摘""要：秋石斛（Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium）花姿優(yōu)美、花色豐富，是熱區(qū)重要觀賞植物，具有極高的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。本研究以秋石斛雜交種迷你（Den."Yaya"Victoria）、水蜜桃（Den."Swirl）、三亞陽光（Den."Sonia"Hiasakul）原球莖和無菌苗幼嫩莖段為外植體，探討不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不同品種秋石斛胚性愈傷誘導(dǎo)、不定芽分化及植株再生的影響。結(jié)果表明：在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，原球莖和生長(zhǎng)2個(gè)月的幼苗莖段作為外植體誘導(dǎo)效果最佳，暗培養(yǎng)30"d即可獲得胚性愈傷。3個(gè)品種的愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是以MSD（MS+30"g/L葡萄糖+1"g/L花寶1號(hào)+8"g/L瓊脂）為基本培養(yǎng)基，添加0.5"mg/L"KT和0.2～0.5"mg/L"2，4-D。迷你、水蜜桃、三亞陽光的胚性愈傷誘導(dǎo)率最高分別為31.11%、22.78%和50%，其中迷你品種僅需15"d即可獲得胚性愈傷。最佳胚性愈傷增殖培養(yǎng)基為MSD+0.5"mg/L"IBA+"0.5"mg/L"KT，胚性愈傷狀態(tài)保持良好且不發(fā)生分化，增殖倍數(shù)0.9。最佳分化培養(yǎng)基為1/2"MS+0.5"mg/L"IBA+0.15"mg/L"KT，在光照條件下，接種后的胚性愈傷組織能夠快速誘導(dǎo)形成芽點(diǎn)，30"d內(nèi)分化形成2～3片葉的幼苗，相同培養(yǎng)基中保持60"d能夠自行生根獲得完整再生苗。最佳生根培養(yǎng)基為1/2"MS+30"g/L蔗糖+0.5"mg/L"NAA+8"g/L瓊脂，生根率為100%，平均生根數(shù)5條，根長(zhǎng)約1.3"cm。本研究所使用的胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和分化培養(yǎng)基具有一定的廣譜性，可為后續(xù)秋石斛胚再生途徑及分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：秋石斛；莖段；胚性愈傷；植株再生中圖分類號(hào)：S682.31"""nbsp;""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Establishment"of"Embryogenic"Callusnbsp;Induction"and"Regeneration"System"for"Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium

LI"Zhiqing1，2，"LI"Yamei2，3，5*，"LI"Chonghui2，3，"YIN"Junmei2，3，4*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Tropical"Crop"Germplasm"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Crop"Gene"Resources"and"Germplasm"Enhancement"in"Southern"China，"Ministry"of"Agriculture"amp;"Rural"Affairs"/"Key"Laboratory"of"Tropical"Crops"Germplasm"Resources"Genetic"Improvement"and"Innovation"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Engineering"Technology"Research"Center"of"Tropical"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"4."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572330，"China;"5."Haikou"Experiment"Station，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium"is"an"important"ornamental"plant"in"tropical"area"and"has"high"market"values，"with"beautiful"flower"appearance"and"abundant"flower"colors."In"this"study，"the"protocorms"and"young"seedling’s"stem"segments"of"commercial"varieties，"Den."Yaya"Victoria，"Den."Swirl"and"Den."Sonia"Hiasakul，"were"used"as"the"explants."The"effects"of"different"phytohormone"combination"on"embryogenic"callus"induction，"adventitious"bud"differentiation"and"plantlet"regeneration"were"investigated."During"the"embryogenic"callus"（EC）"induction"stage，"the"best"induction"explants"were"protocorms"and"2-month-old"seedling"stem"segments"and"EC"could"be"obtained"after"30"days"culture"in"dark"condition."The"best"medium"for"EC"induction"of"was"MSD"（MS+30"g/L"glucose+1"g/L"Hyponex+8"g/L"agar）"as"the"basic"medium"with"0.5"mg/L"KT"and"0.2-0.5"mg/L"2，4-D."The"highest"average"induction"rate"of"EC"was"31.11%，"22.78%，"and"50%"for"Den."Yaya"Victoria，"Den."Swirl"and"Den."Sonia"Hiasakul，"and"the"induction"time"for"Den."Yaya"Victoria"was"only"15"days"from"explants"to"EC."The"best"proliferation"medium"was"MSD+0.5"mg/L"IBA+0.5"mg/L"KT，"which"maintaining"EC"in"good"condition"without"differentiation"and"the"multiplication"rate"was"0.9."The"best"medium"for"differentiation"was"1/2"MS+0.5"mg/L"IBA+0.15"mg/L"KT"under"light"condition"of"16"h"one"day，"EC"quickly"differentiating""and"forming"2-3"leaf"adventitious"buds"within"30"days，"and"finally"regenerating"into"plantlet"after"60"days"in"the"same"medium."The"best"rooting"medium"was"1/2"MS+30"g/L"sugar+0.5"mg/L"NAA+8"g/L"agar，"with"rooting"rate"100%"and"five"roots"in"length"1.3"cm"per"plantlet."In"this"research，"the"EC"induction，"proliferation"and"differentiation"media"have"a"wide-spectrum"and"the"EC"regeneration"pathway"could"lay"a"solid"foundation"for"further"molecular"breeding"of"Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium.

Keywords："Phalaenopsis-hybrid"Dendrobium;"stem"segments;"embryogenic"callus;"plant"regeneration

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.009

秋石斛（Phalaenopsis-type"Dendrobium）花姿優(yōu)美，形似紛飛的蝴蝶，花色豐富，喜歡在高溫、多濕、陽光充足的熱帶環(huán)境中生長(zhǎng)和開花，花期長(zhǎng)且主要集中在秋冬季，是我國(guó)花卉市場(chǎng)常見的盆栽及切花植物。海南省因具有得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢(shì)，已發(fā)展為我國(guó)秋石斛的主產(chǎn)區(qū)[1]。近年來，秋石斛盆花在海南的栽種面積逐年擴(kuò)大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，海南每年出貨量達(dá)到500萬盆以上，占廣州該類花卉市場(chǎng)份額的95%以上。目前，我國(guó)秋石斛新品種培育主要通過雜交育種和誘變育種實(shí)現(xiàn)，而建立高效的胚性愈傷組織再生體系將有利于基因工程育種研究。

秋石斛常用組織培養(yǎng)方法是以種子播種獲得原球莖，再以無菌苗的莖段為外植體，誘導(dǎo)、分化、生根獲得再生植株是進(jìn)行工廠化育苗的理想手段[2]。此外，以優(yōu)良株系的莖段、莖尖、葉片、花梗等為外植體，經(jīng)過消毒處理，誘導(dǎo)類原球莖分化不定芽或誘導(dǎo)叢生芽進(jìn)行增殖、生根，從而獲得大量組培苗，也為秋石斛種苗繁育提供了技術(shù)支持[3-9]。蘭科植物現(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建主要以類原球莖為外植體，即通過器官發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株，由于原球莖已處于分化階段，因此該方法獲得純合轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)困難[10-11]，相比之下，胚性愈傷再生途徑遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的嵌合體較少，廣泛應(yīng)用于作物基因工程育種[12]。本研究以秋石斛雜交種迷你（Den."Yaya"Victoria）、水蜜桃（Den."Swirl）和三亞陽光（Den."Sonia"Hiasakul）來源的原球莖、無菌幼苗莖段為外植體，通過不同的基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合測(cè)試，進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)、增殖、分化及生根研究，以期建立高效的秋石斛胚性愈傷誘導(dǎo)及胚發(fā)生途徑再生體系，為秋石斛多倍體育種、體細(xì)胞雜交、突變體和無性系變異株系獲得及轉(zhuǎn)基因分子育種奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

本試驗(yàn)供試品種迷你、水蜜桃和三亞陽光果莢來源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶花卉研究中心種質(zhì)圃。基本培養(yǎng)基MS（Murashige"and"Skoog）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D、Kinetin、6-BA、NAA和IBA購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2""方法

除特殊說明外，本研究所用的秋石斛組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基（MSD）：MS+30"g/L葡萄糖+1"g/L花寶1號(hào)+8"g/L瓊脂，pH為5.8～6.0，121"℃高溫條件下滅菌20"min。組織培養(yǎng)條件：溫度25～"28"℃，環(huán)境相對(duì)濕度70%～80%，光照培養(yǎng)的光周期16"h/d，光照強(qiáng)度100"μmol/（m2·s）。

1.2.1""果莢消毒及無菌苗的獲取""取秋石斛的成熟果莢置于無菌組培瓶中，2%"NaClO3消毒15"min，無菌水清洗3～5遍；轉(zhuǎn)入95%乙醇潤(rùn)洗2～3"s后用酒精燈燒去多余乙醇，重復(fù)該步驟2～3次；最后將消毒后的果莢置于無菌平皿中，切開果莢，用無菌手術(shù)刀將種子接種至種子培養(yǎng)基（1/2"MS+3"g/L花寶1號(hào)+2"g/L蛋白胨+0.5"g/L活性炭+30"g/L蔗糖+8"g/L卡拉膠），1個(gè)月后即可獲得原球莖，2～3個(gè)月后獲得2～3葉期無菌幼苗。

1.2.2""外植體的選擇""選用迷你、水蜜桃和三亞陽光原球莖（生長(zhǎng)1～2個(gè)月）、莖段2（2～3葉期，生長(zhǎng)2～3個(gè)月，有2～3片葉）和莖段1（4～5葉期，生長(zhǎng)4～5個(gè)月，有4～5片葉）的無菌苗莖段作為外植體進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)。

1.2.3""胚性愈傷的誘導(dǎo)""用手術(shù)刀劃傷原球莖，無菌苗去除葉片取莖段幼嫩部分橫切，分別置于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM1～CIM7（MSD+0.5"mg/L"KT+0.1/0.2/0.3/0.4/0.5/1.0/2.0"mg/L"2，4-D）中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織，每個(gè)處理接種10皿，每皿9個(gè)外植體，30"d后觀察誘導(dǎo)效果并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率，篩選出最適宜胚性愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。以上每組實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)2次，胚性愈傷誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出胚性愈傷外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

1.2.4""胚性愈傷增殖""將誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷挑出，去除芽和多余組織，轉(zhuǎn)入胚性愈傷增殖培養(yǎng)基P1、P2、P3、P4中暗培養(yǎng)，30"d為1個(gè)繼代周期，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷增殖量并觀察是否發(fā)生分化。胚性愈傷增殖倍數(shù)=培養(yǎng)30"d后每皿胚性愈傷的體積/接種時(shí)胚性愈傷體積。胚性愈傷增殖培養(yǎng)基分別為P1：MSD+0.1"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"KT；P2：MSD+0.1"mg/L"2，4-D+0.1"mg/L"KT；P3：MSD+"0.5"mg/L"IBA+0.15"mg/L"KT；P4：MSD+0.5"mg/L"IBA+0.5"mg/L"KT。

1.2.5""胚性愈傷分化及植株再生""挑取嫩黃致密、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的胚性愈傷轉(zhuǎn)入如下F1和F2分化培養(yǎng)基中，30"d后觀察胚性愈傷分化情況并統(tǒng)計(jì)分化率，60"d后統(tǒng)計(jì)植株再生數(shù)。分化率=（分化出不定芽胚性愈傷數(shù)/胚性愈傷數(shù)）×100%；植株再生數(shù)=（再生不定芽胚性愈傷數(shù)/胚性愈傷數(shù)）。測(cè)試用分化培養(yǎng)基分別為F1：1/2"MS+3"mg/L"6-BA+1"mg/L"NAA；F2：1/2"MS+0.5"mg/L"IBA+"0.15"mg/L"KT。

1.2.6""不定芽生根""將生長(zhǎng)茁壯、體型良好的不定芽轉(zhuǎn)入R1和R2生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根試驗(yàn)，觀察不同生根培養(yǎng)基對(duì)秋石斛不定芽生根率、生根數(shù)及根長(zhǎng)的影響。待再生植株長(zhǎng)至4～5"cm后轉(zhuǎn)入以苔蘚為基質(zhì)的培養(yǎng)基中煉苗。測(cè)試用生根培養(yǎng)基分別為R1：1/2"MS+30"g/L蔗糖+0.5"mg/L"NAA；R2：1/2"MS+30"g/L蔗糖+0.5"mg/L"NAA+"0.5"mg/L"KT。

1.3""數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS"25進(jìn)行顯著性分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""外植體的選擇對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

以生長(zhǎng)無菌苗莖段1為外植體進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)（圖1），一個(gè)月后觀察發(fā)現(xiàn)，迷你、水蜜桃胚性愈傷組織平均誘導(dǎo)率分別為0.42%和0，且外植體容易誘導(dǎo)出芽，說明生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的無菌苗莖段不適于作為胚性愈傷誘導(dǎo)的外植體。采用原球莖和無菌苗莖段2為外植體，發(fā)現(xiàn)脫分化效果好，胚性愈傷誘導(dǎo)率高，誘導(dǎo)率約30%（表1）。不僅如此，迷你品種從接種到獲得胚性愈傷周期短，培養(yǎng)15"d后即出現(xiàn)胚性愈傷萌動(dòng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以原球莖和無菌苗莖段2為外植體不僅可以顯著提高胚性愈傷誘導(dǎo)效率，還可以縮短誘導(dǎo)周期。

2.2""植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

將無菌幼苗莖段2置于不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，1周內(nèi)未觀察到胚性愈傷萌動(dòng)現(xiàn)象，2周內(nèi)開始出現(xiàn)白色近透明的微小顆粒，一個(gè)月內(nèi)，這些微小顆粒隨著培養(yǎng)基中2，4-D濃度差異而發(fā)生不同的變化。在高濃度2，4-D（1、2"mg/L"2，4-D）培養(yǎng)基上，微小顆粒逐漸褐化或變成灰白色，小部分莖段誘導(dǎo)出不定芽，大部分莖段不能誘導(dǎo)出愈傷組織或不定芽，直接褐化或轉(zhuǎn)化為灰白色。繼續(xù)放置60"d后，觀察發(fā)現(xiàn)有少量新的愈傷從褐化的莖段上長(zhǎng)出，可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，2，4-D的濃度降低或功能活性減弱，對(duì)外植體的毒害作用減少。該研究結(jié)果說明，高濃度2，4-D并不適合秋石斛胚性愈傷誘導(dǎo)，外植體容易出現(xiàn)褐化、死亡現(xiàn)象。

在低濃度2，4-D（0.1～0.5"mg/L"2，4-D）培養(yǎng)基上，可以誘導(dǎo)出不定芽、白色或淡黃色的胚性愈傷組織。30"d后觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示迷你在CIM2（MSD+0.2"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"Kinetin）培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)效果最佳（圖2），胚性愈傷誘導(dǎo)率為31.11%（表2），但0.1"mg/L"2，4-D與0.2"mg/L"2，4-D誘導(dǎo)效果無顯著差異；水蜜桃在CIM3（MSD+"0.3"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"Kinetin）上形成顆粒狀聚集胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率最高可以達(dá)到22.78%；三亞陽光在CIM5（0.5"mg/L"2，4-D+"0.5"mg/L"Kinetin）培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)效果最佳，平均誘導(dǎo)率高達(dá)50%，CIM3-5中的平均誘導(dǎo)率均高于30%。以上結(jié)果表明，2，4-D濃度范圍在0.1～"0.5"mg/L間均有利于秋石斛胚性愈傷組織誘導(dǎo)。

2.3""不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)秋石斛胚性愈傷增殖的影響

為進(jìn)一步增殖并優(yōu)化胚性愈傷的狀態(tài)，將誘導(dǎo)30"d左右的胚性愈傷轉(zhuǎn)入P1、P2、P3、P4增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖研究。胚性愈傷在4種培養(yǎng)基

中繼代1周時(shí)并無明顯生長(zhǎng)變化，2周后胚性愈傷開始出現(xiàn)增殖變大，3周后一些胚性愈傷表

面出現(xiàn)芽點(diǎn)，同時(shí)愈傷顏色變得更為嫩黃。以三亞陽光為例，胚性愈傷在P4（MSD+0.5"mg/L"IBA+"0.5"mg/L"KT）中繼代獲得的胚性愈傷（ECs）顏

色嫩黃、形態(tài)致密，該狀態(tài)為胚性愈傷組織較佳狀態(tài)；在P1（MSD+0.1"mg/L"2，4-D+0.5"mg/L"KT）中出芽率較高，并伴隨出現(xiàn)胚性愈傷褐化現(xiàn)象（圖3）。從胚性愈傷形態(tài)上觀察，IBA與KT生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)秋石斛胚性愈傷的增殖效果雖然一般，但基本能夠保持愈傷不分化。

由表3可知，4種培養(yǎng)基中的胚性愈傷增殖倍數(shù)因品種不同有所差異，但整體增殖倍數(shù)均不超過1。水蜜桃胚性愈傷在P4培養(yǎng)基中增殖倍數(shù)顯著高于P1、P2，可見IBA與KT的組合優(yōu)于2，4-D與KT；三亞陽光胚性愈傷在4種培養(yǎng)基上的增殖效果差異不顯著，但P4培養(yǎng)基中胚性愈傷的增殖倍數(shù)依舊最高。水蜜桃愈傷在P4培養(yǎng)基中增殖倍數(shù)顯著高于P1、P2，可見IBA與KT的組合較優(yōu)于2，4-D與KT。從胚性愈傷不定芽分化情況觀察，3個(gè)品種中，IBA與KT植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合不定芽分化率均顯著低于2，4-D與KT的組合。結(jié)果說明生長(zhǎng)素IBA（吲哚丁酸）和細(xì)胞分裂素Kinetin組合有利于秋石斛胚性愈傷的增殖與保持。

2.4""植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)胚性愈傷分化不定芽的影響

研究表明培養(yǎng)基1/2"MS+2.0"mg/L"6-BA+"1.0"mg/L"NAA最有利于秋石斛頂芽和腋芽誘導(dǎo)原球莖，MS+3.0"mg/L"6-BA+1.0"mg/L"NAA適合于原球莖增殖[5]。在此基礎(chǔ)上，本研究將以上2種培養(yǎng)基進(jìn)行融合改良，以1/2"MS為基本培養(yǎng)基，添加1"g/L花寶1號(hào)，采用3.0"mg/L"6-BA與1.0"mg/L"NAA的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合。在進(jìn)行胚性愈傷增殖過程中發(fā)現(xiàn)，0.5"mg/L"IBA與0.15"mg/L"KT的組合，在光照條件下，分化狀態(tài)更佳。因此嘗試應(yīng)用IBA和KT生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合進(jìn)行胚性愈傷分化研究，將嫩黃、致密且狀態(tài)一致的胚性愈傷分別接種到F1和F2培養(yǎng)基上，16"h/d光周期條件下比較胚性愈傷分化情況，結(jié)果顯示胚性愈傷在F1和F2培養(yǎng)基中均可分化出不定芽（圖4），60"d后即可分化獲得形態(tài)完整、翠綠且生根的小苗。胚性愈傷在分化成不定芽的過程中，會(huì)先轉(zhuǎn)變成類原球莖，然后迅速發(fā)展成不定芽，促進(jìn)更多芽點(diǎn)的產(chǎn)生形成叢生芽。由表4可知，3種秋石斛

胚性愈傷在F2培養(yǎng)基上的不定芽再生率均高于F1，平均每團(tuán)愈傷出苗數(shù)多1株，但2種培養(yǎng)基的分化效果無顯著差異。

2.5""植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)組培苗生根的影響

生長(zhǎng)素NAA和細(xì)胞分裂素KT對(duì)3種秋石斛不定芽生根的影響進(jìn)行了研究。30"d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用NAA或NAA與KT組合使用均能使不定芽生根（表5，圖5），平均每株生根數(shù)在5根左右，根長(zhǎng)約1.3"cm，2種生根培養(yǎng)基生根效果無顯著差異。由此可見，是否添加KT不是影響秋石斛生根的主要因素，而采用0.5"mg/L"NAA作為生根培養(yǎng)基較為合適。

2.6""秋石斛胚性愈傷再生途徑的構(gòu)建

從迷你品種可以看出，將果莢消毒后接種于苗培養(yǎng)基（圖6A），待原球莖和幼苗形成后，手術(shù)刀處理原球莖或去除幼苗葉片與根部取幼莖為外植體（圖6B），放入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30"d后誘導(dǎo)獲得嫩黃、致密胚性愈傷組織（圖6C）；然后將胚性愈傷切下，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)進(jìn)行增殖，1～2個(gè)月后即可獲得嫩黃、質(zhì)地均一的胚性愈傷組織（圖6D）；將胚性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基1個(gè)月后分化獲得幼胚（圖6E）；繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月后獲得幼苗，或轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（苗培養(yǎng)基）30"d后獲得生長(zhǎng)狀態(tài)良好胚性愈傷再生植株（圖6F）。因此，建立了一套較為高效的秋石斛胚性愈傷誘導(dǎo)及植株再生方法。

3""討論

3.1""基因型及外植體的選擇是決定胚性愈傷誘導(dǎo)的主要因素

秋石斛胚性愈傷再生體系構(gòu)建需要綜合評(píng)價(jià)不同品種基因型、外植體類型和外植體生長(zhǎng)階段，篩選出最適宜的品種作為實(shí)驗(yàn)品系。本研究最初選取了5個(gè)品種進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)，其中原生種Dendrobium"bigibbum胚性愈傷誘導(dǎo)耗時(shí)長(zhǎng)，誘導(dǎo)率低；粉紅女孩雜交種自交結(jié)實(shí)率雖高，但胚性愈傷誘導(dǎo)率低，僅在CIM3培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)少量胚性愈傷。因此，這2個(gè)品種都不適合作為遺傳轉(zhuǎn)化研究材料。相比之下，三亞陽光雜交種胚性愈傷誘導(dǎo)、分化效果都非常好，但由于該品種自交不親和性，轉(zhuǎn)基因性狀無法通過有性繁殖遺傳到下一代；迷你、水蜜桃2個(gè)品種則最佳，不僅自交親和，且易于與其他品種雜交，該結(jié)果有利于后續(xù)轉(zhuǎn)基因研究中獲得純合株系并將外源基因滲入到其它品系。本研究采用生長(zhǎng)2個(gè)月的原球莖為外植體，該外植體更為幼嫩，脫分化效果佳，更適合用于胚性愈傷誘導(dǎo)，應(yīng)用該外植體顯著提高了胚性愈傷的誘導(dǎo)效率。

3.2""不同植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的組合使用有利于胚性愈傷誘導(dǎo)及植株再生

生長(zhǎng)素2，4-D常作為不同外植體體胚發(fā)生的主要誘導(dǎo)劑[13-17]，植物內(nèi)源生長(zhǎng)素IBA的分布對(duì)體細(xì)胞發(fā)生至關(guān)重要[18]。本研究胚性愈傷誘導(dǎo)、增殖、體胚分化及再生均為不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合使用。胚性愈傷誘導(dǎo)時(shí)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的最佳配比是0.1～0.5"mg/L"2，4-D組合0.5"mg/L"KT；2，4-D是誘導(dǎo)出胚性愈傷的關(guān)鍵因素，這一結(jié)論與金青等[19]誘導(dǎo)霍山石斛愈傷組織相似。胚性愈傷增殖繼代時(shí)采用0.5"mg/L"IBA組合0.5"mg/L"KT具有較好的增殖與保持效果，所獲得的胚性愈傷嫩黃、致密，生長(zhǎng)狀態(tài)均一；在分化出芽時(shí)將細(xì)胞分裂素KT"0.15"mg/L與IBA"0.5"mg/L組合，可以較好的分化獲得不定芽；最后利用0.5"mg/L"NAA實(shí)現(xiàn)秋石斛快速生根。不同階段使用不同生長(zhǎng)素，也能促進(jìn)胚性愈傷誘導(dǎo)及胚發(fā)生途徑植株再生[20]。

3.3""秋石斛類原球莖與胚性愈傷之間容易相互轉(zhuǎn)變

理論上，植物任何一部分均可以再生成完整植株，本研究中選用了不同外植體進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下，莖段誘導(dǎo)胚性效果最佳，且愈幼嫩的莖段對(duì)2，4-D及KT愈敏感。分化過程中，胚性愈傷逐漸轉(zhuǎn)化為類原球莖[21]，從而形成大量不定芽。因此，在秋石斛中類原球莖與胚性愈傷相互之間是一個(gè)極易轉(zhuǎn)變的過程，這是蘭科植物中普遍存在的現(xiàn)象[22]。研究過程中還發(fā)現(xiàn)3種秋石斛胚性愈傷增殖效果一般，容易形成類原球莖，可能是抑制胚性愈傷增殖的主要原因，這一現(xiàn)象與大花蕙蘭黃金小神童胚性愈傷誘導(dǎo)過程相似[23]。

目前，關(guān)于石斛蘭胚性愈傷誘導(dǎo)及再生的研究已有許多報(bào)道[13-14，"17，"24-25]，但秋石斛胚性愈傷途徑再生的研究幾乎未見報(bào)道。常見的石斛蘭遺傳轉(zhuǎn)化通常以胚性愈傷或原球莖作為外植體[12]。相比原球莖，胚性愈傷作為轉(zhuǎn)基因外植體則無需經(jīng)過脫分化，可直接將外源基因轉(zhuǎn)入干細(xì)胞分化為轉(zhuǎn)基因幼胚，再生形成完整植株，該轉(zhuǎn)化途徑能有效避免轉(zhuǎn)基因嵌合體植株產(chǎn)生，是較理想的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。因此，本研究建立的秋石斛胚性愈傷再生體系將有利于后續(xù)秋石斛轉(zhuǎn)基因分子育種研究。

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