有一定量的含磷有機物被排入河內(nèi)［2］. 這些現(xiàn)象均導致了河道水質惡化.

無磷洗衣粉不含或少量含磷，對環(huán)境的污染小［8］，是當今洗滌劑發(fā)展的主流. 但是也有一些學者對無磷洗衣粉改善環(huán)境的有效性提出了質疑：大量使用無磷洗衣粉是否會對農(nóng)業(yè)環(huán)境造成危害呢？一項對不同濃度無磷洗衣粉溶液對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長及生理指標的研究［9］指出：高濃度（質量分數(shù)0.08%～0.20%）處理的幼苗根部表現(xiàn)畸形，如初生根在伸出后第2到第3天內(nèi)出現(xiàn)生長停滯、萎縮，根尖變黑，無次生根生長等現(xiàn)象，同時其葉綠素含量降低. 目前，以無磷洗衣粉溶液對喜水植物的生長影響為研究對象的課題少之又少，而在我國農(nóng)村地區(qū)，仍然有很多以河水作為直接灌溉的水源，而同時，這些河流也是村民洗衣服的用水地［10］. 因此，本文選取具有代表性的水生植物，研究了各濃度無磷洗衣粉溶液對于喜水植物生長及其種子萌發(fā)的影響，以期為今后相關研究提供參考.

1" 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取水生草本植物：水稻（Oryza sativa L.）、挺水植物碗蓮（Nelumbo nucifera Gaertn），以及濕生草本植物梭魚草（Pontederia cordata L.）作為實驗對象；無磷洗衣粉品牌為白貓；水源地點為上海師范大學植物種質資源中心桃源樓周邊河水.

1.2 儀器與設備

天平、直尺、光照培養(yǎng)箱；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀器，植物總RNA使用AG植物RNA提取試劑盒提取，試劑盒從Accurate Biology購買. cDNA的逆轉錄使用Vazyme反轉錄試劑盒；SYBR GreenⅠfluorescent dye實時熒光定量PCR試劑，均從Vazyme購買.

1.3 實驗分組和處理

實驗設計為單因素實驗，分對照組和處理組. 實驗分別稱取0.02，0.05，0.10，0.30 g的無磷洗衣粉，定容至1 000 mL，從而得到3組共5個不同濃度無磷洗衣粉溶液，即A清水對照，B低濃度（0.02％，質量分數(shù)，下同），C 低濃度（0.05％），D高濃度（0.10％），E 高濃度（0.30％）的無磷洗衣粉溶液（表1）.用精密pH儀（賽多利斯）測定其pH值，清水對照的pH值為7.00. 再用質量分數(shù)為5%的HCl溶液將B～E的溶液pH值調至7.00，即可得到中性無磷洗衣粉溶液.

1.4 實驗對照

碗蓮和水稻種子均選出質量相近的150顆，A～E處理每組30顆. 每組設3次重復，每次10顆.

將梭魚草植株移栽放至室外裝有磨碎濕潤土壤的花盆中，分別進行A～E處理，每組5次重復.

1.5 種子萌發(fā)

碗蓮萌發(fā)實驗：將裝有碗蓮種子的培養(yǎng)瓶放入光照培養(yǎng)箱， 間隔2～3 d換水1次，持續(xù)4周. 1周后種子發(fā)芽時第一次進行萌發(fā)率統(tǒng)計，每組取3個測量芽長，取平均值作為該組當天的萌發(fā)芽長，其后每隔1周統(tǒng)計一次萌發(fā)率，連續(xù)統(tǒng)計3周.

水稻萌發(fā)實驗：將裝有水稻種子的培養(yǎng)瓶放入光照培養(yǎng)箱，進行發(fā)芽實驗，每隔1 d換水1次，持續(xù)2周. 第1周內(nèi)，每次換水統(tǒng)計一次萌發(fā)率.

1.6 植株生長

將梭魚草植株進行移栽放在室外生長，栽于裝有磨碎濕潤土壤的花盆中，成熟后分為A～E共5組. 用清水及各濃度中性洗衣粉溶液按600 mL/盆每隔2～3 d澆灌一次， 連續(xù)澆灌8周（具體看植物長勢狀況）. 每周進行一次記錄，用游標卡尺、直尺、紙、背景板和筆進行測量拍照，每組取3株記錄植株高度（株高），取平均值作為當天的株高，最后整理和統(tǒng)計.

1.7 生理指標的測定

1.7.1 碗蓮種子發(fā)芽率的測定

發(fā)芽率為已發(fā)芽種子數(shù)占供試種子總數(shù)的百分比（第4天測定1次，第8天測定1次）.

1.7.2 碗蓮鮮重測定

碗蓮發(fā)芽4周后，每組取4個碗蓮幼苗，每周測定1次鮮重，持續(xù)3周.

1.7.3 水稻地上長度測定

水稻發(fā)芽后，每組取5個水稻幼苗，1周后測定其地上部分長度. 培養(yǎng)生長發(fā)育后再次測定水稻植株地上部分長度.

1.7.4 梭魚草株高測定

每周每組取3株梭魚草，測量株高，取其平均值作為當天的株高記錄.

1.8 RNA提取和實時熒光定量PCR

水稻萌發(fā)1周后，在清水組與低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的幼苗中選取樣本，放入液氮中冷凍，研磨成粉末，使用植物 RNA 提取試劑盒提取該材料的RNA（-80 ℃保存），用逆轉錄試劑盒逆轉錄出其cDNA；選取2個根部與生長發(fā)育有關的基因OsDREB2B［11］和OsARF12［12］，利用NCBI數(shù)據(jù)庫設計基因特異性全長引物及定量引物，將引物、SYBR Green染料定量PCR 預混液和模板cDNA按比例混合，并定量滴入Real-time Quantitative PCR Detecting System 96 孔板，置于Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction儀進行反應；將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、對比. 使用的相關引物列于表2.

1.9 數(shù)據(jù)處理

用 Excel 進行數(shù)據(jù)整理與分析，用Excel和Prism進行制圖. 用Student’s t-test進行顯著性檢驗和分析。*表示有統(tǒng)計學差異（plt;0.05），**表示有顯著統(tǒng)計學差異（plt;0.01），***表示有極其顯著的統(tǒng)計學差異（plt;0.001）.****表示有非常顯著的統(tǒng)計學差異（plt;0.000 1）.

2" 實驗結果

2.1 無磷洗衣粉對碗蓮種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

按1.5節(jié)方法測得碗蓮萌發(fā)芽長，實驗數(shù)據(jù)表明，清水組的碗蓮種子萌發(fā)最好. 從碗蓮開始發(fā)芽至3周后，觀察其長勢可知，隨著無磷洗衣粉溶液濃度升高，碗蓮萌發(fā)率降低. 經(jīng)低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的幼苗顏色變深，隨著無磷洗衣粉增加，幼苗生長速度逐漸變慢，如圖1（a）所示；經(jīng)高濃度無磷洗衣粉溶液（0.10％，0.30％）處理的幼苗根部表現(xiàn)畸形，改變根的生長方向，如初生根在伸出1周后生長停滯、萎縮、根尖變黑，與高濃度家用含磷洗滌劑能抑制綠豆種子萌發(fā)［9］實驗結論一致. 1周后進行統(tǒng)計萌發(fā)率，高濃度組（0.30％）的碗蓮萌發(fā)率約為53%，明顯低于清水組的萌發(fā)率（87%），這與含磷洗衣粉和肥皂溶液能抑制空心菜和香瓜種子萌發(fā)和幼苗生長［9］的結論一致. 如圖1（b）所示，表明一定濃度的無磷洗衣粉溶液對碗蓮種子的萌發(fā)都具有抑制作用.

由圖2可知：無磷洗衣粉溶液濃度越高，碗蓮種子芽長越短；用低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的幼苗長度明顯減少，幼苗難以伸長；用高濃度無磷洗衣粉溶液（0.10％，0.30％）處理的幼苗停滯、萎縮，不超過10 cm. 高濃度組的碗蓮幼苗芽長約為5 cm，遠低于清水組的幼苗平均芽長（約40 cm）.

碗蓮發(fā)芽4周后，每組取4個碗蓮幼苗，每9 d測定1次鮮重，持續(xù)3次，如圖3（a）～3（c）所示，無磷洗衣粉溶液濃度越高，碗蓮鮮重越小. 清水組的碗蓮長勢最好，低濃度組次之，高濃度組鮮重明顯低于其他組碗蓮，如圖3（d）所示. 清水組碗蓮仍保持生長狀態(tài)，而高濃度組生長緩慢，甚至接近死亡，如圖3（c）所示.

2.2 無磷洗衣粉對盆栽梭魚草植株的影響

將生長成熟的梭魚草用清水及各種濃度洗衣粉溶液按600 mL/盆，隔2～3 d澆灌1次，連續(xù)澆灌8周，每周記錄其生長狀況，如圖4（a）所示. 經(jīng)過8周后，比較各組植株生長狀況，觀察到隨著無磷洗衣粉溶液濃度的升高，植株每周生長高度逐漸降低，如圖4（c）所示. 經(jīng)低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的葉片有發(fā)黃現(xiàn)象，植株有不同程度的枯萎；經(jīng)高濃度無磷洗衣粉溶液（0.10％，0.30％）處理的植株低矮，從未有花，葉片稀疏，枯萎嚴重. 其中，E組（0.30%）的生長狀況極差，株高只有清水組的2/3左右. 第8周時，每組取5片葉片，觀察其葉片，如圖4（b）所示. 結果表明，隨著無磷洗衣粉溶液濃度升高，葉片葉綠素含量降低. 經(jīng)低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的葉片相比于清水組，葉片健康狀態(tài)降低，葉片有發(fā)黃現(xiàn)象；經(jīng)高濃度無磷洗衣粉溶液（0.10％，0.30％）處理的植株葉片健康狀況明顯下降，生長受到抑制，葉片發(fā)黃嚴重. 本研究結果與洗衣粉水溶液對3種水生植物（海菜花、黑藻、金魚藻）的生長繁殖狀況是隨著洗衣粉水溶液濃度的增加也逐漸惡化［13］的結論一致. 以上結果說明，無磷洗衣粉溶液對梭魚草的生長發(fā)育和光合作用具有抑制作用.

2.3 無磷洗衣粉對水稻種子萌發(fā)和植株生長影響的機理探究

按1.5節(jié)方法萌發(fā)水稻種子，并按1.7節(jié)方法測量其生長指標，結果如圖5所示. 無磷洗衣粉溶液濃度越高，水稻萌發(fā)率越低，芽長長度縮短，如圖5（a）所示. 經(jīng)低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的幼苗顏色變深，根系和幼苗較短；經(jīng)高濃度無磷洗衣粉溶液（0.10％，0.30％）處理的幼苗根部極端，無法伸長，初生根生長停滯、萎縮，如圖5（b）所示. 低濃度的無磷洗衣粉對小麥幼苗生長的影響小于高濃度，高濃度的無磷洗衣粉處理明顯抑制小麥幼苗的生長［9］. E組（0.30％）的水稻萌發(fā)率約為40%，如圖5（c）所示，顯著低于清水組的萌發(fā)率（100%）. 這與以前報道提出過度使用無磷洗衣粉依然會對植物產(chǎn)生不良影響［14］的結果接近. 以上結果說明，無磷洗衣粉溶液對碗蓮種子的萌發(fā)具有抑制作用.

水稻萌發(fā)1周后，每組取5個水稻幼苗，測定其地上部分長度，結果如圖6（a）～6（e）所示. 培養(yǎng)生長發(fā)育后再次測定水稻植株地上部分長度，如圖6（f）所示. 隨著無磷洗衣粉溶液濃度的升高，水稻地上部分長度減少，株高降低. 經(jīng)培養(yǎng)后，清水組地上部分長度遠超過其他組，B組（0.02%）組次之，E組（0.30％）最差. 高濃度組的水稻地上部分平均長度不足3 cm，遠低于清水組的25 cm.

水稻萌發(fā)1周后觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度無磷洗衣粉溶液處理下，水稻根系部分生長差異顯著. 為了進一步探究其機制，在經(jīng)清水組與低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理1周后的幼苗中選取根系樣本，選取2個根部與生長發(fā)育有

關的基因OsDREB2B和OsARF12，通過定量PCR測定基因表達量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低濃度無磷洗衣粉溶液（0.02%，0.05%）處理的幼苗中，這2個基因的表達量明顯小于清水組，且C組（0.05%）的表達量小于B組（0.02%），具有顯著性差異，如圖7所示. 以上結果說明：無磷洗衣粉溶液對水稻種子的萌發(fā)及其幼苗根系的發(fā)育具有抑制作用.

3" 結 論

本文選取具有代表性的水生植物碗蓮、水稻和梭魚草，配制了不同濃度的無磷洗衣粉溶液，研究了各濃度無磷洗衣粉溶液對于喜水植物生長及其種子萌發(fā)的影響. 試驗結果表明，不同濃度的無磷洗衣粉溶液對種子萌發(fā)和幼苗生長有抑制作用，通過定量PCR測定基因表達量，發(fā)現(xiàn)低濃度無磷洗衣粉溶液處理的幼苗中與生長發(fā)育有關的基因表達量小于清水組，高濃度組的表達量小于低濃度組，且都具有顯著性差異.另外，隨著無磷洗衣粉溶液濃度的升高，梭魚草不僅株高減少，其葉片生長及健康狀況也逐步降低. 以上結果說明：無磷洗衣粉并非含磷洗衣粉完美的替代品，依然對生態(tài)環(huán)境有不利影響，解決洗滌劑廢液對于自然環(huán)境的影響，還是應該從少用、減量上入手.

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（責任編輯：顧浩然）