【摘要】目的：建立肝素鈉總己糖胺中半乳糖胺含量的檢測(cè)方法。方法：將標(biāo)準(zhǔn)品及供試品在100℃下水解6 h，使用戴安ICS5000型離子色譜儀，以14 mm氫氧化鈉溶液為淋洗液在0.5 mL/min流速下，經(jīng)戴安氨基酸捕集柱（50 mm×4 mm）、PA20型色譜柱（150 mm×3 mm）分離，進(jìn)入配備Au工作電極、pH-Ag-AgCl參比電極的安培檢測(cè)器中進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：經(jīng)不低于6 h水解，供試品充分水解，空白溶液無(wú)干擾峰，水解標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中，理論板數(shù)、分離度、拖尾因子等均符合USP〈831〉的規(guī)定，半乳糖胺的檢測(cè)限和定量限分別達(dá)到2 ng/mL、4 ng/mL，半乳糖胺在4～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，平均加樣回收率達(dá)到101.2%，RSD為2.64%，水解標(biāo)準(zhǔn)溶液和水解供試品溶液放置24 h，檢測(cè)結(jié)果的RSD為1.53%。結(jié)論：方法專(zhuān)屬性、系統(tǒng)適用性、線性、靈敏度、回收率良好，適用于肝素鈉總己糖胺中半乳糖胺含量的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】肝素鈉；離子色譜；半乳糖胺

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.04.005

Determination of Galactosamine in Total Hexosamine of Heparin Sodium by Ion Chromatography

MI Wenqiang1，3， REN Fengzhi1，3， LIU Jianfen2，3*， ZHANG Xiangbin2，3， WANG Caixiao2，3， LI Lele2，3

（1.North China Pharmaceutical Group Corporation New Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shijiazhuang 052165， China； 2. North China Pharmaceutical Huakun Hebei Biotechnology Co.， Ltd.， Shijiazhuang 050000， China； 3.Hebei Multi-component Biochemical Drug Preparation Technology Innovation Center， Shijiazhuang 050000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of galactosamine content in heparin sodium total hexosamine. Methods： The standard and test samples are hydrolyzed at 100°C for 6 hours， and then analyzed by Dionex ICS5000 ion chromatograph， using 14 mm sodium hydroxide solution as eluent at a flow rate of 0.5 mL/min， passing through Dionex amino acid trap column （50 mm×4 mm） and PA20 column （150 mm×3 mm）， and entering the amperometric detector equipped with Au working electrode and pH-Ag-AgCl reference electrode. Results：After hydrolysis for no less than 6 hours， the test samples are fully hydrolyzed， and there is no interference peak in the blank solution. In the chromatogram of the hydrolyzed standard solution， the theoretical plate number， separation degree， tailing factor， etc. all met the requirements of USP<831>. The detection limit and quantitation limit of galactosamine were 2 ng/mL and 4 ng/mL， respectively. Galactosamine had good linearity in the concentration range of 4～160 ng/mL， the average recovery rate was 101.2%， and the RSD was 2.64%. The RSD of the test results of the hydrolyzed standard solution and the hydrolyzed test sample solution placed for 24 hours is 1.53%. Conclusion：The method has good specificity， system suitability， linearity， sensitivity， and recovery rate， and is suitable for the determination of galactosamine content in heparin sodium total hexosamine.

Keywords： heparin； HPIC； galactosamine

肝素在臨床上廣泛用于腎臟透析、心臟外科手術(shù)、預(yù)防或治療血栓栓塞性疾病，以及血液透析和體外血液循環(huán)過(guò)程中的抗凝血[1-2]。肝素是一種提取自動(dòng)物組織的抗凝血藥物，屬于糖胺聚糖家族的一員，由不同硫酸化多糖鏈的異質(zhì)混合物組成，主要的工藝相關(guān)雜質(zhì)如硫酸皮膚素和硫酸軟骨素均含有半乳糖胺的糖胺聚糖[3]。研究表明，半乳糖胺可通過(guò)消耗肝細(xì)胞中的磷酸尿嘧啶，造成蛋白合成紊亂，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，引發(fā)肝纖維化、急性肝損傷，甚至肝衰竭[4-7]。美國(guó)藥典規(guī)定了半乳糖胺的限度，而中國(guó)藥典對(duì)其尚無(wú)要求。

1材料與方法

1.1材料

儀器設(shè)備：戴安ICS 5000離子色譜儀，脈沖安培檢測(cè)器，XA105型電子分析天平（瑞士Mettler公司），RephiLe G超純水機(jī)（上海樂(lè)楓公司）。

試劑：鹽酸半乳糖胺對(duì)照品（含量0.998 mg/mg，批號(hào)：G1L378，USP）；鹽酸葡萄糖胺對(duì)照品（含量0.997 mg/mg，批號(hào)：R104K1，USP）；肝素鈉原料藥（批號(hào)：220701，自產(chǎn)）；氫氧化鈉溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，批號(hào)：SS254-1，美國(guó)Thermo Fisher公司）；鹽酸（批號(hào)：20220427，北京化工廠）；超純水（超純水機(jī)制備）。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法

1）色譜條件。色譜柱：AminoTrap氨基酸捕集柱（50 mm×4 mm，10μm），CarboPac PA20分析柱（50 mm×3 mm，6μm）；柱溫：30℃；淋洗液：氫氧化鈉溶液（14 mmol/L）；Au工作電極；pH-Ag-AgCl參比電極；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10μL；標(biāo)準(zhǔn)糖四電位波形，見(jiàn)表1。

2）溶液配制。水解標(biāo)準(zhǔn)溶液：含半乳糖胺對(duì)照品、葡萄糖胺對(duì)照品分別為8μg/mL、0.8 mg/mL的鹽酸（5 mol/L）溶液，100℃下保溫6 h，用超純水稀釋100倍即得；供試品溶液：2.4 mg/mL肝素鈉鹽酸（5 mol/L）溶液，100℃下保溫6 h，用超純水稀釋100倍即得。

1.2.2研究方法

1）水解時(shí)長(zhǎng)：從水解反應(yīng)0 h起至水解反應(yīng)11 h止，每隔1 h取水解標(biāo)準(zhǔn)溶液、水解供試品溶液采集色譜圖，記錄半乳糖胺、葡萄糖胺峰面積，比較檢測(cè)結(jié)果隨時(shí)間的變化。

2）專(zhuān)屬性：分別取水、鹽酸（5 mol/L）、半乳糖胺對(duì)照品、葡萄糖胺對(duì)照品、供試品，按水解供試品溶液配制方法配制溶液。確定各色譜峰位置。

3）系統(tǒng)適用性：重復(fù)6次采集水解標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察半乳糖胺與葡萄糖胺的峰分離度、拖尾因子及以葡萄糖胺計(jì)算的理論塔板數(shù)。

4）靈敏度：規(guī)定分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為半乳糖胺的檢出限、定量限。

5）線性與范圍：配制系列水解標(biāo)準(zhǔn)溶液，使半乳糖胺濃度為4 ng/mL、8 ng/mL、16 ng/mL、64 ng/mL、120 ng/mL、160 ng/ mL，對(duì)應(yīng)葡萄糖胺濃度為0.39 ng/mL、0.78 ng/mL、1.56 ng/ mL、6.24 ng/mL、11.7 ng/mL、15.6 ng/mL，分別擬合半乳糖胺-濃度、葡萄糖胺峰面積-濃度方程，計(jì)算線性回歸系數(shù)。

6）精密度：平行配制水解標(biāo)準(zhǔn)溶液、水解供試品溶液各6份，檢測(cè)半乳糖胺限度；變更實(shí)驗(yàn)人員，重復(fù)測(cè)定，計(jì)算半乳糖胺限度的RSD。

7）準(zhǔn)確度：向供試品中加入80%、100%、120%的半乳糖胺，每比例平行配制3份，測(cè)定每份供試品中氨基己糖的半乳糖胺占比，計(jì)算回收率及RSD。

8）溶液穩(wěn)定性：配制水解標(biāo)準(zhǔn)溶液和水解供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD。

9）供試品測(cè)定：取肝素鈉供試品3批（220701，220702，220703）進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

1）水解時(shí)長(zhǎng)：不同水解時(shí)長(zhǎng)GalNR的RSD=3.97%；半乳糖胺占總己糖胺比例的測(cè)得值從1 h起逐步下降，在6 h時(shí)趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖1?？偧禾前分邪肴樘前繁壤腞SD（6～11 h）=3.19%，表明經(jīng)過(guò)6 h后，供試品充分水解。

2）專(zhuān)屬性：專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖見(jiàn)圖2。空白溶液不產(chǎn)生干擾峰，半乳糖胺峰與葡萄糖胺峰分離良好。

3）系統(tǒng)適用性：柱效均大于3500，分離度不小于2.6，拖尾因子在1.00～1.14之間。方法系統(tǒng)適用性良好。

4）靈敏度：當(dāng)半乳糖胺濃度為2 ng/mL時(shí)，S/N≥3.0；當(dāng)半乳糖胺濃度為4 ng/mL時(shí)，S/N≥13.2。因此，檢測(cè)限為2 ng/ mL，定量限確定為4 ng/mL。

5）線性與范圍：在檢查范圍內(nèi)，半乳糖胺線性方程為y = 0.0049x - 0.00006，相關(guān)系數(shù)：0.9997；葡萄糖胺線性方程為y = 2.7356x - 1.6124，相關(guān)系數(shù)：0.9994。方法線性良好。

6）精密度：精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。方法精密度良好。

7）準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。方法準(zhǔn)確度良好。

8）溶液穩(wěn)定性：5組水解標(biāo)準(zhǔn)溶液和水解供試品溶液的測(cè)定結(jié)果RSD為1.53%，溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

9）樣品測(cè)定：3批肝素鈉樣品檢測(cè)結(jié)果分別為：0.08%、0.09%、0.09%，均小于1%的限度規(guī)定。

3結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)研究水解時(shí)間，增強(qiáng)了樣品前處理及檢測(cè)過(guò)程的可控性，使肝素中半乳糖胺占總氨基己糖之比的測(cè)定方法研究更為完善，經(jīng)測(cè)試自研樣品，結(jié)果符合規(guī)定，本檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠。

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【作者簡(jiǎn)介】

米文強(qiáng)，男，1987年出生，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬铩?/p>

通信作者：劉建芬，女，1976年出生，執(zhí)業(yè)藥師，學(xué)士，研究方向?yàn)獒t(yī)藥工程，119797212@qq.com。

（編輯：侯睿琪）