王歆遠(yuǎn)，劉 燕，布日額

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

牛乳質(zhì)量檢測與人類健康及疾病防控有著密切的關(guān)系，為了讓民眾喝上“安全奶”“放心奶”，乳品企業(yè)及衛(wèi)生部門要對乳品的新鮮度、營養(yǎng)成分、致病菌污染情況進(jìn)行全面檢測。感官檢測適合對乳品的新鮮度和被接受度進(jìn)行初步判斷，后續(xù)可以通過對其理化指標(biāo)的檢測來分析乳品營養(yǎng)成分的含量是否存在異常，以及通過微生物檢測手段來判斷乳源是否被致病菌感染[1]。

1 感官指標(biāo)檢測

感官評定是牛乳質(zhì)量評估最簡單的方式，是將乳品通過評價者的視覺、嗅覺和味覺來對乳品的色、香、味、質(zhì)地等指標(biāo)作出評判并進(jìn)行分析和解釋[2]。主要通過看、聞、嘗3 個步驟進(jìn)行感官指標(biāo)檢測[3]，可以直觀地反映出牛乳的新鮮程度和是否變質(zhì)。

（1） 看。品質(zhì)正常的牛乳顏色呈乳白色或微黃色，牛乳中不應(yīng)出現(xiàn)沉淀物或絮狀物，不應(yīng)有凝塊產(chǎn)生[4]，通過觀察乳品的顏色、流體狀態(tài)可以判斷出乳品是否變質(zhì)。

（2） 聞。由于牛乳中脂肪酸的揮發(fā)，牛乳聞起來會有一種濃郁的奶香氣。如果牛乳中有令人不悅的異味產(chǎn)生，說明其中的脂肪酸發(fā)生氧化，產(chǎn)生過氧化物，則認(rèn)為牛乳發(fā)生了酸敗現(xiàn)象。

（3） 嘗。牛乳中乳糖的存在會讓人喝起來有淡淡的甜味，牛乳中脂類物質(zhì)可以使牛乳有順滑、濃郁的感覺。如果品嘗出酸或苦等異味，則說明牛乳已經(jīng)變質(zhì)。

2 牛乳理化指標(biāo)檢測

理化檢驗(yàn)技術(shù)是牛乳質(zhì)量檢測最常使用的技術(shù)手段。理化指標(biāo)檢測通過分析乳品的物理特性或化學(xué)成分，能夠得到其中各項(xiàng)營養(yǎng)成分的含量及實(shí)時變化情況，具有準(zhǔn)確性高、說服力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[5]。理化指標(biāo)檢測可以實(shí)現(xiàn)對牛乳新鮮度的檢測，以及其中某一項(xiàng)營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪含量的檢測和牛乳中多種營養(yǎng)指標(biāo)共同檢測。

2.1 酸度測定

通過酸度的測定可評判出牛乳的新鮮程度。當(dāng)牛乳在貯存和運(yùn)輸?shù)沫h(huán)節(jié)中受到微生物污染時，其中含有的營養(yǎng)物質(zhì)會被分解，牛乳中的乳糖會分解成乳酸，引起酸度的增高，稱為牛乳的酸敗現(xiàn)象[6]。酸度測定的方法是利用酚酞溶液作為指示劑，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.100 0 mol/L） 來滴定，計算滴定結(jié)束時所用氫氧化鈉溶液的體積。

2.2 相對密度、比重測定

通過對牛乳的相對密度和比重的測定，可以反映出牛乳是否存在衛(wèi)生問題。牛乳的相對密度和比重是通過密度乳稠計和比重乳稠計來測定的，當(dāng)溫度為20 ℃時，單位體積牛乳的質(zhì)量與溫度在4 ℃時單位體積水的質(zhì)量之比則稱為牛乳的相對密度，為1.028～1.032。當(dāng)溫度在15 ℃時，單位體積牛乳質(zhì)量與單位體積水的質(zhì)量之比稱為牛乳的比重，為1.030～1.034[1]。如果牛乳的相對密度或比重值不在正常范圍內(nèi)，則可以推測為牛乳中的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)發(fā)生改變，誘發(fā)牛乳變質(zhì)或者存在不良商家對牛乳摻水作假的嫌疑。

2.3 蛋白質(zhì)檢測方法

蛋白質(zhì)是牛乳中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，通常情況下牛乳的蛋白質(zhì)含量越多，代表著牛乳品質(zhì)越好[7]，在牛乳的生產(chǎn)貯存過程中，蛋白質(zhì)含量的變化情況也可以反映出牛乳質(zhì)量的變化，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量降低時則可能牛乳發(fā)生變質(zhì)[8]?，F(xiàn)階段，主要通過凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)法和紫外分光光度法來檢測牛乳中的蛋白質(zhì)含量[9]。凱氏定氮法是目前應(yīng)用最廣泛的一種檢測方法，該方法發(fā)展完善，有著成熟的檢測體系和極高的準(zhǔn)確度，不足之處是凱氏定氮法的試驗(yàn)周期相對較長，對試驗(yàn)環(huán)境要求較高。將經(jīng)典的凱氏定氮法改良后，通過模塊式消化來進(jìn)行試驗(yàn)，是將牛乳進(jìn)行微波消解技術(shù)處理后再測定蛋白質(zhì)含量，這種改良方案提高了試驗(yàn)分析效率，減少了試劑用量，且對環(huán)境較為友好[10]。紫外分光光度法也在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用于牛乳蛋白質(zhì)含量的測定，其利用牛乳中的蛋白質(zhì)與紫外光的吸收程度存在著線性關(guān)系，通過測定樣品的吸光度可以測定出蛋白質(zhì)在乳品中的含量[11]。

2.4 乳脂檢測方法

如果新鮮牛乳發(fā)生變質(zhì)，則乳品總脂肪的含量會呈下降趨勢[12]。在乳脂檢測方法中，羅茲- 哥特里法被廣泛應(yīng)用，該方法有著技術(shù)成熟、發(fā)展完善、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是試驗(yàn)操作時間長且復(fù)雜，易產(chǎn)生污染[13]。相對于傳統(tǒng)方法，伊尼霍夫堿法來檢測牛乳中的脂肪含量可以實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)周期大幅縮短、操作更為簡便等優(yōu)點(diǎn)，也被逐漸推廣[14]。除以上2 種方法外，對牛乳中脂肪含量的檢測還會使用核磁共振定量氫譜技術(shù)、巴勃科克氏法、蓋勃氏法等[15]。

2.5 乳糖檢測方法

乳糖含量在牛乳儲存周期中的變化規(guī)律與牛乳變質(zhì)不存在特定性的關(guān)系[8]。但在乳品質(zhì)量檢測時也應(yīng)作為必不可少的一項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)。乳糖可以長時間滯留在人的腸道內(nèi)，需要自身產(chǎn)生的乳糖酶分解，乳糖酶缺乏的人群會產(chǎn)生乳糖不耐受癥，消費(fèi)者可以從此項(xiàng)指標(biāo)對牛乳進(jìn)行甄別。對于牛乳中乳糖含量的測定，目前普遍采用蒽酮比色法和萊茵- 埃農(nóng)氏法[16]。

2.6 低場核磁共振技術(shù)

低場核磁共振（NMR） 是一種對乳品質(zhì)量檢測的新興技術(shù)手段，適用于對牛乳的多項(xiàng)營養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行檢測，原理是通過牛乳在恒定磁場強(qiáng)度小于0.5 T 時所產(chǎn)生的核磁共振現(xiàn)象對其營養(yǎng)成分進(jìn)行分析。低場核磁共振技術(shù)一般用來檢測乳制品中蛋白質(zhì)和脂肪的含量、水分子的遷移率及乳制品的保水能力等理化指標(biāo)。在測定牛乳中蛋白質(zhì)含量時，該方法有著極高的準(zhǔn)確度，現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于乳蛋白的快速檢測[17]。利用雙高斯公式擬合低場核磁共振測定得到的乳脂肪液相信號，也可以得出乳品中脂類物質(zhì)的含量評判牛乳的品質(zhì)[18]。

2.7 近紅外光譜分析法

近紅外光譜分析法（NIR） 是近年來新興的綠色檢測技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對乳品中的脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖三大營養(yǎng)成分的共同檢測分析。在現(xiàn)階段牛乳質(zhì)量檢測技術(shù)中具有十足的發(fā)展?jié)摿19]。其原理是通過乳品中不同營養(yǎng)物質(zhì)的含氫基團(tuán)對不同頻率的紅外光進(jìn)行選擇性吸收來進(jìn)行不同營養(yǎng)物質(zhì)的動態(tài)監(jiān)測。運(yùn)用近紅外光譜系統(tǒng)在線監(jiān)控乳品中脂類含量的變化的技術(shù)已經(jīng)被廣泛使用[20]。也可以將近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合偏最小二乘方法分析后形成的光譜數(shù)據(jù)信息，能夠構(gòu)建出牛乳中脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖含量之間的校正模型[21]，該模型可以分析出3 類營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化趨勢。另外，近紅外分析技術(shù)還可以對牛乳中的體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測[22]，當(dāng)牛乳的體細(xì)胞過高時可能會引起風(fēng)味欠佳、品質(zhì)下降，乳品被污染等。

3 牛乳微生物指標(biāo)檢測

由于奶源致病菌防控關(guān)系到公共衛(wèi)生安全，近年來各項(xiàng)技術(shù)速發(fā)展，檢測技術(shù)可分為常規(guī)細(xì)菌鑒定技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)、基因檢測技術(shù)和全基因組測序技術(shù)[23]。對一些致病菌的檢出結(jié)果和檢出率，各國衛(wèi)生部門都已做出了明確規(guī)定。大部分國家的法規(guī)中，乳制品不得檢測出彎曲桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及產(chǎn)氣夾膜梭菌，對于乳品中存在少量的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌，衛(wèi)生部門對其檢出率也有著明確的限量標(biāo)準(zhǔn)[24-25]。

3.1 常規(guī)細(xì)菌鑒定技術(shù)

常規(guī)細(xì)菌鑒定技術(shù)是檢測細(xì)菌最基本的技術(shù)，其包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌落特征觀察、顯微鏡下觀察及生化試驗(yàn)等。該方法優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，其不足是耗時、費(fèi)力，至少48 h 才能獲得結(jié)果，不適合對乳品的快速檢測[23]。

3.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫檢測的基本原理就是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后會產(chǎn)生免疫現(xiàn)象。在牛乳制品的免疫學(xué)檢測中，可以利用牛乳中含有的已知抗原來檢測未知的抗體，也可使用制備好的抗體來檢測未知的抗原。對使用的抗原或抗體進(jìn)行檢測都可以確認(rèn)乳品是否被致病菌感染[26-27]。免疫學(xué)檢測技術(shù)在乳品中的應(yīng)用主要有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、免疫磁性分離技術(shù)、酶聯(lián)熒光免疫吸附技術(shù)（VIDAS） 等[28]。

3.2.1 血清學(xué)反應(yīng)

血清學(xué)反應(yīng)是最常規(guī)的免疫學(xué)技術(shù)，反應(yīng)中所用抗體是血清，主要包括凝集試驗(yàn)和沉淀試驗(yàn)等。血清學(xué)反應(yīng)可以檢測出引起牛乳腺炎疾病的主要幾種致病菌菌株[29]。凝集試驗(yàn)使用的抗原為顆粒性抗原，與抗體結(jié)合后會出現(xiàn)顆粒性凝集現(xiàn)象，主要用于布魯氏桿菌和沙門氏菌等的檢驗(yàn)。沉淀試驗(yàn)使用的抗原是可溶性抗原，抗原與抗體結(jié)合后會產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，在牛乳源致病菌檢測中應(yīng)用較少。

血清學(xué)反應(yīng)的優(yōu)勢是其操作簡便，可以直觀觀察到試驗(yàn)結(jié)果；其不足之處是試驗(yàn)人為影響因素較多而導(dǎo)致靈敏度較低，因此不適合進(jìn)行大批量檢測和現(xiàn)場快檢。

3.2.2 抗體標(biāo)記技術(shù)

抗體標(biāo)記技術(shù)是將標(biāo)記物與抗體分子共價結(jié)合后和所檢測的致病菌特異性結(jié)合，形成抗原抗體結(jié)合物，再利用熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀及發(fā)光免疫檢測儀對其進(jìn)行定性和定量。

（1） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。目前，應(yīng)用最為廣泛的方法是間接ELISA。ELISA 法通過底物呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)來達(dá)到檢測目的，對于同種動物多種不同病原的檢測只需要標(biāo)記一種二抗，該方法適合批量檢測。對牛乳中的沙門氏菌和黃曲霉素M1的定量檢測有著極高的靈敏度[30]。全自動酶標(biāo)檢測儀和全自動洗板機(jī)在應(yīng)用中的廣泛普及，ELISA 操作的標(biāo)準(zhǔn)化程度明顯提升[31]，該方法主要應(yīng)用于我國內(nèi)蒙古地區(qū)對奶牛乳腺炎的致病菌檢測。

（2） 膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)。膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)是一種新興的標(biāo)記抗體快速檢測技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)所利用的抗體為單克隆抗體，其具有高特異性，試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測的靈敏度也得到保障，該方法的最大優(yōu)勢是操作簡便，可以在10 min 內(nèi)獲得試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果易觀察判別等，因而得到廣泛應(yīng)用。在檢測時，不依賴試驗(yàn)環(huán)境和試驗(yàn)設(shè)備，使用組裝好的成品試劑盒就可以隨時在牧場中現(xiàn)場應(yīng)用，對操作人員的專業(yè)性要求較低，適合于基層檢測站和養(yǎng)牛戶使用。我國相關(guān)研究機(jī)構(gòu)已研發(fā)出“快速檢測牛乳源無乳鏈球菌的膠體金免疫層析試劑盒”“快速檢測牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析”“快速檢測牛乳中牛結(jié)核分枝桿菌感染早期標(biāo)識物的膠體金免疫層析試劑盒”等保障牛乳源安全的快檢產(chǎn)品[32-33]。

3.3 基因檢測技術(shù)

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 技術(shù)

乳樣中含有多種類的微生物，通過對細(xì)菌的特異性研究進(jìn)行相應(yīng)的PCR 試驗(yàn)，可檢測出不同菌株，PCR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用改變了在傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)中面對細(xì)菌多樣性一直存在著試驗(yàn)準(zhǔn)確度不高的問題。因?yàn)镻CR 技術(shù)對單一細(xì)菌檢測的高特異性，該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中得到普遍認(rèn)可[34]，我國《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》中，明確要求對于乳制品中的阪崎腸桿菌的含量測定要采用PCR 技術(shù)手段來進(jìn)行，目前普遍應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測[35]。對于其他不同致病菌，在檢測方法和檢出率上也各不相同。對于牛乳中志賀氏菌的檢測，最優(yōu)方案是采用快速常規(guī)PCR 與實(shí)時定量PCR 相結(jié)合的方法[36]。乳品中的蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌也可以通過采用過濾富集菌體后PCR 技術(shù)來檢測出[37-38]。

通過PCR 技術(shù)，也可反映出乳品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及體細(xì)胞總數(shù)的動態(tài)變化。對于牛乳中的金黃色葡萄球菌可以通過免疫磁球捕獲- 實(shí)時熒光PCR 法來檢測，利用該技術(shù)可以快速檢測出其含量，該方法的檢測下限為104CFU/mL[39]。后通過對16S rRNA的V3 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并結(jié)合實(shí)時PCR，能夠?qū)崿F(xiàn)對牛乳中的總細(xì)菌數(shù)和特定細(xì)菌的種類進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控[40]?？傮w來說，PCR 檢測方法最大的優(yōu)勢就是特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高且試驗(yàn)操作較為簡便，有很高的實(shí)用價值和推廣價值[41]。

3.3.2 全基因組測序技術(shù)

通過對細(xì)菌全基因組DNA 測序、拼接、組裝，可獲取全部的基因組信息[42]，從而實(shí)現(xiàn)了功能基因注釋及個性化分析。對分離菌株的基因功能研究、致病機(jī)制及免疫機(jī)制研究該技術(shù)的發(fā)展有著重要意義，對各地區(qū)不同情況的乳源安全問題可開展針對性研究，通過細(xì)菌生態(tài)學(xué)獲取的信息，可深入掌握所在地區(qū)致病菌種的獨(dú)立強(qiáng)弱及優(yōu)勢基因，提出相應(yīng)的應(yīng)對防控措施。

4 發(fā)展牛乳質(zhì)量檢測技術(shù)對乳品安全和公共衛(wèi)生的意義

在我國的內(nèi)蒙古地區(qū)，乳品質(zhì)量檢測技術(shù)的不斷發(fā)展對當(dāng)?shù)啬膛I(yè)健康發(fā)展、保障乳品安全起到了巨大作用。有關(guān)科研機(jī)構(gòu)調(diào)查結(jié)果表明，內(nèi)蒙古地區(qū)牛乳安全問題主要由奶牛患有乳房炎流行病引起，其中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌和大腸埃希菌是使奶牛感染乳房炎的主要致病菌[43]。對于以上致病菌的檢測，利用生物學(xué)技術(shù)使致病菌抗原基因特異性表達(dá)，結(jié)合間接ELISA 方法可準(zhǔn)確地在病源乳中篩查出無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌[44]。在基層牛乳檢測應(yīng)用中，現(xiàn)階段研發(fā)出的快速檢測牛乳源致病菌的膠體金免疫層析試劑盒有著極高的準(zhǔn)確度[45]。內(nèi)蒙古地區(qū)的乳源檢測技術(shù)不斷發(fā)展，使我國乳品質(zhì)量安全得到保障。

德國有著嚴(yán)格的乳品檢測制度，每個州都會設(shè)立一個獨(dú)立的第三方檢測機(jī)構(gòu)來負(fù)責(zé)該州的乳品質(zhì)量檢測工作，檢測站會定期對牧場收到的奶源進(jìn)行批量檢驗(yàn)，進(jìn)行定級，對該牧場乳源的安全等級進(jìn)行評定[46]。其工作內(nèi)容主要是對牛乳的各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，對牛奶的脂肪、蛋白質(zhì)含量和菌群數(shù)量等都進(jìn)行詳細(xì)的分析和監(jiān)控。檢測站得出的最終數(shù)據(jù)被法律認(rèn)可，具有權(quán)威性，乳品加工廠會憑借該數(shù)據(jù)選擇性地向奶農(nóng)收購奶源。這樣在源頭上很大程度避免了乳品質(zhì)量的安全隱患。

新西蘭的乳品產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位，現(xiàn)階段該國主流的檢測手段是利用光譜儀對牛奶進(jìn)行檢測分析，牛乳樣本被光譜儀射出的光掃過后，牛奶的不同成分會吸收不同波長的光，就可直觀地得到牛乳樣本的光譜信息[47]，然后由檢測人員分析牛奶的成分是否存在著營養(yǎng)素的缺失、致病微生物的產(chǎn)生及質(zhì)量變化的發(fā)生等。該檢測方式一般都是在新西蘭全境的牧場中進(jìn)行抽樣檢測，既可在同一標(biāo)準(zhǔn)下評估乳品質(zhì)量水平，又可有效減少檢測時間和成本。

由于檢測方法眾多，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)充分結(jié)合實(shí)際情況，選擇最適宜的檢測方法。傳統(tǒng)檢測方法不斷改良研究并且與新興技術(shù)結(jié)合，充分利用多元信息，將多種檢測手段聯(lián)合應(yīng)用，開發(fā)出快速準(zhǔn)確綠色的檢測技術(shù)來有效保障牛乳制品的安全將是未來研究的一個趨勢。牛乳品質(zhì)檢測技術(shù)的研究發(fā)展既促進(jìn)了我國乳品行業(yè)的蓬勃發(fā)展，又為公共衛(wèi)生安全提供了絕對保障。